Содержание к диссертации
Введение
1. Инновационные технологии в лечении и профилактике сахарного диабета 14
1.1. Новые направления поиска препаратов для лечения сахарного диабета
II типа 15
1.1.1. Лекарственные средства современной фармакотерапии сахарного диабета 15
1.1.2. Новые направления в созданиииантидиабетическихсредств 19
1.1.3. Инкретиномиметические подходы к созданию антидиабетических средств 24
1.2. Экстракты гимнемы лесной - как источник инкретиномиметических веществ 33
1.2.1. Биологические компоненты гимнемы лесной 33
1.2.2. Основные механизмы влияния гимнемы лесной на гомеостаз глюкозы.. 36
2. Изучение антидиабетических свойств экстракта гимнемы лесной 43
2.1. Гипогликемические и антидиабетические свойства экстрактов гимнемылесной 44 г
2.1.1. Материалы и методы 44
2.1.2. Гипогликемическое действие экстрактов гимнемылесной 47
2.1.3. Антидиабетическое действие экстрактов гимнемы лесной 50
2.1.4. Заключение 56
2.2. Исследование механгома ашидиабетического действиягимнемы-25 57
2.2.1. Штериалы и методы 59
2.2.2. Влияние гимнемы-25 на секрецию инсулина 61
2.2.3. Действие гимнемы-25 на пролиферацию в-клеток поджелудочной железы крыс 62
2.2.4. Действие гимнемы-25 на утилизацию глюкозы мышечной тканью 66
2.2.5. Влияние гимнемы-25 на транспорт глюкозы и олеиновой кислоты в кишечнике 68
2.2.6. Заключение 72
2.3. Острая токсичность гимнемы-25 74
2.4. Фармакологические свойства гимнемы-25, необходимые для гірофилактики отдаленных последствий сахарного диабета 75
2.4.1. Материалы и методы 75
2.4.2. Антиоксидантные свойства гимнемы-25 80
2.4.3. Реологические свойства гимнемы-25 82
2.4.4. Влияние гимнемы-25 на тромбогенный потенциал крови. 84
2.4.5. Заключение 85
2.5. Оптимизация фармакологических свойств гимнемы-25 (обоснование создания лекарственной композиции) 87
2.5.1. Материалы и методы 91
2.5.2. Влияние экстрактов девясила, гребней винограда на антиоксидантную активность гимнемы-25 93
2.5.3. Действие экстрактов девясила, гребней винограда на гемореологические свойства гимнемы-25 99
2.5.4. Заключение 103
2.6. Обоснование создания биологически активной добавки на основе композиции 105
3. Антидиабетические свойства композиции на основе гимнемы-25 110
3.1. Гжюгликемическая активность композиции 111
3.1.1. Материалы и методы 111 '["
3.1.2. Гипогликемические свойства композиции. 111
3.1.3. Эффективность композиции при курсовом применении 114
3.1.4. Влияние композиции на секрецию инсулина 115
3.1.5. Заключение 117
3.2. Изучение гипогликемической активности композиции у животных с нарушенной толерантностью к глюкозе 118
3.2.1. Материалы и методы 120
3.2.2. Влияние кошозиции на толерантность к углеводам у крыс с экспериментальной моделью ожирения 121
3.2.3. Действие композиции на уровень глюкозы в крови крыс с экспериментальным синдромом инсулинорезистентности. 125
3.2.4. Эффективность композиции при пероральном применении на уровень глюкозы в крови крыс с экспериментальной латентной формой стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета 129
3.2.5. Заключение 132
3.3. Антидиабетическаяактивность композиции на экспериментальных моделях сахарного диабета 134
3.3.1. Материалы и методы 134
3.3.2. Исследование эффективности композиции у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом. 136
3.3.3. Длительность гипогликемической активности композиции у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом. 137
3.3.4. Действие композиции на течение аллоксан-индуцированного сахарного диабета 140
3.3.5. Эффективность композиции при иммунозабисимой форме сахарного диабета 142
3.3.6. Заключение 146
3.4. Исследование механизмов гипогликемическои и антидиабетической активности композиции 148
3.4.1. Материалы и методы 149
3.4.2. Определение гипогликемическои активности композиции на животных с панкреатэктомией 151
3.4.3. Влияние композиции на эффекты экзогенного введенного инсулина у животных с панкреатэктомией. 152
3.4.4. Исследование воздействия композиции на утилизацию углеводов периферическими тканями. 153
3.4.5. Влияние композиции на всасывание глюкозы и жирных кислот в кишечнике интактныхкрыс 154
3.4.6. Влияние композиции на всасывание мальтозы в кишечнике 156
3.4.7. Действие композиции на апоптоз и регенерацию в-эндокриноцитов 157
3.4.8. Заключение 167
3.5. Антиоксидантньш, гемореологические и антиатерогенные свойства композиции 169
5.5.7. Материалы и методы 170
3.5.2. Действие композиции на реологические свойства крови 171
3.5.3. Антиагрегантные свойства композиции 175
3.5.4. Влияние композиции на процессы свободно-радикального окисления. 178
3.5.5. Действие композиции на липидный спектр белков плазмы крови 180
3.5.6. Заключение 181
3.6. Изучение острой токсичности композиции 182
3.7. Заключение 185
4. Биологически активная добавка к пище «диабета» 188
4.1. Изучение гипогликемическои активности биологически активной добавки на интактных животных 189
4.1.1. Материалы и методы 189
4.1.2. Влияние бад на содержание сахара в крови при пероральномприменении у крыс 190
