Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о механизмах репарации повреждений днк (обзор литературы) 13
1.1 Система репарации ДНК в клетках эукариот 13
1.1.1 Сигнальные механизмы при двунитевых разрывах ДНК. 15
1.1.2 Механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК . 20
1.1.2.1 Репарация двунитевых разрывов по механизму негомологичного соединения концов ДНК 21
1.1.2.2 Репарация двунитевых разрывов по механизму гомологичной рекомбинации. 24
1.1.3. Клинические синдромы, обусловленные дефектами репарации повреждений ДНК 25
1.2 Роль поли(АДФ-рибоза)полимеразы в механизмах репарации повреждений ДНК 29
1.2.1 Структура и ферментативная активность поли(АДФ-рибоза)полимеразы 29
1.2.1 Поли(АДФ-рибоза)полимераза вовлечена в процессы репарации различных по природе повреждений ДНК 32
1.3 Роль белка PML в механизмах репарации повреждений ДНК 35
1.3.2 Ядерные тельца белка PML – активные макромолекулярные структуры, опосредующие его функциональную активность 39
1.3.2.1 Ядерные тельца белка PML принимают участие в процессах программированной клеточной гибели. 40
1.3.2.2 Ядерные тельца белка PML и механизмы репарации повреждений ДНК. 41
1.3.4 Механизмы снижения экспрессии белка PML в клетках 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Характеристика объекта и предмета исследования 46
2.2. Хранение, культивирование и пассирование клеточных культур линий BJ, U-2 OS . 46
2.3. Нокдаун белков PML и PARP в клетках линий BJ и U-2 OS методом РНК-интерференции 48
2.3.1. Трансфекция короких интерфирирующих РНК (киРНК) 48
1.4. Индукция повреждений ДНК (генотоксический стресс ) в клетках линий BJ и U-2 OS с помощью химиопрепаратов. 49
1.5. Анализ экспрессии белков методом иммуноблотинга (Вестерн блоттинг) 50
2.5.1. Подготовка лизатов 50
2.5.2. Приготовление полиакриламидного геля 51
2.5.3. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 53
2.5.4. Перенос на белков нитроцеллюлозную мембрану (Трансфер). 54
2.5.5. Блокирование и окрашивание нитроцеллюлозной мембраны. 55
2.5.6. Анализ экспрессии белков методом хемилюминесцентной детекции. 56
2.6 Исследование экспресии белков методом иммунофлуоресцентной
микроскопии. 57
2.7. Исследование накопления -галактозидазы в клетках с помощью окраскиреагентом X-gal. 58
2.7.1. Приготовление растворов для окрашивания. 58
2.7.2. Протокол окрашивания клеток . 59
2.8. Оценка жизнеспособности клеток с помощью МTS-теста. 59
2.7.1. Приготовление рабочих растворов для MTS-теста. 60
2.8.1. Культивирование клеток для MTS-теста и интерпретация результатов 61
2.9 Статистическая обработка полученных результатов 61
ГЛАВА 3. Результаты исследований 62
3.1 Нокдаун белков PML и PARP-1 короткими интерферирующими РНК (киРНК) 62
3.2 Изучение активности поли (АДФ-рибоза)-полимеразы в условиях нокдауна белка PML 65
3.3 .Исследование роли белков PML и PARP в процессах репарации повреждений ДНК
4 3.4 Исследование жизнеспособности нормальных и опухолевых клеток в условиях генотоксического стресса и нокдауна белков PARP и PML 74
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 81
Выводы 90
Заключение 91
Практические рекомендации 93
Список сокращений 94
Список литературы 95
- Механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК
- Хранение, культивирование и пассирование клеточных культур линий BJ, U-2 OS
- Анализ экспрессии белков методом иммуноблотинга (Вестерн блоттинг)
- Протокол окрашивания клеток
Введение к работе
Актуальность проблемы
Химио- и радиорезистентность злокачественных новообразований на проводимую терапию остается одной из наиболее актуальных проблем современной клинической и экспериментальной онкологии. Особое место в этой проблеме занимает не только изначально существующая резистентность опухолевых клеток, но также их способность приобретать устойчивость к противоопухолевым агентам в процессе лечения (В. А. Зинченко и соавт., 2005). Во многом, это обусловлено тем фактом, что опухолевые клетки способны «переживать» повреждения ДНК (т.е. генотоксический стресс), возникающие в результате воздействия химиопрепаратов и/или лучевой терапии (H.L. Tang et al., 2012). Это достигается в результате запуска в опухолевых клетках различных механизмов репарации поврежденных участков ДНК, в частности, за счет активации процессов гомологичной и негомологичной рекомбинации ДНК (A.J. Hartlerode et al., 2009; S.P. Jackson 2009; B. Pardo et al., 2009). Результатом этого является повышение выживаемости опухолевых клеток, что клинически проявляется неуклонным ростом опухолевой массы и клиническим прогрессированием заболевания, несмотря на проводимую химио- и радиотерапию. Осложняет положение и генетическая нестабильность опухолевых клеток, которые, имея высокий уровень спонтанных мутаций, легко подвергаются мутагенному воздействию химиопрепаратов и продуктов их метаболизма (C. Lengauer et al., 1998). Это в значительной мере усиливает гетерогенность опухолевой популяции, способствует генерации еще большего числа резистентных к химиотерапии опухолевых клеток, усиливает их способность к метастазированию и возникновению рецидивов на фоне продолжающейся химиотерапии (G.I. Solyanik et al., 2000).
