Содержание к диссертации
Введение
I. Основные закономерности ферментативного гидроли за нутриентов в пищеварительном тракте 7
2. Адаптация пищеварительной системы к характеру питания 12
3.Становление пищеварительной функции в онтогенезе 25
4.Характер питания и особенности пищеварительной системы норок и песцов 33
CLASS Материал и методу исследовани CLASS я
I.Постановка экспериментов 38
2.Методы исследования 42
2.1.Определение активности пепсина и общей протеолитической активности 43
2.2. Определение активности альфа-амилазы 45
CLASS Результаты эксперименто CLASS в
1. Активность пищеварительных ферментов в желудочно-кишечном тракте животных с различным типом питания 47
1.1. pH содержимого желудка и тонкой кишки 48
1.2. Активность пепсина в желудке 51
1.3.Протеолитическая и амилолитическая активность в поджелудочной железе 55
1.4.Протеолитическая и амилолитическая активность в тонкой кишке 58
1.5.Соотношение мембранного и полостного гидролиза в тонкой кишке. 69
1.6.Активиость пищеварительных ферментов в крови 72
2.Ферментативная активность в пищеварительном тракте норок и песцов на основных этапах постнатального онтогенеза 77
2.1. .рН содержимого желудка и тонкой кишки 78
2.2.Активность пепсина в желудке 82
2.3.їїротеолитическая и амилолитическая активно-.сть поджелудочной железы 87
2.4. Протеолитическая и амилолитическая активность в тонкой кишке 93
2.5. Активность пищеварительных ферментов в крови 114
3.Влияние хшкокцида на активность пищеваритель ных ферментов в желудочно-кишечном тракте норок 117
Выводы 158
Практические предложения 160
Литература 161
Приложение 197
- Основные закономерности ферментативного гидроли за нутриентов в пищеварительном тракте
- Адаптация пищеварительной системы к характеру питания
- Активность пищеварительных ферментов в желудочно-кишечном тракте животных с различным типом питания
- Активность пепсина в желудке
Введение к работе
Со времен И. П. Павлова физиология пищеварения интенсивно развивается как в СССР, так и за рубежом. К настоящему времени накоплен обширный материал о закономерностях переваривания и усвоения питательных веществ и о роли пищеварительных ферментов в этом процессе. Однако большинство фактических данных получено в экспериментах на лабораторных животных, относящихся к растительноядным или всеядным видам. Гораздо меньше сведении имеется о пищеварении хищных.
Пищеварение у плотоядных пушных зверей, к которым относятся норки и песцы - наиболее массовые объекты клеточного разведения, до настоящего времени практически не изучалось, а имевшиеся в звероводстве рекомендации основывались на сопоставлении с другими животными, хотя хорошо известно, что процесс пищеварения адаптирован к типу питания, свойственному данному виду животных.
Изучение пищеварения хищных пушных зверей приобретает особую актуальность в настоящее время, так как для современного звероводства одной из важнейших задач является использование рационов с повышенным содержанием растительных кормов и минимальным уровнем животного белка. Необходимость внедрения таких рационов вытекает из Продовольственной программы СССР, поскольку обеспечивает экономию ценных пищевых продуктов. При составлении новых рационов важно знать способность норок и песцов к ассимиляции различных нутриентов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение закономерностей переваривания белков и углеводов в основных отделах пищеварительного тракта (желудок, поджелудочная железа, тонкая кишка) у хищных пушных зверей - норок и песцов, содержащихся в зверохозяйствах. Эти исследования являются необходимой предпосылкой для внедрения в практику звероводства новых видов кормов. Основными задачами работы были: I. Исследование активности пищеварительных ферментов у животных с различным типом питания в идентичных экспериментальных условиях. 2. Определение ферментативной активности в желудочно-кишечном тракте у норок и песцов на основных этапах постнатального онтогенеза. 3. Изучение влияния антипротозойного препарата - химкокцида на пищеварение норок.