4.1.3. Воздействие бад на толерантность к сахарной нагрузке у крыс. 192
4.1.4. Заключение 193
4.2. Изучение гипогликемическои активности биологически активной добавки у крыс с нарушенной толерантностью к глюкозе 194
4.2.1. Материалы и методы 195
4.2.2. Изучение гипогликемической активности бад у крыс с экспериментальным ожирением. 196
4.2.3. Влияние бад при пероральном применении на уровень глюкозы в крови крыс с экспериментальным синдромом инсулинрезистентности. 198
4.2.4. Изучение влияния бад на уровень глюкозы в крови крыс с экспериментальной латентной формой сахарного диабета 199
4.2.5. Заключение 201
4.3. Изучение гипогликемической активности биологически активной добавки на животных с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом 202
4.3.1. Материалы и методы 202
4.3.2. Изучение гипогликемических свойств бад при пероральном применении 'у крыс с сахарным диабетом. 202
4.3.3. Воздействие бад на толерантность к сахарной нагрузке у крыс с сахарным диабетом 203
4.3.4. Заключение 204
4.4. Изучение фармакологических свойств биологически активной добавки 205
4.4.1. Материалы и методы 206
4.4.2. Влияние бад на массу тела животных с алиментарным ожирением 207
4.4.3. Воздействие бад на поглощение глюкозы мышечной тканью крыс 208
4.4.4. Влияние бадна всасывание глюкозы и жирных кислот в кишечнике интактных крыс 209
4.4.5. Заключение 211
4.5. Влияние биологически активной добавки на уровень магния в эритроцитах кровиживотных на фоне алиментарной гипомагнеземии 212
4.5.1. Материалы и методы 212
4.5.2. Результаты исследования 212
4.5.3. Заключение 213
4.6. Влияние биологически активной добавки на процессы перекисного окисления липидов 214
4.6.1. Материалы и методы 214
4.6.2. Антиоксидантная активность бад (исследование in vitro) 215
4.6.3. Влияниебадна перекисное окисление в крови и органах.крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом. 218
4.6.4. Заключение 220
4.7. Исследование влияния биологически активной добавки на реологические и антиагрегантные свойства крови 221
4.7.1. Материалы и методы 221
4.7.2. Гемореологическая активность бадна экспериментальной модели синдрома повышенной вязкости крови (исследование in vitro) 223
4.7.3. Гемореологическая активность бад у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом. 225
4.7.4. Антиагрегантные свойства бад. 229
4.7.5. Заключение 230
4.8. Острая токсичность биологически активной добавки 231
4.9. Результаты клинических исследований биологически активной добавки 233
4.9.1. Материалы и методы 233
4.9.2. Результаты исследования. 235
4.9.3. Заключение 238
4.10. Заключение 239
5. Изучение токсикологических свойств композиции на основе гимнемы лесной 242
5.1. Хроническая токсичность композиции в опытах на крысах 242
5.2. Хроническая токсичность композиции в опытах на собаках 247
5.3. Изучение гонадотоксичности и эмбриотоксичности 254
5.4. Ощнкааллергизирующих свойств композиции 263
5.5. Ощнкаиммунотоксичности композиции 267
5.6. Оценка мутагенной активности композиции 271
5.7. Заключение 275
Обсуждение 277
Выводы: 309
Список литературы . 312
- Экстракты гимнемы лесной - как источник инкретиномиметических веществ
- Фармакологические свойства гимнемы-25, необходимые для гірофилактики отдаленных последствий сахарного диабета
- Изучение гипогликемической активности композиции у животных с нарушенной толерантностью к глюкозе
- Изучение гипогликемическои активности биологически активной добавки у крыс с нарушенной толерантностью к глюкозе
Введение к работе
Актуальность темы. Сахарный диабет (СД) зарегистрирован более чем у 150 млн. человек в мире (И.И. Дедов, 2008; А.С. Аметов, 2008). При этом прогнозируется удвоение числа заболевших СД каждые 12-15 лет. Из этого числа 90-95% - больные инсулиннезависимым СД в возрасте 35-49 лет. Фактическая распространенность СД в 3-4 раза превосходит регистрируемую, что свидетельствует о пандемии СД среди взрослого населения (И.И. Балаболкин, 2008). Достаточно большой объем знаний в области патофизиологии диабета и наличие широкого спектра терапевтических возможностей лечения не привели к улучшению метаболического контроля заболевания от стадии глюкозотолерантности до развернутой клиники СД (И.И. Дедов, Г.А. Мельниченко, 2006). Лечение усложняется, тем, что гипергликемия сочетается с ожирением, артериальной гипертензией, дислипидемией, гиперкоагуляцией и окислительным стрессом. Так как длительно протекающая декомпенсация усугубляет инсулинорезистентность и способствует развитию вторичной резистентности к пероральным сахароснижающим средствам, составляющим основную фармакотерапевтическую группу для лечения СД II типа, потребность в новых эффективных и безопасных сахароснижаю-щих лекарственных средствах очевидна (И.И. Балаболкин, 2005). В связи с этим идет интенсивный поиск как синтетических, так и растительных секре-тогенов, влияющих на физиологические механизмы высвобождения инсулина (М.Б. Анциферов, 2007).