В сложившейся ситуации продолжение проведения химио- и радиотерапии не только не способствует улучшению состояния больных злокачественными новообразованиями, но и приводит к развитию побочных эффектов, обусловленных выраженными цитотоксическими свойствами большинства современных химиопрепаратов.
В настоящее время широкое распространение получил «персонализированный подход» терапии многих заболеваний, в том числе и злокачественных новообразований, который базируется на особенностях возникновения и патогенеза заболевания отдельно взятого организма или небольшой группы. Это позволяет подобрать наиболее эффективную терапию пациенту с конкретным новообразованием, основываясь на генетическом анализе опухоли и уровне экспрессии «особых» белков. Одним из перспективных направлений в обеспечении повышения эффективности нехирургических методов лечения онкологических больных является разработка методов оценки и повышения чувствительности опухолевых клеток к проводимой химиотерапии, которые базируются на использовании дефектов в системе репарации повреждений ДНК для достижения наиболее результативного противоопухолевого эффекта.
Установлено, что дефекты в системе гомологичной рекомбинации ДНК с одной стороны являются предрасполагающим фактором в возникновении злокачественных новообразований. С другой стороны, онкологические больные, имеющие таковые дефекты, являются наиболее восприимчивыми к воздействию определенных групп цитотоксических препаратов по причине существующих дефектов в системе репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках, возникающих в результате проведения химиотерапии. Данный феномен нашел отражение в концепции «синтетической летальности», согласно которой наличие мутации в одном из двух «летальных» генов никак не отражается на жизнедеятельности клеток, однако мутации в обоих «летальных» генах приводят к гибели этих клеток (W.G. Jr. Kaelin, 2005). В соответствии с данной концепцией, химиопрепараты, разработанные по данному принципу, должны вызывать гибель исключительно раковых клеток, имеющие мутации в таковых «летальных генах».
Наиболее перспективным примером использования данной концепции в терапии злокачественных новообразований является монотерапия препаратами ингибиторами PARP (поли(АДФ-рибоза)-полимеразы) пациентов с мутациями генов BRCA-1 и BRCA-2. Данная группа имеет высокую чувствительность к ингибиторам PARP за счет подавления процессов гомологичной рекомбинации повреждений ДНК (H.E. Bryant et al., 2005; S. Burma et al., 2001).
Дальнейшие исследования показали, что дефекты в системе гомологичной рекомбинации встречаются гораздо чаще и обнаруживаются у больных злокачественными новообразованиями (Q. Wei et al., 2000).
Особое внимание следует уделить белкам-онкосупрессорам, которые участвуют в процессах гомологичной рекомбинации. Так, белок PML является одним из многофункциональных белков ядра, принимающим участие в транскрипции генов, противовирусном ответе, онкогенезе, клеточном старении, регуляции апоптоза и репарации ДНК (R. Bernardi et al., 2007).
Исследования, проведенные ранее, демонстрируют, что PML взаимодействует со многими факторам вовлеченными в репарацию двунитевых разрывов по механизму гомологичной рекомбинации, в том числе и RAD51 (S. Boichuk et al., 2011). Таким образом, изучение взаимосвязи вышеперечисленных белков и их роли в репарации ДНК, а также формировании химиочувствительности опухолевых клеток, является актуальным и перспективным направлением в фундаментальной онкологии.