Научная новизна работы. Изучение активности пищеварительных ферментов у норок и песцов является одной из первых работ по физиологии пищеварения этих ценных животных. Впервые получены данные, характеризующие особенности пищеварительного тракта норок и песцов на основных этапах постнатального онтогенеза - во время молочного, смешанного и дефинитивного питания. Показаны видовые адаптации пищеварительных ферментов у хищных пушных зверей. Продемонстрировано угнетающее влияние химкокцида на ферментативную активность пищеварительного тракта норок.
Практическое значение работы. Полученные данные позволяют оценить способность хищных пушных зверей к ассимиляции белков и углеводов. Исследование пищеварения норок и песцов представляет особый интерес для сравнительной гастроэнтерологии, поскольку они принадлежат к различным семействам хищных, а содержатся в зверохозяйствах в сходных условиях на однотипных рационах. Практическое значение работы заключается в установлении уровня ферментативной активности пищеварительного тракта норок и песцов на различных этапах постнатального онтогенеза, что важно для разработки оптимальных кормовых рационов и сроков перевода щенков на общий корм. Результаты работы также демонстрируют необходимость предварительного тестирования непищевых добавок к корму. Экспериментальные данные могут быть использованы в дальнейших исследованиях при изучении влияния на пищеварение пушных зверей изменения состава рациона, промышленных стрессов и т.д.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 3-м билатеральном симпозиуме СССР - ЧССР "Физиология и патология пищеварения" (Кишинев, 1981), на 3-й Всесоюзной научной конференции "Биология и патология пушных зверей" (Петрозаводск, 1981), на 9-м симпозиуме "Биологические проблемы Севера" (Сыктывкар,Ї981), на 6-й Всесоюзной научной конференции по экологической физиологии (Сыктывкар, 1982), на 6-й конференции молодых ученых биологов биологические аспекты повышения продуктивности животных и растений" (Рига, 1984).
Основные закономерности ферментативного гидроли за нутриентов в пищеварительном тракте
Пищеварительная система является функционально единой как орган восприятия, хранения, продвижения, переваривания, всасывания и экскреции: пищевых веществ (Шлыгин, 1979). В пищеварительном тракте корма подвергаются ферментативному гидролизу, в результате которого они расщепляются до мономерных соединений, лишенных видовой специфичности и пригодных к ассшлиляции.
Процесс пищеварения начинается уже в ротовой полости,где пища пережевывается и увлажняется слюной. Секрет слюнных желез большинства млекопитающих обладает амилолитической активностью, выраженной в различной степени в зависимости от экологической специализации в питании животных (Уголев, I96I;&iauncey et.al., 1963). Время пребывания пищи во рту невелико, однако ферментативная обработка пищи амилазой слюны может продолжаться в желудке, пока кислотность незначительна (Ивашкин, Дорофеев, 1976).
Основная роль в гидролизе корма в желудке принадлежит протеолитическим ферментам, которые обнаруживаются в желудке у всех позвоночных SHBOTHHx(Giraud,Yeomans,l982). У млекопитающих активным началом желудочного сока являются в основном два протеолитических фермента: пепсин и гастрик-син. В желудке животных и человека обнаруживаются и другие протеолитические ферменты, активность которых максимальна при различных значениях рН (Коротько,1980; Амиров, Антонов, 1981), а также - липaзa(4askiewiez,Szaron, 1980), роль ко -торой особенно велика в начальный период после рождения ( Helander,oiivecrona,i970 ). В составе желудочного химуса присутствуют также мукоидные вещества, выполняющие защитные и другие функции. При электрофоретическом исследовании гомогенатов слизистой желудка обнаруживается несколько фракций протеолитических ферментов (Mangla et.al.,1980). Однако высказывается сомнение, что все эти фракции являются изоферментами (Амиров, Белостоцкий, I98I6). На практике же чаще всего судят о ферментативной функции желудка по определению пепсина (Краевский, 1968 и др.).