В исследованиях последних лет убедительно доказано, что снижение уровня инсулина в ответ на естественный стимулятор (углеводы) может обусловливаться нарушением выделения некоторых интестинальных гормонов (GIP и GLP-1), оказывающих глюкозостимулирующее влияние на синтез инсулина (J. Hou et al, 2007; T.R. Vahi et al, 2007). Поскольку большая часть этих гормонов инактивируется еще в кишечнике, не достигая системного кровотока, то экзогенное применение инкретинов представляется технически
сложным (S.C. Мс Donagh, 2007). Поэтому используются ингибиторы расщепляющих инкретины энзимов, либо вещества, проявляющие прямое или косвенное инкретиномиметическое действие (К.А. Scott, 2007). В то же время гипогликемическую активность растительного экстракта Гимнемы лесной (ветвистой лианы из семейства ластовневых) связывают с увеличением ин-кретиномиметичекого действия, повышением секреторной активности и восстановлением морфологической структуры р-эндокриноцитов, подавлением глюконеогенеза (Т. Fushiki, 1992; Gymnema Lawrence Rev. 1993). Исходя из этого различные экстракты Гимнемы лесной могут являться основой для создания антидиабетических лекарственных и нелекарственных препаратов.
Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения». Тема утверждена на заседании Ученого Совета ВолГМУ (протокол № 1 от 10 февраля 2006 г.) и включена в план НИР.
Целью настоящего исследования является экспериментальное обоснование создания на основе экстракта Гимнемы лесной, проявляющего инкретиномиметическое действие, антидиабетических препаратов.
Для достижения указанной цели представляется необходимым решение следующих задач:
изучение метаболических (гипогликемических, антиоксидантных, гемореологических) и антидиабетических свойств экстрактов Гимнемы лесной в зависимости от дозы и степени очистки;
исследование антиоксидантных и гемореологических свойств оптимизированной экстрактами девясила и гребней винограда Гимнемы-25 -наиболее активной фракции Гимнемы лесной;
углубленное доклиническое изучение антидиабетической Композиции на основе Гимнемы лесной с целью обоснования перспективы создания нового лекарственного препарата;
исследование панкреотропных механизмов антидиабетического действия Композиции;
изучение механизма экстрапанкреатических эффектов препарата;
исследование влияния препарата на процессы регенерации и апоп-тоза инсулинпродуцирующих клеток;
исследование фармакологических свойств биологически активной добавки к пище на основе Гимнемы лесной;
изучение токсикологических свойств Композиции и биологически активной добавки, созданных на основе Гимнемы лесной.
Научная новизна.
Впервые проведено комплексное исследование влияния различных экстрактов Гимнемы лесной на функциональную активность и регенерацию эндокринных клеток поджелудочной железы, а также изучены механизмы секреции инсулина при экспериментальном сахарном диабете различной этиологии.
Впервые изучено влияние Гимнемы-25 на реологические свойства и тромбогенный потенциал крови. Впервые проведен анализ уровня гипогли-кемической активности различных экстрактов Гимнемы лесной в зависимости от их дозы и степени очистки.
Выполнены доклинические исследования фармакодинамических свойств лекарственной Композиции на основе Гимнемы-25, проявившей выраженные антидиабетические свойства. Обоснована возможность создания антидиабетического препарата с инкретиномиметическим и экстрапанкреатическим механизмом действия.
Впервые проведена оценка пролиферативной активности р-эндокриноцитов при применении лекарственной Композиции и выявлена степень её антиапоптогенной активности.
Впервые изучены гипогликемические свойства биологически активной добавки к пище на основе Гимнемы-25 при моделировании метаболических
расстройств (синдрома преддиабет), а также изучены её антиоксидантные свойства и влияние на реологические свойства крови.
Научно-практическая значимость
Результаты изучения уровня гипогликемической активности различных экстрактов Гимнемы лесной на интактных животных и на животных с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом позволили выявить наиболее активную фракцию Гимнемы лесной - Гимнема - 25, содержащую гимнемовые кислоты.
Результаты доклинических исследований позволили обосновать создание Композиции на основе Гимнемы-25 в виде лекарственного препарата (с добавлением экстрактов гребней винограда и девясила) с антиоксидантными и гемореологическими свойствами для применения в комплексной сахарос-нижающей терапии СДII типа и профилактики его отдаленных последствий.
Результаты доклинических исследований позволили обосновать создание БАД на основе Композиции (с введением микронутриенов необходимых для стабилизации углеводного обмена: ванадия сульфата, цинка сульфата, хрома пиколината, магния сульфата, пиридоксина гидрохлорида), проявляющей антиоксидантные и гемореологические свойства для профилактики развития метаболических расстройств и поздних осложнений СД. На основании результатов клинических исследований БАД можно полагать об её эффективности при использовании в составе комплексной терапии у больных СД II типа.
Изучены показатели острой, хронической и специфических видов токсичности.
Реализация результатов исследования
Система методических подходов к изучению и анализу антидиабетической активности экстрактов растений применяется при проведении исследований в лабораторий экспериментальной фармакологии ВНЦ РАМН и АВО, НИИ фармакологии ВолГМУ и кафедры фармакологии ВолГМУ. Биологиче-
ски активная добавка к пище «Диабета» выпускается ООО «Экко Плюс» (Россия).
Результаты работы включены в лекционные курсы на кафедрах фармакологии ВолГМУ, фармакогнозии и ботаники ВолГМУ, фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, на кафедрах фармакологии Кубанского, Саратовского и Ростовского государственных медицинских университетов.
Основные положения, выносимые на защиту
Экстракты Гимнемы лесной - перспективные вещества для создания противодиабетических препаратов, сочетающих гипогликемическую активность с антиоксидантными и гемореологическими свойствами.
Антидиабетическое действие Композиции на основе Гимнемы-25 (с добавлением экстрактов гребней винограда и цветков девясила) связано с её сахароснижающим действием при экспериментальном стрептозотоцин, ал-локсан-индуцированном, иммунозависимой форме СД, при латентной форме СД, инсулинорезистентности.