Цель исследования
Изучить роль белков PARP и PML в механизмах репарации повреждений ДНК в условиях генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами.
Задачи исследования:
-
Произвести нокдаун белков PML и PARP методом РНК-интерференции и оценить жизнеспособность клеток на фоне «выключения» экспрессии вышеназванных белков.
-
Исследовать взаимосвязь между экспрессией белка PML и активностью поли(АДФ-рибоза)-полимераз (PARP) в физиологических условиях, а также в условиях генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами.
-
Охарактеризовать роль белков PML и PARP в репарации повреждений ДНК, а также жизнеспособность нормальных и опухолевых клеток в условиях генотоксического стресса.
-
Изучить способность белка PML регулировать процессы клеточного старения в ответ на генотоксический стресс, индуцированный химиопрепаратами.
Научная новизна исследования:
В рамках проведенной диссертационной работы впервые получены данные о повышении активности поли(АДФ-рибоза)-полимераз (PARP) в условиях генотоксического стресса и нокдауна белка PML. Полученные данные о нарушениях процессов репарации некоторых типов повреждений ДНК, а именно, ее двунитевых разрывов, в условиях сочетанного нокдауна белков PARP и PML, также получены впервые. Представленные в настоящей работе данные раскрывают новые молекулярные механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК в опухолевых клетках и открывают перспективы для повышения чувствительности опухолевых клеток к воздействию генотоксических факторов, а именно, химиопрепаратов. Полученные данные дополняют современные представления о молекулярных механизмах феномена “синтетической летальности” и подтверждают координирующую роль белка PML в репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму гомологичной рекомбинации. В настоящее работе впервые была проведена комплексная оценка жизнеспособности нормальных и опухолевых клеток на фоне единичного и комбинированного нокдауна вышеназванных белков, как в физиологических условиях, так и на фоне генотоксического стресса, индуцированного химиопрепаратами. Получены новые данные, свидетельствующие о координирующей роли белка PML в механизмах старения опухолевых клеток на фоне генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами. Было также показано, что PML-опосредованное развитие данного процесса является исключительно специфичным для опухолевых клеток.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты проведенного исследования позволяют углубить современные представления о роли белков PML и PARP в механизмах репарации повреждений ДНК. В работе показано, что белок PML является одним из ключевых для реализации механизма репарации двунитевых разрывов ДНК.
Экспериментальные данные свидетельствуют, что активность PARP в клетках с нокдауном белка PML повышается в условиях повреждения ДНК, вызванного генотоксическими агентами. Полученные результаты имеют большое научно-практическое значение как с точки зрения понимания молекулярных механизмов репарации повреждений ДНК, вызываемых химиопрепаратами, так и с точки зрения перспектив разработки новых стратегий терапии злокачественных новообразований (в частности, для использования химиопрепаратов – ингибиторов PARP).
Методика проведения сочетанного нокдауна белков PML и PARP-1 в дальнейшем может быть использована для изучения молекулярных механизмов «синтетической летальности» и сенсибилизации опухолевых клеток к химиопрепаратам.
Материалы диссертации могут быть использованы патофизиологами, биохимиками: а) в учебном процессе для преподавания раздела «Патогенез опухолевого роста», «Химия белков и нуклеиновых кислот»; б) в научной работе – для дальнейшего изучения механизмов репарации повреждений ДНК.
Методы исследования
В работе использовался ряд современных методов патофизиологии, биохимии и молекулярной биологии: культивирование клеточных линий, иммуноблоттинг, иммунофлуоресцентный метод, фотоколориметрический метод, методы световой и иммунофлюоресцентной микроскопии.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Белки PML и PARP-1 вовлечены в процессы репарации повреждений ДНК, а их «выключение» повышает чувствительность клеток к генотоксическим факторам, вызывающим двунитевые разрывы ДНК.
-
Белок PML регулирует процессы клеточного старения при генотоксическом стрессе, вызываемом химиопрепаратами.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (Казань, 2012 г.), Всероссийской конференции «Здоровье в XXI веке» (Казань, 2012 г.), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013» (Москва, 2013 г.). Всероссийской конференции «Петровские чтения – 2014» (Санкт-Петербург, 2014 г.).