В желудке происходит только начальная обработка пищи: под действием пепсина осуществляется начальный гидролиз белков корма, которые разрушаются до растворимых белков и крупных пептидов, а также небольшого количества свободных аминокислот (Коротько, 1975). Соляная кислота разрушает клетчатку и растворяет кальцифицированные структуры. Степень гидролиза белков корма в желудке зависит от продолжительности контакта между ферментами и субстратом, которая определяется скоростью эвакуации его содержимого в двенадцатиперстную кишку (Коротько,1980). Переход содержимого из желудка обусловлен очередностью сокращений и изменением внутриполостного давления в антральном отделе желудка, пилорическом канале и двенадцатиперстной кишке (Климов, 1976).
Поджелудочная железа является важным органом пищеварительной системы. Ее экзокринная функция заключается в выработке и секреции в просвет двенадцатиперстной кишки поджелудочного сока - жидкости, имеющей щелочную реакцию и содержащей ферменты, катализирующие начальные стадии гидролиза основных компонентов пищи: белков, жиров и углеводов. Ферменты, расщепляющие белки, секретируются в неактивной форме. Основными протеолитическими ферментами поджелудочной железы являются трипсин и химотрипсин, эластаза, карбоксипептидаза А и В, а также калликреин (Розин, 1981). Имеются сведения, что трипсиноген в поджелудочной железе может присутствовать в двух формах ( Stockmann, Soling, 1981 ). Активация протео-литических зимогенов происходит под действием специфического кишечного фермента энтерокиназы. Бет и др.( Bett et.al., 1981 ) отмечают неравномерное распределение энтерокиназы в тонкой кишке.
В расщеплении углеводов участвует альфа-амилаза, которая также синтезируется в поджелудочной железе ( Lorentz,i982 ). Липолитическая активность поджелудочного сока обусловлена панкреатическими липазой и фосфолипазой ( Leger,Charles, 1982 ). В состав поджелудочного сока входят также рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза.
Синтез ферментов в ткани поджелудочной железы, по-видимо -му, осуществляется равномерно во всех ее частях ( Beaudoin et.al.,1981 ), однако по мнению большинства исследователей ( Rothman,1976; Суворова,1980; Singh, 1982 и др.)син-тез и секреция различных ферментов происходят непараллельно в зависимости от характера пищи. Необходимо отметить, что в поджелудочной железе синтезируется также ингибитор трипсина, которому отводят важную роль в предохранении железы от ауто-лиза и в ее реакции на пищевые вещества ( Melmed et. al., 1976; Roy,Schneeman, 1981 и др.).
Адаптация пищеварительной системы к характеру питания
Начало исследованиям по адаптации пищеварительной системы к составу пищи и характеру питания было положено еще в лаборатории И.П.Павлова. В настоящее время накоплен значительный материал о морфофункпиональных и биохимических изменениях, происходящих в желудочно-кишечном тракте под влиянием типа питания и качественного состава корма. Как и любая адаптация живого организма они делятся на видовые, . выработанные в процессе длительной эволюции вида и индивидуальные, приобретенные в течение жизни или определенного периода одной особью.
Видовые адаптации. Характерные особенности пищеварения у различных животных, главным образом, определяются типом экологической специализации в питании и качественным составом корма. У различных по филогенезу животных, потребляющих сходные корма,найдены одни и те же физиологические и биохимические особенности пищеварительной системы и,наоборот, у близкородственных видов, потребляющих различный корм, обнаруживаются значительные отличия в строении пищеварительного тракта и уровне пищеварительных ферментов (Уголев,1961; Сло-НИМ, 1962; Барнард, 1977; Clemens, Stevens,1980; Harada et. al.,1982 И др.).
У травоядных животных наблюдается непрерывная секреция желудочного сока (Вельская, Войтенко, 1970; Курилов, 1978; Калугин, 1980). У плотоядных желудочный сок выделяется обильно при приеме корма, а в перерыве между приемами пищи секреция невелика или вовсе отсутствует (Слоним, 1962). 7 всеядных животных обнаруживается непрерывная секреция, которая усиливается во время кормления (Lane et.al.,1957; Старцев, I972;Juhacz et.al.,1980 и др.). Кислотность желудочного сока как правило выше у плотоядных видов по сравнению с растительноядными (Уголев, 1961). Кроме того, пепсин плотоядных животных более интенсивно гидролизует белки животного происхождения, а пепсин растительноядных - растительные белки (Уголев, 1961).