Композиция тормозит развитие апоптоза и способствует регенерации Р-эндокриноцитов при токсическом воздействии цитотоксинов на ткань поджелудочной железы.
Композиция на основе Гимнемы-25 нетоксична, оказывает комплексное антидиабетическое, антиоксидантное, гемореологическое действие.
БАД на основе Композиции оказывает гипогликемическое действие при экспериментальном метаболическом синдроме (преддиабет) и ожирении за счет глюкозостимулированного влияния на секрецию инсулина и потенцирования его действия, улучшения утилизации глюкозы периферическими тканями, снижения всасывания глюкозы и жирных кислот в кишечнике.
БАД в составе комплексной сахар оснижающей терапии способствует улучшению состояния углеводного и липидного обменов, снижению ин-сулиновой резистентности и повышению активности антиоксидантной системы у больных СД II типа.
Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались в материалах: научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции», Волгоград, 2005; 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», «Подмосковье», 2006; XI Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммуно-реабилитации, Москва, 2006; XII и XIV Российских национальных конгрессов «Человек и лекарство», Москва, 2006, 2007, 2008; I Международного съезда фитотерапевтов «Современные проблемы фитотерапии», Москва, 2006; II Всероссийской конференции с международным участием «Клинико-морфологические аспекты эндокринопатий», Москва, 2006; V международного научно-практического конгресса «Человек в экстремальных условиях: Здоровье, надежность и реабилитации», Москва, 2006; 'The next line of defense' International conference on diabetes. Synergy and strategy, Анталия, Турция, 2007; III Съезде Фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007; II Международной научной конференции "Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений", Алматы, Казахстан, 2007; Международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения», Гродно, Беларусь, 2007; 63-й конференции по фармации, Пятигорская фармацевтическая академия, Пятигорск 2008; IV Всероссийском конгрессе диабетологов, Москва, 2008; симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» Москва, 2008; VII международной конференции «Гемореология и микроциркуляция. От функциональных механизмов в клинику», Ярославль, 2009.
Публикации По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 339 страницах машинописного текста, иллюстрирована 61 таблицей, 97 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы II-V), обсуждения результатов (глава VI), выводов и приложения. Список литературы включает 117 отечественных и 166 иностранных источников.
Экстракты гимнемы лесной - как источник инкретиномиметических веществ
Гимнема лесная - вьющееся растение со стеблями до 8 м в длине из семейства Asclepiadaceae. Синонимы: Periploca sylvestris Willd., Gymnema melicida Edgew., Asclepias gemnfta Roxb. Листья растения 3-6x2-3 см, простые, супротивные, эллиптической или овальной формы более или менее опушены с обеих сторон. Цветки мелкие желтовато-зеленые. Плоды парные веретенообразные листовки до 7,5 см длиной. Растет в открытом лесу на высоте 100-1000 м в Индии, Китае, Индонезии, Японии, Малайзии, Шри-Ланке, Вьетнаме и Южной Африке. Гимнема лесная (ГЛ) использовалась в Китае и Индии на протяжении 2000 лет для контроля регуляции количества сахара при диабете (S J. Persaud., 1999; J.K. Grover, 2002; R.K. Satdive, 2006). Фармакологические свойства ГЛ обусловлены группой более чем из 20 тритерпеновых сапонинов (ТС), известных как гимнемовые кислоты (ГК), которые являются пентациклическими, реже тетрациклическими соединениями, и имеют обобщенную формулу С3оН48. Листья ГЛ содержат 4-10% сапонинов, включая ГК (I-XVII1) и гимнемосапонины (I-V). Некоторые исследователи считают, что именно ГК (V-VII) обладают антидиабетической активностью (М. A. Feanny, 2007; L. Hong, 2001). ГК включают собственно ГК (I-VII), гимнемозиды (A-F) и гимнемосапонины (N. Murakami, 1996). Основа всех ГК - гимнемогенин (Зр, 16(3, 21 р, 22(3, 23, 28-гексаагидроксиолеан-12-ен) (рис. 1.4). ГК I, И, III и IV - компоненты, выделенные из листьев ГЛ, способны подавлять ощущение сладкого вкуса. Они все содержат остаток глю-куроновой кислоты и агликон - гимнемогенин эстерифицированный в положении 21 и 28 (табл. 1.3). В структурах второго ряда ГК (V-VII) и (VIII-IX) эстерифицированные сапонины, имеют оксигликозидный остаток, присоединяющийся к глюкуроновой кислоте, их структуры определены как 3-O-P-D арабино-2-гексулопиранозил гимнемовых кислот III и IV (Kerry Bone, 2002; Е. Porchezhian, 2003). В лаборатории S. Yoshioka (S. Yoshioka, J. Yonago, 1986) из листьев ГЛ были выделены семь новых ТС, агликоны которых имеют строение тетра-циклического тритерпена (производные дамморана), и названных гипенози-ды (I-VII). Группой авторов (N. Murakami, Т. Murakami, М. Kadoya, et al., 1996) помимо известных гимнемовых кислот, из листьев ГЛ было выделено четыре новых тритерпеновых сапонина: гимнемасины А, В, С и D. Агликоном у данных веществ является гимнеманол - 3(3,16(3, 22а, 23,28-пентагидроксиолеан-12-ен.