Личный вклад соискателя
При непосредственном участии автора была выбрана тема, составлена программа, определены этапы диссертационной работы, проведен анализ научной литературы по изучаемой проблеме. Автором выполнены экспериментальные исследования на всех этапах диссертационной работы. Автором проведена статистическая обработка, группировка, анализ результатов, интерпретированы полученные данные. Формулирование выводов, рекомендаций, положений, выносимых на защиту, происходило при непосредственном участии автора работы.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 264 источника, из которых 263 зарубежных авторов. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 таблицами и 23 рисунками.
Механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК
Поддержание целостности генетической информации является чрезвычайно важной для жизнедеятельности отдельной клетки, так и для всего организма [116]. Для сохранения целостности генома в ходе эволюции в клетках сформировался комплекс механизмов, который устраняет многочисленные повреждения ДНК и, тем самым, предотвращает накопление и передачу измененного генетического материала в дочерние клетки [84]. Данный комплекс в англоязычной литературе получил название DDR (от англ. DNA Damage Response) [116,185]. Данная система производит постоянный мониторинг целостности генома, и по мере необходимости активирует комплексы факторов репарации ДНК в ответ на повреждающее воздействие генотоксических агентов и нарушение целостности генома. В зависимости от характера и объема повреждений ДНК комплекс белков и сигнальных молекул, входящих в систему DDR, способен останавливать дальнейшее продвижение по клеточному циклу, обеспечивая время для восстановления целостности ДНК, прежде чем клетка запустит репликацию или вступит в митоз [263]. В тех случаях, когда репарация невозможна или объем повреждений слишком велик, система репарации запускает механизм программированной клеточной гибели – апоптоза [170]. В то время как часть повреждений ДНК является преимущественно результатом естественного метаболизма клеток или репликации [142], они также могут быть вызваны экзогенными факторами, такими как ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, природные и искусственные мутагены, ионы тяжелых металлов и химиопрепараты [110]. Было подсчитано, что в каждой из 1013 клеток организма человека в течение дня происходит десятки тысяч повреждений ДНК репликации [142]. Спектр повреждений, вызываемых как эндогенными процессами, так и экзогенными агентами довольно широк, только повреждения, вызванные активными формами кислорода, имеют более 100 различных модификаций [30]. Тем не менее, в настоящее время в зависимости от характера повреждения и механизмов их репарации выделяют такие формы повреждений ДНК, как дезаминирование, депуринизация и алкилирование азотистых оснований, появление некомплементарных пар нуклеотидов, поперечные сшивки, образование тиминовых димеров, однонитевые и двунитевые разрывы (ДНР) ДНК [116].
Несмотря на то, что двунитевые разрывы ДНК встречаются значительно реже, чем другие вышеперечисленные типы повреждений ДНК, именно этот тип повреждений ДНК считается наиболее опасным и жизнеугрожающим [115, 116,124].
Двунитевой разрыв ДНК может сформироваться при воздействии таких факторов, как ионизирующее излучение и радиомиметические препараты, ингибиторы топоизомеразы II, а также в результате таких процессов, как V(D)J рекомбинация лимфоцитов, мейотическая рекомбинация половых клеток, активности нуклеаз при апоптозе и при реторовирусной инфекции [84, 116]. Формирование ДНР ДНК на концах хромосом связано с естественным репликативным старением клеток [48]. Следует помнить, что двунитевой разрыв (ДНР) ДНК характеризуется нарушением целостности обеих комплементарных нитей ДНК, и может сформироваться из двух однитевых разрывов ДНК, находящихся в непосредственной близости друг от друга [116]. Часто образование ДНР ДНК происходит в результате наличия повреждений ДНК, например однонитевого разрыва ДНК, на участке активности репликативных вилок [84, 116]. Как правило, концы ДНК, образованные при ДНР, подвержены физическому разделению друг от друга, что затрудняет их репарацию [115]. Другими препятствиями для быстрой и безошибочной репарации ДНР являются сочетанные повреждения оснований и конформационные изменения на образовавшихся концах разрыва остова ДНК, требующие концевого процессинга ДНК специальными комплексами ферментов – нуклеаз [115]. Нарушения репарации двунитевых разрывов ДНК могут инициировать возникновение мутаций, и, следовательно, привести к нестабильности клеточного генома [110]. Это, в свою очередь, может явиться одним из факторов, обуславливающих дефекты развития, послужить причиной возникновения злокачественных и нейродегенеративных заболеваний, иммунодефицитных состояний, бесплодия, а также обуславливать повышенную чувствительность к действию экзогенных факторов, оказывающих повреждающие действие на геном человека (например, ионизирующее излучение, ультрафиолетовое облучение) [116]. Поскольку именно нестабильность генома опухолевых клеток является одной из фундаментальных особенностей злокачественных новообразований [222], становится очевидным, что подобные генетические поломки могут обладать и канцерогенным потенциалом [102].