Синтез и секреция пищеварительных ферментов поджелудочной железой также определяется типом питания данного вида животных. А.М.Уголевым (1961) показано, что активность протеаз выше у хищных, а активность амилазы выше у растительноядных видов. Однако, у некоторых жвачных активность амилазы в гомогенатах поджелудочной железы низка, что связано с наличием рубцового пищеварения (Халпаев, 1973). По данным Исхако-ва и др. (1975) в поджелудочной железе жвачных присутствует высокая активность протеолитических ферментов. По мнению Крогдала и Холма ( Кгogdahl,Holm,1981 ) протеолитичес-кая активность в поджелудочной железе крупного рогатого скота ниже, чем у крыс, свиней и других животных. При сравнении амилолитической активности в гомогенате поджелудочной железы у кур и уток установлено, что активность амилазы у первых значительно выше (Степанова, 1966). По мнению автора это связано с различием в их питании. Протеолитическая активность поджелудочного сока, наоборот выше у гусей по -сравнению с курами (Поляков, 1961). Другие исследователи ( Harada et.al.,1982 ) обнаружили сходные неличины активности амилазы в панкреатическом соке у кур и уток при введении холепистокинина.
В зависимости от типа питания изменяется не только соотношение панкреатических ферментов, расщепляющих различные компоненты пищи, но также и активность одноименных ферментов по отношению к субстратам растительного и животного происхождения (Уголев, Степанова, 1966; Camus et.al.,1980). Показано также ( Krogdahl,Holm,1981 ), что соотношение основных про-теолитических ферментов - трипсина и химотрипсина - неодинаково в ткани поджелудочной железы у животных разных видов.
В опытах Гертлера и др.( Gertler et.al., 1980 ) продемонстрирована различная интенсивность гидролиза белков растительного и животного происхождения протеолитическими ферментами поджелудочной железы свиньи. Маршалл и др. ( Marshall et.al., 1979 ) наблюдали различия специфической активности препаратов поджелудочной железы человека, свиньи и крысы по трипсину, химотрипсину, карбоксипептидазам А и В при переваривании белков животного и растительного происхождения или их смеси. В этих и других исследованиях ( Bodwell et. al.,1980; Rich et.al.,1980 ) установлено, что результаты определения активности протеолитических ферментов in vitro зависят от природы белка, используемого в качестве субстрата. Показано также ( Holm,Krogdahl,i982 ), что ингибитор протеаз из соевых бобов оказывает различное влияние на активность трипсина и химотрипсина человека, быка, свиньи.
Активность пищеварительных ферментов в желудочно-кишечном тракте животных с различным типом питания
Задачей данного цикла экспериментов было установить особенности ферментативной активности в пищеварительном тракте норок и песцов. Отсутствие данных по этому вопросу тормозит внедрение новых кормовых рационов в звероводческую практику. Однако изолированное исследование только этих двух видов хищников недостаточно информативно. В научной литературе имеется много фактических данных о тех или иных сторонах процес « са пищеварения, но большинство исследователей ограничивается одним видом животных в качестве объекта изучения. Вследствие этого в последующем бывает затруднительно сопоставить полученные результаты. Сравнительный метод в значительной мере свободен от этих недостатков.
Исходя из вышеизложенного, нами было проведено исследование активности пищеварительных ферментов у животных с разной пищевой специализацией. Для сравнения с основными объектами наших интересов: норками и песцами - плотоядные, исследованы всеядные животные - крысы и растительноядные - кролики. Кроме пищевой специализации была принята во внимание широкая распространенность крыс и кроликов в качестве удобного объекта исследования, что позволило нам сравнить полученные результаты с литературными данными.