Некоторые из ГК содержат ацильную группу, в то время как гимнемо-сапонины - неацитилированные Из выделенной общей фракции сапонинов удалось изолировать отдельные сапонины и произвести расшифровку их структуры (табл. 1.4), интерпретируя результаты с помощью ЯМР (G. Y. Yeh, 2003). В состав углеводной части тритерпеновых сапонинов входят обычно встречающиеся в растениях моносахариды: D-глюкоза, D-галактоза, D-ксилоза, D-глюконовая и D-галактуроновая кислоты, а - арабиноза, а-рамноза и а-фукоза. В углеводной цепи находится от 1 до 10 различных моносахаридов, отличающихся и местом присоединения и способом связывания (L. Shane, Mc.Whorter, 2003; N. Murakami, 1996). Физико-химические свойства ТС изменяются в широких пределах. Это большей частью аморфные вещества без характерной температуры плавления (обычно с разложением). В кристаллическом виде получены лишь отдельные представители, которые имели в своем составе не более четырёх моносахаридных остатков, с увеличением числа моносахаридов повышается растворимость сапонинов в воде и других полярных растворителях. Сапонины с 1-4 моносахаридными остатками в воде растворяются плохо. ТС могут быть нейтральными и кислыми соединениями. Кислотный характер обусловливается наличием карбоксильных групп, находящихся как в молекуле сапогенина, так и в уроновых кислотах, если последние входят в состав углеводной части сапонина. Сильные кислоты расщепляют гликозидные связи у всех сапонинов. Сапонины, имеющие о-ацетилгликозидные связи, неустойчивы к действию щелочей. Кислые сапонины образуют соли, растворимые с одновалентными и нерастворимые с двухвалентными и многовалентными металлами. Многие сапонины образуют молекулярные комплексы с белками, липидами, стеринами, танинами. Основное свойство ТС заключается в гемолизе эритроцитов, однако при пероральном введении сапонины теряют способность вызывать гемолиз (G. Y. Yeh, 2003). Проведенный анализ литературы позволяет предположить, что фармакологические эффекты при применении экстракта ГЛ реализуются с помощью следующих механизмов: модуляция активности инкретинов; стимуляция секреции и высвобождения инсулина; регенерация (З-эндокриноцитов островков Лангерганса; активация ферментов, ответственных за утилизацию глюкозы; снижение всасывания глюкозы и жирных кислот в тонком кишечнике; влияние на восприятие сладкого вкуса (J.J. Mier, 2001; Hou J, 2007; E.R. Shanmugasundaram, 1990). Известно, что в ответ на поступление пищи в кишечник вырабатываются гормоны, регулирующие её инкреторную функцию, т.е. образование и секрецию гормонов островками поджелудочной железы.
Данными свойствами обладает GLP-1 и GIP (SL Aronoff, 2004; М.А. Feanny, 2007; Gymnema. Review, 2003). В экспериментальных исследованиях изучалось высвобождение GIP в портальную вену в ответ на дуоденальное введение D-глюкозы в присутствии экстракта ГЛ, обогащенного гимнемовыми кислотами (DJ. Joffe, 2001). D-глюкоза дозозависимо увеличивала концентрацию портального им-мунореактивного GIP, что и позволило предположить, что взаимодействие рецептора глюкозы с экстрактом листьев ГЛ повышает высвобождение GIP (T.R. Vahi, 2007). В настоящее время механизм гипогликемического действия ГЛ связывают с повышением высвобождения инсулина из инсулинпродуцирующих клеток (Y. Ogawa, 2004). Суть этого процесса, очевидно, сводится к деполяризации мембраны, активации вольтажзависимых Са2+"каналов, повышению уровня внутриклеточного кальция, который участвует в , процессах транслокации секреторной гранулы к плазматической мембране и индуцирует экзоцитоз. Установлено, что при этом повышается чувствительность р-клеток к глюкозе и аминокислотам, стимулирующим продукцию инсулина (М.И. Балаболкин, 2005). При микроскопическом исследовании в группе животных, получавших экстракт ГЛ, ядра Р-эндокриноцитов статистически значимо были увеличены в размерах, в 1,4 раза во всех отделах железы, при одинаковых объемной доле и площади панкреатических островков у животных изучаемых групп. Полученные результаты исследования вполне согласуются с материалами исследования, в котором авторы предложили, что применение ГЛ увеличивало уровень инсулина, возможно, за счет регенерации р-клеток поджелудочной железы (R.R. Chattopadhyay.1998). Значит, есть вероятность того, что гипертрофия р-эндокриноцитов происходит за счет влияния ГЛ на повышение секреции GIP (N. Murakami, 1996). Использование экстракта ГЛ в лечении аллоксанового диабета у крыс способствует значительному увеличению продолжительности жизни животных. В экспериментах на кроликах с аллоксановым диабетом после примене
Фармакологические свойства гимнемы-25, необходимые для гірофилактики отдаленных последствий сахарного диабета
Экспериментальные исследования проводились на 230 белых беспородных крысах массой 300-320 г согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351000.3-96 и 51000.4-96). В работе использовали Гимнему-25 (см. 2.1.2), танакан (Франция) тиобарбитуровую кислоту (ТБК) {ICN Biomedicals, США), фосфорную кислоту {Реахим, Россия), люминол (Serva, Германия), сульфат железа (ЧДА, Украина), аскорбиновую кислоту {Chemapol, Чехия), 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) {Sigma, США), стрептозотоцин (Sigma, США), цитрат натрия (ЧДА, Реахим, Россия), фильтры SMWPO с диаметром пор 5 мкм (Millipore, Франция). В качестве индукторов активации и агрегации тромбо цитов использовались динатриевая соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) («Реанал», Венгрия), адреналина гидрохлорид ("Sigma", США), коллаген ("Sigma", США). В исследовании использовались стандартные наборы: «Тромбо-тест», «Техпластин-тест», «Фибриноген-тест», «АПТВ (АЧТВ)-тест» («Технология-стандарт», Россия), «Глюкоза ФКД» (Россия). Исследование ашпгюксидантных свойств Ггшнемы-25 было выполнено на крысах с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным СД ( 2.1.1). В ходе работы было сформировано 4 группы: 1) интактные животные; 2) животные с диабетом; 3) крысы с СД, получавшие Гимнему-25 в дозе 280 мг/кг; 4) животные с СД, получавшие препарат сравнения танакан в дозе 12 мг/кг. Все изучаемые препараты вводились перорально в течение 21 дня, последнее введение препаратов проводилось за 120 мин до забора биологического материала для исследования.