Сигнальные механизмы при двунитевых разрывах ДНК. Репарация двунитевых разрывов ДНК (ДНР ДНК) млекопитающих представляет собой сложный сигнальный механизм, который регулирует два ключевых события при ДНР – быструю остановку дальнейшего продвижения по клеточному циклу (или «чекпоинт») и вовлечение белков репарации к участку хроматина с ДНР ДНК [115]. Данные процессы инициируется активностью специальных участников каскада сигнализации повреждения ДНК – протеинкиназами ATR- (от англ. Ataxia telangiectasia and Rad3 related) и АТМ-киназ (от англ. Ataxia telangiectasia mutated) [155], принадлежащим к одному семейству – PIKK-киназ (от англ. phosphoinositide-3-kinase-related protein kinase) [217]. В то время, как ATM-киназа совместно с комплексом MRN (Mre11-Rad50-NBS1) участвует в распознавании ДНР ДНК [121, 136, 211], ATR-киназа и ATRIP (белок, взаимодействующий с ATR) направлены на распознавание однонитевых разрывов ДНК, возникающих в процессе репарации ДНР ДНК и при блоке репликативных вилок [121, 155].
Хранение, культивирование и пассирование клеточных культур линий BJ, U-2 OS
Поли(АДФ-рибоза)полимераза-1 (PARP-1) и поли(АДФ-рибоза)полимераза 2м(PARP-2) принадлежат к семейству ферментов PARP (от англ. – Poly (ADP ribose) polymerase, PARP), которое в настоящее время насчитывает 18 ферментов [7]. Все поли(АДФ-рибоза)полимеразы имеют особый каталитический домен, который содержит мотив «PARP signture», высоко консервативную последовательность, формирущую активный центр фермента [7, 176]. Данные ферменты в качестве субстрата используют молекулу никотинамид-аденин динуклеотида (НАД+), расщепляя ее до никатинамида и АДФ-рибозы, переносят АДФ-рибозы на аминокислотные остатки глутамата, аспартата и лизина белков-акцепторов, модифицируя функциональную активность этих соединений [5, 172, 260]. Тем не менее, не все представители семейства PARP обладают поли(АДФ-рибоза)-полимеразной активностью и большинство из них функционирует в качестве моно(АДФ-рибозил)трансфераз (mARTs) [259]. Молекулы поли(АДФ-рибоз) (ПАР), формирующиеся в результате активности этих ферментов, образуют ковалентную связь с акцепторными белками и создают ветвящиеся структуры, которые сильно различаются по размеру, достигают нескольких сотен АДФ-рибозных остатков и несут большой отрицательный заряд [206, 259]. В качестве акцептора ПАР часто выступает сам фермент PARP -1 [47, 173], и этот феномен известен как аутомодификация. Поли(АДФ-рибоз)илироние является обратимой и кратковременной формой посттранскрипционной модификации белков, которая в естественных разрушается в течение нескольких минут специальными ферментами - поли(АДФ-рибоза)-гликогидролазами (PARG) (от англ. Poly(ADP-ribose) glycohydrolase) [240]. Формирование ПАР стимулируется повреждениями ДНК и в основном связано с ферментативной активностью двух ферментов, PARP-1 и PARP-2 [47, 259]. В условиях повреждения ДНК, PARP-1, будучи наиболее активным ферментом, отвечает за 90% образующихся PAR, наблюдаемых при таких состояниях [205]. Действительно, PARP-2 был открыт в результате исследования остаточной ДНК-зависимой PARP-активности в мышиных эмбриональных фибробластах, дефицитных по PARP-1 [6, 210].