Известно, что активность пищеварительных ферментов зависит от состава корма. Для оценки влияния диеты на полученные результаты одна группа крыс содержалась на стандартном рационе (контроль), а другая в течение 10 дней получала тот же рацион, что и норки (опыт). Животных забивали через 14-20 часов после кормления.
Вышеуказанное сравнительное исследование было проведено в 1982 г. В 1981 г. нами уже была исследована протеолитичес-кая активность в желудке и тонкой кишке у норок и песцов через I час после кормления. Состав рациона и другие условия экспериментов были одинаковыми, поэтому мы сочли возможным объединить эти результаты и рассматривать совместно. В дальнейшем животных, забитых через I час после кормления, мы будем именовать накормленными, в отличие от голодавших.
I.I. рН содержимого желудка и тонкой кишки Результаты измерения рН содержимого желудка и тонкой кишки у животных с различным типом питания представлены в таблице 2. Как и следовало ожидать, значения рН в содержимом желудка у животных всех групп были ниже, чем в содержимом тонкой кишки (Р Ш,05). Кормление оказало существенное влияние на рН желудка пушных зверей (Р 0,01), незначительно изменило его в тощей .кишке и не затронуло - в подвздошной. Такой характер изменения рН был обусловлен поступлением.во время еды значительного количества пастообразного корма. Непосредственные измерения величины рН этого корма дали значения 6,1-6,5, практически одинаковые для норкового и песцового рационов. Секретируемого желудочного сока, вероятно, недостаточно для его подкисления , в особенности у песцов, которые единовременно поедают значительно большие дозы корма, чем норки.
Видовые различия в уровне рН были лучше выражены в содержимом желудка, нежели тонкой кишки. Самая кислая реакция среды отмечена в желудке кроликов. Различия между раститель ноядными, всеядными и плотоядными видами были достоверны (Р 0,01). Различия между голодными норками и песцами были несущественны, тогда как у накормленных песцов значения рН были выше, чем у накормленных норок (Р 0,01). Кормление крыс мясо-рыбным кормом повышало рН в содержимом желудка (Р 0,01) и подвздошной кишки (Р 0,02), приближая их по характеру градиента рН в пищеварительном тракте к пушным зверям.
Величина рН в тонкой кишке была выше у растительноядных по сравнению с другими видами. В тощей кишке кроликов рН был существенно выше, чем у всех других животных (Р 0,001). У остальных видов рН был примерно одинаковым. В подвздошной кишке высокий рН отмечен также у кроликов.
При сравнении голодных и накормленных пушных зверей видно, что индивидуальная вариабельность рН выше у первых. По всей видимости, это связано с наличием остатков непереваренного корма в пищеварительном тракте голодных животных. Количество их было различным у отдельных особей и зависело от ряда факторов: количество съеденного корма, скорость эвакуации и ряда других. У накормленных зверей корм в пищеварительном тракте присутствовал примерно в равных количествах у отдельных особей, и индивидуальная вариабельность была невысокой.
У всех групп животных величина рН содержимого тощей кишки была меньше, чем подвздошной. Строгой зависимости между типом питания и градиентом рН в тонкой кишке не обнаружено, но как тенденцию можно отметить уменьшение абсолютных различий рН между тощей и подвздошной кишкой в ряду: плотоядные, всеядные, растительноядные.