При изучении аскорбат-зависгшого ПОЛ реакцию окисления липидов гомогената печени крыс инициировали 50 мМ аскорбиновой кислотой, и скорость ПОЛ оценивали по накоплению ТБК-активных продуктов, определяемых при А,=532 нм на спектрофотометре (СФ-46, Россия) в 10 мм кювете. В эритроцитах и плазме крови крыс определяли уровень продуктов ПОЛ — коньюгированных диенов (КД) и малонового диальдегида (МДА), а также активность супероксиддисмутазы (СОД). Начальные продукты ПОЛ - конъюгированные диены (КД) определяли в липидном экстракте, получаемом с помощью гептан-изопропиловой смеси (1:1) (ЧДА, Россия). КД определяли по интенсивности поглощения в области 232 нм после высаливания воды (В.А. Костюк и др., 1984) в гептановой фазе экстракта. Уровень ДК выражали в отн. Ед. Малоновый диалъдегид (МДА) определяли в плазме крови и в эритроцитах в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (ICN Biomedicals, США). Для повышения специфичности реакции хромогенный продукт экстрагировали н-бутиловым спиртом (В.Б. Гаврилов и др., 1987). Гемолизаты эритроцитов свободных от гемоглобина, получали по методу А.В. Арутюняна (2000). Колометрирование проводили при 532 нм в кюветах с длиной оптического пути 10,0 мм на спектрофотометре СФ-46 (Ломо, Россия). Концентрацию МДА вычисляли по коэффициенту молярной экстинк-ции К=1,56 х 105 М"1 см"1 для оптического показателя Е535-580 и выражали в нмоль/мл плазмы или эритроцитов. Активность супероксиддисмутазы (СОД). Электронные спектры поглощения регистрировались на спектрофотометре СФ-46 (Ломо, Россия) при 406 нм в кюветах 10,0 мм на 0 и 10 минуте после инициирования реакции.
Активность СОД рассчитывалась в единицах, исходя из того, что 1 ед СОД ингибирует реакцию на 50% (С. Beauchamp, I. Fridovich, 1971). Изучение реологических свойств Гимнемы-25 проводилось на животных с СД ( 2.1.1). Исследуемые препараты вводились внутрижелудочно, в течение 21 дня в дозах: Гимнема-25 - 280 мг/кг, танакан - 12 мг/кг. Забор крови осуществлялся из брюшной аорты крыс через 120 минут после последнего введения препаратов. В ходе работы определялась вязкость крови на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия) методом ротационной вискозиметрии со свободно плавающим цилиндром-ротором (Н.А. Добровольский, 1989), при этом показатель вязкости крови является производным от скорости вращения ротора в исследуемом образце крови при различных скоростях сдвига (от 300 до 3 с" ). Влияние веществ на агрегацию эритроцитов оценивали по индексу агрегации, рассчитываемому как отношение вязкости крови при скорости сдвига 3 с"1 к вязкости крови при 100 с"1 (L. Dintenfass, 1989). Величину гематокрита определяли центрифугированием капилляров с образцами крови на микрогемоцентрифуге МГЦ-8 (8000 об/мин, 3 минуты) как отношение протяженности в центрифужном капилляре столбика эритроцитов к столбику плазмы. Индекс эффективности доставки кислорода в ткани рассчитывался как отношение гематокрита исследуемого образца к вязкости крови при высоких скоростях сдвига (300 с"1) (J. Stoltz et al., 1991; В.В. Якусевич, А.В. Муравьев, 1998). Уменьшение индекса трактовалось как снижение эффективности доставки кислорода к тканям (J. Brim, 1995).
Динамические характеристики эритроцитов оценивали визкозиметри-ческим методом (вязкость взвеси измеряли на ротационном вискозиметре АКР-2 (Россия) при скоростях сдвига 300, 30, 3 с"1). С помощью фильтрационного теста регистрировалась средняя скорость фильтрации эритроцитар-ной взвеси (мл/мин) через фильтр Millipore (0 5 мкм), при поддержании отрицательного давления 15 см в. ст. Влияние веществ на агрегацию тромбоцитов исследовали на двухка-нальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA) НПФ "Биола" (г. Москва) по методу G. Born (1962) в модификации З.А. Габбасова (1989). Регистровали степень изменений светопропускания плазмы, богатой тромбоцитами, при добавлении к последней веществ, индуцирующих агрегацию, в условиях постоянного перемешивания, а также при анализе флюктуации светопропускания, вызванных случайным изменением числа частиц в оптическом канале (В.А. Люсов, Ю.Б. Белоусов, 1971). В качестве индуктора использовали АДФ (фирмы «Reanal», Венгрия) в конечной концентрации 5 мкМ. При графической регистрации процесса агрегации кровяных пластинок получали кривые, отражающие падение оптической плотности обогащенной тромбоцитами плазмы. Интенсивность агрегации оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы. Величина кислотного гемолиза эритроцитов оценивалась по методу И.А. Терского и И.И. Гительзона (1967): фотометрически регистрировали снижение оптической плотности эритроцитов, вследствие их гемолиза. Этот принцип был технически реализован на лазерном анализаторе агрегации «Биола», что позволило оценить кинетику и динамику процесса. В качестве стандартного индуктора гемолиза использовалась 0,01н соляная кислота.