Белок PARP-1 (ARTD1) человека (hPARP-1) является высококонсервативным нуклеопротеином c молекулярной массой 113кДа. Ген PARP расположен в положении 1q41-42 и состоит из 23 экзонов, охватывающих 43 т.п.н. [205]. Структурно молекула PARP-1 разделена на 6 доменов [7; 259], обозначаемых латинскими буквами А-F (Рисунок 1). N-терминальный ДНК-связывающий домен «А» (от. англ. DNA binding domain, DBD) содержит два «цинковых пальца» (Zn1 и Zn2), и служит участком для связывания с поврежденной ДНК [94]. Третий «цинковый палец» был обнаружен в С-концевой области PARP-1, хотя он необязателен для связывания с ДНК, но важен для изменения каталитической активности PARP-1 [132, 134]. В домене «В» присутствует участок расщепления каспазы-3 и уникальная последовательность аминокислот, называемая NLS (от англ. Nuclear Localization Signal), которая опосредует внутриядерное расположение белка [122]. В центральной части молекулы PARP-1 находится BRCT-мотив, принимающий участие во взаимодействиях белок-белок, и этот участок молекулы получил название домена «аутомодификации» [47]. Каталитический домен (CAT) состоит из двух субдоменов: HD (от.англ. helical subdomain - спиральный домен) и ART (от англ. ADP-ribosyl transferases), который представлен в каталитических доменах многих АДФ-рибозилтрансфераз [196, 197]. Функция домена WGR оставалась дискуссионной [259], тем не менее, исследования последних лет демонстрируют, что WGR является центральным звеном комплекса, который одновременно взаимодействует с Zn1, Zn3, CAT и ДНК, и при связывании с поврежденной ДНК изменяет конформацию молекулы PARP-1 таким образом, что происходит уменьшение стабильности каталитического домена (CAT) [133]. PARP-2 (ARTD1) человека (hPARP-2) является нуклеопротеином с молекулярной массой 62 кДа, кодируемой в гене, расположенном на участке 14q11.2, который содержит 16 экзонов, охватывающих 13 т.п.н. [206]. Интересно, что 2 изоформы белка hPARP-2 синтезируются альтернативном сплайсинге, хотя функциональная значимость данного феномена не изучена [259]. N-концевая часть молекулы PARP-2, в отличие от PARP-1 не имеет «цинксвязывающих пальцев», тем не менее содержит ДНК-связывающий домен (DBD). Строение DBD-домена в молекуле PARP-2 отличается от одноименного домена в PARP -1 [6], что отражается в меньшей связывающей способности данного образования к участку с однонитевым разрывом (ОНР) ДНК, но высокой эффективностью по отношению к пробелам [13]. \
Анализ экспрессии белков методом иммуноблотинга (Вестерн блоттинг)
Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) — аналитический метод, используемый для определения экспрессии белков в пробах. Вестерн блоттинг состоит из нескольких этапов: 1) электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных белков по молекулярной массе; 2) перенос на нитроцеллюлозную мембрану (Трансфер), 3) окрашивание моноклональными антителами (мАТ) к исследуемым белкам; 4) детекция и анализ результатов.
Из культуральной чашки Петри (р60) отбирали питательную среду в заранее маркированную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Далее добавляли 2 мл фосфатно-солевого буфера в чашку Петри и также отбирали в центрифужную пробирку. Пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Супернатант сливали. Клетки лизировали с помощью специальной смеси, содержащей лизирующий буфер (RIPA buffer) следующего состава: 50 мМ Трис-HCl (рН 7.4), 150 мМ хлорида натрия (NaCl), 1 мМ Динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, 1% NP-40, 0,25% дезоксихолата натрия, 1 мМ Na3VO4, с содержанием 4% ингибитора протеаз (Protease inhibitors cocktail, Sigma, США) и 1% фенилметилсульфонилфторид (Phenylmethanesulfonyl fluoride, Sigma, США). Лизирующую смесь готовили непосредственно перед добавлением. Весь цикл приготовления лизатов производили на льду. При лизировании клеток, культивируемых на чашках Петри (диаметр 60 мм), количество добавляемой лизирующей смеси составляло 60 мкл. После 5 мин инкубации на льду клетки отделяли от адгезионной поверхности скребками и суспензию клеток переносили в микропробирки «Eppendorf» объемом 0,5 мл. В эту же микропробирку добавляли осадок клеток из центрифужной пробирки. После чего клеточную суспензию инкубировали 20 минут при 4С, а затем центрифугировали при 13000g при температуре 4С в течение 30 минут. Надосадочную жидкость переносили в новые микропробирки. Полученные лизаты аликвотировали по 24 мкл и хранили при -20 С.