Активность пепсина в желудке
Результаты определения активности пепсина в содержимом желудка у различных видов животных представлены в таблице 3. Здесь, как и в дальнейшем, мы придерживались двух способов выражения активности ферментов. В первом из них активность выражали в пересчете на I мг белка, содержащегося в ферментативном растворе. Во-втором - активность всего содержимого желудка или отрезка тонкой кишки делили на влажный вес всей слизистой данного отдела, выраженной в граммах. Первый способ широко применяется в исследованиях различных авторов (Furihata et.al.,1972; Николаевская, 1979; Henning,i979 и др.). Однако, при использовании данного способа расчета, как будет показано ниже, результаты,полученные на разных животных, иногда бывает трудно сравнивать. Второй способ расчета может дать дополнительную информацию и, в общем, сходен со способами выражения активности ферментов, принятыми; различными авторами ( Robbereclit et.al.,1971; McCarthy et.al., 1980; Sheard, Sclmeeman,l980 и др.). В дальнейшем изложении при упоминании результатов, полученных по первому способу, будет указываться - "активность на I мг белка", а по второму - "активность на I г. слизистой". Во всех расчетах единицы времени подбирались таким образом, чтобы в обоих случаях величины были одного порядка или, по крайней мере, не слишком отличались друг от друга.
В содержимом желудка голодных животных активность пепсина на I мг белка была выше у хищных, ниже у кроликов и еще ниже у крыс (Р 0,05). Различия между норками и песцами были невелики, так же как и между контрольными и опытными крысами. Следует отметить, что проводить сравнение между разными группами животных было достаточно сложно, так как при данном способе расчета нами была отмечена недостаточно четкая, но все же заметная обратная зависимость между количеством непереваренного корма в желудке и активностью пепсина в его содержимом. Количество же непереваренного корма было различным у разных животных. Полностью коглпенсировать эти различия варьируя временные параметры эксперимента (время после кормления у разных групп животных.) было затруднительно. Наиболее отчетливо зависимость полученных результатов от наличия в желудке корма видна при сравнении накормленных и голодных зверей. У первых активность пепсина на порядок ниже, чем у вторых. По всей вероятности, это связано с присутствием в желудочном содержимом накормленных зверей заметного количества растворимого белка экзогенного происхождения, присутствие которого и повлияло на результат при пересчете на I мг белка. Такое предположение подтверждается наличием низкой активности пепсина у накормленных песцов по сравнению с норками (РО,001), тогда как между голодными зверями различия были несущественны. Объясняется это, по-видимому, потреблением песцами большего количества корма, и.следовательно,присутствием в их желудке большего количества экзогенного белка.
У крыс, получавших мясо-рыбный корм,активность пепсина в содержимом желудка была на 18% ниже, чем в контроле. Различия однако были недостоверны.
Активность пепсина в содержимом желудка при пересчете на I г слизистой была самой высокой у кроликов, ниже - у крыс, и еще ниже у пушных зверей (Р 0,01). Активность фермента у песцов была существенно ниже, чем у норок (Р 0,02). Кормление крыс мясо-рыбным кормом обусловило снижение активности желудочного содержимого на 53$ (Р 0,001).
Существенные различия в результатах, полученных при использовании двух способов расчета, по-видимому, отражают различные стороны пищеварительного процесса. Так, при пересчете на I г слизистой мы получаем информацию, главным образом, об объеме секреции фермента в момент исследования, тогда как при расчете активности на I мг белка мы можем судить об относительном содержании фермента в секрете и об его удельной активности по отношению к субстрату.
Индивидуальные различия в активности пепсина в гомогенатах слизистой желудка были значительно меньшими у животных всех групп (табл. 3). Здесь и далее активность ферментов в гомогенатах слизистой или ткани выражена в пересчете на I мг белка или на I г влажного веса. Оба. способа широко применяются В исследованиях ПО пищеварению ( Robberecht et.al.,
1971; Уголев и др., 1981 и др.). Единицы времени подбирались так, чтобы абсолютные цифры, выражающие величину активности фермента, были близкими при обоих способах расчета. При сравнении активности ферментов в гомогенатах способ расчета в основном не изменял характера выявленных закономерностей, а мог только модифицировать степень их проявления. Поэтому, любой из этих способов может быть с успехом использован для сравнения активности ферментов у различных животных. Поскольку индивидуальные различия в большинстве случаев были меньше при пересчете активности на I мг белка, то в дальнейшем изложении мы будем использовать эти цифры без указания по какому способу расчета они получены. Б специальных случаях будет оговариваться, что результат получен при ином способе расчета.