Изучение гипогликемической активности композиции у животных с нарушенной толерантностью к глюкозе
Добавление Композиции перед прогреванием образцов крови значимо препятствовало развитию патологических сдвигов вязкостных характеристик крови (табл. 2.14). Так, следует отметить достоверное влияние на изменение значений вязкости крови при высоких скоростях сдвига в концентрации Композиции, соответствующей концентрации 280 мг/л. Для выяснения роли составляющих компонентов в общем эффекте Композиции производилось изучение их влияния на вязкость крови в отдельности, в дозировках, соответствующих исходной прописи препарата. При исследовании Гимнемы-25 удалось выявить более выраженные эффекты на вязкость крови при высоких скоростях сдвига, при этом не отмечалось зависимости активности препарата от дозы. Экстракт девясила не проявил значимого уровня активности на этой моделе исследования. Для экстракта гребней винограда были установлены достоверные эффекты во всем диапазоне изучаемых концентраций. Танакан уступает Композиции по величине эффекта, при этом следует отметить отсутствие достоверных отличий с контрольной группой. Наибольший эффект наблюдается у антиоксидантного препарата - мексидол, который достоверно снижал вязкость крови при данных скоростях сдвига на 16,8%. Также достоверный эффект оказывает диабетон, при этом уровень его активности не превышает таковой Композиции. Таким образом, Композиция при экспериментальном синдроме повышенной вязкости крови значительно превосходит по величине эффекта препарат сравнения Танакан, проявляет одинаковую активность в сравнении с диабетоном и уступает только мексидолу. Кроме того, установлено, что эффекты проявляются преимущественно за счет Гимнемы-25 и, в меньшей степени - за счет экстракта гребней Винограда. Также значимые гемореологические эффекты выявлены у Композиции при изучении влияния на вязкость крови при низких скоростях сдвига.
Так отличия являются достоверными при скорости сдвига 10 и 3 с" по отноше нию к прогретому контролю во всем диапазоне изучаемых концентраций. Полученные данные свидетельствуют о профилактическом влиянии Композиции на изменения агрегационых свойств красных клеток крови при гипертермии. Это предположение подтверждается данными, полученными при изучении ИАЭ. Так, Композиция оказывает достоверное профилактическое влияние на развитие гиперагрегации во всем диапазоне изученных концентраций, при этом выраженность гемореологических свойств напрямую зависит от концентрации препарата. При исследовании Гимнемы-25 удалось также выявить выраженные эффекты на вязкость крови при низких скоростях сдвига, несколько уступавшие Композиции, при этом также отмечалась четкая зависимость активности препарата от его дозы. Экстракт девясила не проявил значимого уровня активности на агрегацию эритроцитов. Для экстракта гребней Винограда были установлены достоверные эффекты во всем диапазоне изучаемых концентраций, несколько уступавших Композиции, при этом также отмечалась четкая зависимость активности препарата от его дозы. Выявленные закономерности определяют аддитивный характер эффекта Композиции на агрегацию эритроцитов, получаемый посредством сложения практически равных активностей Гимнемы-25 и экстракта гребней Винограда.
Препарат сравнения танакан проявил сходный с Композицией уровень активности в концентрации 40 мкг/л и при двукратном разведении. В дозе 4 мкг/мл он уступал эффектам Композиции, при этом отличия показателей вязкости крови и индекса агрегации эритроцитов не имели достоверного характера. Синтетические препараты сравнения диабетон и мексидол превосходили Композицию по величине антиагрегантной активности в отношении эритроцитов, однако отличия в величинах эффекта не были достоверны. Таким образом, Композиция в концентрациях, соответствующих терапевтическим дозировкам, препятствует развитию гемореологических нару
Изучение гипогликемическои активности биологически активной добавки у крыс с нарушенной толерантностью к глюкозе
Учитывая то, что Гимнема-25, оказывая слабую антиоксидантную активность, предотвращает увеличение ПОЛ преимущественно в эритроцитах, проявляет умеренное влияние на реологические свойства крови на следующем этапе работы представилось перспективным произвести её оптимизацию компонентами биофлавоноидной структуры, обладающими гемореологиче-скими и антиоксидантными свойствами. Проанализировав имеющиеся литературные данные и информацию за-регистрированых баз данных ксенобиотиков (отчет СКС «Альянс», 2005), в состав Композиции были добавлены такие отечественные источники био-флавоноидов, как экстракты гребней винограда (антиоксидант) и экстракт девясила высокого. Выбор экстракта девясила высокого был обусловлен тем, что в настоящее время недостаточно средств, с помощью которых возможно произвести направленную блокаду клеток, принимающих участие в механизмах деструкции (3 - клеток, приводящих к развитию СД, его профилактике и устранению сопутствующих осложнений. Сухой экстракт девясила обладает особой направленностью на лечение именно иммунозависимой формы диабета (Т. Kobayashi et al., 2002). На долю этой формы заболевания приходится 10-15% всех случаев заболевания, и от которой страдают, в основном, лица в возрасте до 25 лет (К.П. Зак, 2001).