. Приготовление полиакриламидного геля Для подготовки полиакриламидного геля (ПААГ) использовали набор для электрофореза (BioRad, США), состоящий из комплекта стекол-спейсеров, покровных (коротких) стекол, гребенок, заливочной камеры, заливочного модуля и рамки. Для заливки геля использовали заливоный столики комплекты стекол, состоящие из стекла-спейсера и покровного стекла, установленные на заливочную рамку.Для электрофореза белков готовили разделяющие и загрузочные гели различных концентраций в зависимости от исследуемых белков. Так для белков с низкой молекулярной массой в пределах 10-25 кДа использовали 12%, а белков, масса которых превышает эти значения 6 и 8%-гели.
Состав разделяющего (разрешающего) 12% полиакриламидного геля из расчета на 1 гель формата Midi: 1,7 мл дистиллированной воды, 2 мл 30% раствора акриламида/бисакриламида, 1,25 мл 1.5М раствора ТРИС-HCl (рН 8.8), 50 мкл 10% раствора SDS (Додецилсульфата натрия). Непосредственно перед заливкой геля для полимеризации добавляли 25 мкл 10% APS (аммоний персульфат) и 2,5 мкл Темеда. Полимеризация происходила при комнатной температуре в течение 30 минут. После полимеризации заливали загрузочный гель.
Состав загрузочного (концентрирующего) 12% полиакриламидного геля из расчета на 1 гель формата Midi: 0,85 мл дистиллированной воды, 1 мл 30% раствора акриламида/бисакриламида, 0,625 мл 0.5М раствора ТРИС-HCl (рН 6.8), 25 мкл 10% раствора SDS (Додецилсульфата натрия). Непосредственно перед заливкой геля для полимеризации добавляли 12,5 мкл 10% APS (аммоний персульфат) и 1,25 мкл Темеда.
Для гелей с другими процентным содержанием использовали объемы, отображенные таблицу ПААГ (BioRad, США). Таблица 1– Концентрации полиактиламидного геля для Вестерн Блоттинга.
Протокол окрашивания клеток
Известно, что поддержание стабильности генетического аппарата — одно из важнейших условий для нормальной жизнедеятельности всех организмов [116]. Тем удивительнее кажется тот факт, что клетка, подвергаясь воздействию многочисленных экзогенных и эндогенных генотоксических факторов, в подавляющем большинстве случаев сохраняет целостность генома и жизнеспособность [110]. Ключевая роль в поддержании целостности генетического материала принадлежит механизмам репарации ДНК. Система репарации ДНК объединяет в себе большое количество белков, задействованных в распознавании и своевременном восстановлении целостности ДНК после генотоксического стресса [116, 185].
Нарушения репарации повреждений ДНК могут инициировать возникновение мутаций, становиться причиной нестабильности генома [110]. Показано, что приобретённые и наследственные дефекты в системе репарации повреждений ДНК могут обусловливать предрасположенность к злокачественным новообразованиям, инициируя как сохранение мутаций в геноме, так и последующее выживание мутантных (то есть потенциально опухолевых) клеток [1].
С другой стороны, клетки имеющие дефекты в системе репарации ДНК, являются наиболее чувствительными к воздействию генотоксических агентов. В репарацию повреждений ДНК задействовано громадное количество белков. Как описано выше (Глава I), дефекты функционирования или мутации гена даже одного из белков, вовлеченных в процессы репарации ДНК, могут привести к серьезным расстройствам в системе репарации ДНК и повышению чувствительности к агентам, вызывающим генотоксический стресс. Учитывая важность белка PML во многих процессах жизнедеятельности клетки, в настоящем исследовании была поставлена цель – изучить его роль в репарации повреждений ДНК в условиях генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами.