В корневищах и корнях девясила содержится эфирное (аллантовое) масло (1-3%), состоящее из смеси сескви-терпеновых лактонов: изо- дигидроалантолактона, проазулена и др. (B.R. Goldin, S.L. Gorbach, 1980). Помимо этого, в корнях обнаружены до 44% инулина, псевдоинулина, инуленина, смолы, дубильные вещества, b - сито-стерин, тритерпеновые сапонины, полиеновые кислоты, коричная, миристи-новая, пальмитиновая, уксусная и бензойная кислоты (Е. Vanurikhina 1997; В.В Aggarwal, 2004). Экспериментально установлено, что механизм действия экстракта девясила связан с усилением продукции регуляторних цитокинов при аутоиммунном диабете. У мышей со стрептозотоциновым диабетом снижается уровень у-интерферона и соответственно повреждающее его действие на клетки поджелудочной железы, уменьшается деструкция клеток, нормализуется уровень инсулина в крови (Т. Kobayashi, 2002). Сухой экстракт девясила способствует в комплексном лечении устранению нарушения толерантности к глюкозе и оптимизации ее метаболизма (L. Van, 1999), обладает превентивным действием на деструктивный процесс в поджелудочной железе (Q.H. Song, 2002). Сухой экстракт гребней винограда, включенный в состав Композиции, способен корректировать и «смягчать» течение сахарного диабета, предупреждать необратимые метаболические изменения за счет действия растительных биофлавоноидов. Незаменимым источником этих веществ является экстракт гребней винограда, в составе которого имеется значительное количество кислот и полифенолов флавоноидной (антоцианы, лейкоантоцианы, катехины) и нефлавоноидной природы, а также производного стильбена рес-вератрола, содержится заметное количество лейкоантоцианов (N.D. Nigro, 1982). Технологический запас полифенолов в гребнях виноградной грозди варьирует в пределах 12-16 г/кг. Полифенолы гребней виноградной грозди содержат олигомерные процианидины на основе катехина и эпикатехина, а также флавонол астильбин (Y. Kasahara, 1994). Полифенолы винограда выступают в роли активных антиоксидантов, которые способны подавлять цепные свободно-радикальные реакции, снижать активность оксидативных ферментов и уменьшать концентрацию пероксидных липидов в плазме крови (их эффект выше, чем у витамина Е в 50 раз, витамина С- в 20 раз) (G.D. Clayton, 1994).
Последнее свойство по сути является одним из главных механизмов лечебно-профилактического действия полифенолов винограда. Учитывая, что гиперпродукция свободных радикалов приводит к повреждениям на клеточном и органном уровне, то одной из основных задач в лечении сахарного диабета является борьба с окислительным стрессом (В.А. Косолапов, 2007). Так, рядом авторов показана четкая зависимость выраженности ангиопатий от интенсивности протекания свободнорадикальных реакций (N. Nath, et al., 1984; A.D. Mooradian, 1995) и определены изменения активности антиоксидантных систем организма в первые недели развития стрептозотоцинового диабета у крыс (Р.Е. Jennings et al., 1987; S.P. Wolff, 1987; A. Collier et al., 1990). Установлено, что глюкоза может ускорять окисление липидов in vitro (М. Hicks et al., 1988), подавлять антирадикальную систему, включая глютатион зависимые ферменты (Р.А. Bernett et al., 1986), витамин Е (C.W. Karpen et al., 1985), витамин С (D.K. Yue, S.Mc. Lennen et al., 1990), содержание которых у больных сахарным диабетом снижено. Кроме того, на экспериментальных моделях диабета продемонстрировано, что неферментативное гликозилирование белков поставляет промежуточные продукты, которые могут перестраиваться в соединения, способные генерировать супероксид анион путем самоокисления (Т. Sakurai et al., 1988; P. Gillery et al., 1988; T. Sakurai et al., 1990; С J. Mullarkey, 1990).
В исследованиях последних лет по изучению состояния аутоокисления при экспериментальном и клиническом диабете показано, что избыточное образование свободных радикалов, накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ приводит к нарушению гидрофобных связей макромолекул островков Лангер-ганса (К. Arai et al., 1987). При этом наблюдается разобщение окислительного фосфорилирования, лабилизация лизосом, что в конечном итоге приводит к нарушению синтеза проинсулина и повреждению р-клеток (Л.К. Корязова, А.К. Гулевский, 1990; W. Sumonski et al., 1989). Однако инсулинпродуцирующие клетки не являются единственным уязвимым объектом организма, находящегося в условиях пероксидации. В таком состоянии повышенного перекисного окисления и сниженного окси дантного резерва при диабете окислительный стресс может играть важную роль в патогенезе диабетических сосудистых осложнений, неироваскулярнои дисфункции (N.E.. Cameron, М.А. Cotter, 1995), атеросклеротического поражения периферических артерий (JJ. Belch et al., 1995). То есть, очевидно, что образование разновидностей реактивного кислорода может в целом вносить вклад в развитие осложнений диабета, к тому же показано, что антиоксидан-ты ослабляют проявление осложнений СД (М.А. Cotter et al., 1995; N.E. Cameron, 1996; A. Love et al., 1996). Экстракт гребней винограда предупреждает повреждение эндотелия сосудов, способствует улучшению микроциркуляции при лечении ангиопатий, ретинопатии (А.А. Кубатиев, 1996; Н.И. Гром нацкий, 2002). і В ходе работы было изучено более 20 различных комбинаций перечисленных компонентов в различных сочетаниях и дозах (отчёт СКС «Альянс» от 28.05.2003 и 18.10.03), наиболее эффективная из них Композиция была выбрана для дальнейшего исследования {табл. 2.16).
Похожие диссертации на Противодиабетические свойства гимнемовых кислот