На первом этапе был произведен нокдаун белков PARP-1 и PML короткими интерферирующими РНК (киРНК). Результаты трансфекции отображены на рисунках № 6, 7, 8, 15 и демонстрируют, что нокдаун белков PML и PARP -1 приводит к значительному снижению уровня экспрессии продуктов генов PML и PARP-1 в исследуемых культурах клеток, а именно культурах фибробластов человека линии BJ, а также остеосаркомы человека U-2 OS. Также был выполнен сочетанный нокдаун белков PML и PARP-1 в линии фибробластов BJ. Результаты иммуноблотинга продемонстрировали, что данная процедура приводит к одновременному подавлению экспрессии вышеназванных белков в вышеописанных клеточных культурах. Клетки, перенесшие трансфекцию к вышеназванным белкам, как по отдельности, так и в сочетанном нокдауне, сохраняли жизнеспособность при культивировании. Это было подтверждено методом световой микроскопии и результатами MTS-теста, основанного на колориметрическом определении активности ферментов – дегидрогеназ, сопоставимой с количеством жизнеспособных клеток в контрольной группе при проведении анализа химиочувствительности клеток к различным классам химиопрепаратов (Рисунок 19).
Следует отметить, что трансфекция киРНК против белка PML вызывала стойкое снижение экспрессии большинства известных изоформ белка, в том числе изоформы PML II. Результаты иммунофлюоресцентного окрашивания фибробластов, подвергшихся нокдауну белка PML с помощью соответствующих киРНК, подтвердили отсутствие ядерных телец по сравнению с контролем (Рисунок 7). Таким образом, полученные данные позволяют говорить о том, что изоформа PML II, которая, в силу особенности строения, является структурной единицей ядерных телец (PML NBs), может принимать активное участие в формировании данных ядерных образований, основным структурным компонентом которых является белок PML. Данные современной литературы свидетельствуют о том, что роль белка PML в процессах репарации ДНК во многом может быть обусловлена сохранностью и функционированием ядерных телец PML NBs [19, 56, 57]. Следовательно, вполне логичным выглядит предположение о том, что в условиях нокдауна белка PML, сопровождающегося дезинтеграцией ядерных телец, происходят нарушения процессов поддержания генетической стабильности, что, в свою очередь, способно повлиять на чувствительность клеток к воздействию генотоксических факторов, в том числе, химиопрепаратов и ионизирующего излучения.
Таким образом, в клетках с нормально функционирующей системой контроля генетической стабильности на фоне дезинтеграции ядерных телец в результате нокдауна белка PML происходят глубокие нарушения процессов репарации повреждений ДНК, и, в частности, двунитевых разрывов. Приоритетная роль белка PML в процессах гомологичной рекомбинации ДНК в условиях ее согласуется с результатами изучения активности поли(АДФ-рибоза)-полимераз (PARP) в условиях нокдауна белка PML. Поли(АДФ-рибоза)-полимераза-1 является одним из ключевых ферментов, задействованных в репарации повреждений ДНК происходящих до репликации в S-фазе [259]. Факт умеренного повышения активности PARP в условиях нокдауна белка PML был выявлен в фибробластах даже при отсутствии воздействия химиопрепаратов (Рисунок 9). Это может свидетельствовать о развитии компенсаторных механизмов, препятствующих образованию разрывов ДНК в процессе её репликации, что является достаточно жизнеугрожающим в условиях функциональной недостаточности процессов гомологичной рекомбинации ДНК.
Для подтверждения полученных результатов, свидетельствующих о гиперактивации PARP в условиях генотоксического стресса на фоне нокдауна белка PML, была произведёна оценка образования ПАР-полимеров методом иммуноблотинга.
Результаты иммуноблотинга, представленные на рисунке 9, показывают значительное увеличение количества ПАР-полимеров в условиях одновременного нокдауна белка PML и генотоксического стресса, индуцированного доксорубицином, гидроксимочевиной и этопозидом. Таким образом, данные иммуноблотинга подтверждают факт гиперактивации PARP в фибробластах, имеющих повреждения ДНК в условиях «дефицита» белка PML. В фибробластах человека линии BJ, подвергнутых генотоксическому воздействию химиопрепаратов (доксорубицин, этопозид, гидроксимочевина), происходила активация процессов репарации ДНК, о чём свидетельствует повышение уровня экспрессии фосфорилированной формы АТМ-киназы (pATM Ser 1981)— одной из ключевых протеинкиназ, участвующих в привлечении, активации и фосфорилировании гистона Н2AX ( Н2AX) – маркера двунитевых разрывов ДНК.
