Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
1.1. Введение 11
1.2. Основная часть 14
1.2.1. Структура рафта 15
1.2.2. Белковый состав рафтов 18
1.2.3. Рафты - динамичные мембранные структуры 21
1.2.4. Размеры рафтов 22
1.2.5. Методы изучения рафтов 24
1.2.6. Функции рафтов 28
1.2.7. Липидные рафты и болезни человека 33
1.3. Заключение 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Материалы
2.1 Л. Клетки и их источники 37
2.1.2. Антитела 37
2.1.3. Растворы, использованные в работе 38
2.1.4. Прочие реагенты и материалы, используемые в работе 38
2.2. Методы
2.2.1. Экстракция клеток раствором неионного детергента ТХ-100 38
2.2.2. Экстракция клеток в растворах различных детергентов 39
2.2.3. Цитофлуориметрический тест 39
2.2.4. Обработка клеток проназой 40
2.2.5. Обработка клеток метил-|3-циклодекстрином 40
2.2.6. Обработка клеток цитохалазином Б 40
2.2.7. Определение резистентности поверхностных антигенов лейкоцитов человека к действию ТХ-100 40
2.2.8. Определение резистентности поверхностных антигенов к действию различных детергентов 41
2.2.9. Детекция образцов с помощью проточной цитометрии 41
2.2.10. Обработка результатов экспериментов 42
2.2.11. Измерения с помощью конфокальной микроскопии 42
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований.
3.1. Отработка методики получения клеточных остатков 43
3.2. Собственная ТХ-100 резистентность поверхностных антигенов 45
3.3. Сравнение детергентной резистентности поверхностных антигенов на различных мишенях 50
3.4. Определение локализации высокорезистентных антигенов 51
3.5. Солюбилизация поверхностных антигенов в разных детергентах 59
3.6. Влияние метил-р-циклодекстрина на резистентность поверхностных антигенов 66
3.7. Приобретенная резистентность поверхностных антигенов к действию Тритона Х-100.
3.7.1. Антитело-индуцированная резистентность поверхностных антигенов...69
3.7.2. Индукция другими лигандами 74
3.8. Эксперименты по коиндукции 77
3.9. Коиндукция CD20 и HLA-DR 79
3.10. Анализ антитело-опосредованной резистентности 80
3.11. Изучение влияния на антитело-опосредованную резистентность агентов, модифицирующих мембранные микродомены.
3.11.1. Действие метил-Р-циклодекстрина на антитело-индуцированную резистентность 82
3.11.2. Влияние Brij 58 на индукцию резистентности 83
3.12. Участие компонентов цитоскелета в антител о-индуцированной резистентности 85
ГЛАВА 4. Обсуждения полученных результатов.
4.1. Клеточные остатки - подходящий объект изучения рафтов с помощью проточной цитометрии 89
4.2 Собственная резистентность поверхностных антигенов к действию детергента ТХ-100 89
4.3. Сравнение резистентности антигенов на различных клетках мишенях 91
4.4. Определение локализации ТХ-100 резистентных антигенов лейкоцитов человека 92
4.5. Солюбилизация антигенов в разных детергентах 93
4.6. Приобретенная резистентность поверхностных антигенов к действию ТХ-100 94
4.7. Коиндукция разных антигенов 97
4.8. Анализ антитело-опосредованной резистентности 97
4.9. Участие компонентов цитоскелета в механизме антитело-индуцированной ТХ-100 резистентности поверхностных антигенов 99
4.10. Заключение 101
ВЫВОДЫ 103
Список использованной литературы
- Рафты - динамичные мембранные структуры
- Растворы, использованные в работе
- Сравнение детергентной резистентности поверхностных антигенов на различных мишенях
- Определение локализации ТХ-100 резистентных антигенов лейкоцитов человека
Рафты - динамичные мембранные структуры
Существуют два возможных объяснения устойчивости рафтов. Согласно первому предположению, плотная укладка сфинголипидов в рафтах обуславливается, в основном, взаимодействиями между полярными группами сфинголипидов. Холестерин, имеющий маленькую полярную группу, переходит в рафты из-за его способности заполнять пустое пространство в бислое, вызванное несоответствием размеров объемных полярных групп сфинголипидов и их жирнокислотных остатков. В соответствии со вторым предположением, упаковка липидов в рафты происходит благодаря гидрофобным взаимодействиям их ацильных цепей [25,26,27]. Известно, что сфинголипиды имеют в своем составе длинные насыщенные ацильные цепи, которые являются более упорядоченными, в отличие от глицерофосфолипидов, характеризующихся наличием ненасыщенных жирнокислотных остатков. Особенность структуры сфинголипидов позволяет им упаковываться в бислое более плотно и иметь более высокую температуру плавления, чем фосфолипидам, составляющим основную массу липидного бислоя. Такая плотная укладка ацильных цепей приводит к фазовому разделению сфинголипидов и фосфолипидов в мембране и является ключевой особенностью организации рафтов [27,28,29].
В модельных мембранах хорошо охарактеризовано фазовое разделение между липидами, находящимися в ламеллярной жидкокристаллической и ламеллярной гелевой фазах. Действительно, ламеллярная гелевая фаза наиболее похожа на состояние, в котором ацильные цепи липидов являются высокоупорядоченными. Однако, липидные рафты не существуют в гелевой фазе, из-за высокой концентрации присутствующего в них холестерина. Холестерин оказывает большое влияние на фазовое поведение липидов. Хорошо изучены взаимодействия между холестерином и модельными фосфолипидными смесями. Известно, что в жидкокристаллическом состоянии холестерин ограничивает конформационную подвижность фосфолипидных цепей, а в состоянии геля он затрудняет оптимальную упаковку цепей в полностью транс-конфигурации. В результате смеси фосфолипид-холестерин занимают по упорядоченности промежуточное положение между гелевым и жидкокристаллическим (1С) состояниями чистого фосфолипида. Таким образом, в модельных смесях домены в жидкокристаллическом состоянии сосуществуют с доменами в новом фазовом состоянии (10). Ацильные цепи липидов в этой фазе также плотно упакованы, как и в гелевой, но имеют большую степень латеральной подвижности [27]. Факты, полученные при изучении модельных мембран, поддерживают идею о том, что домены в 1С и в 10 фазах сосуществуют в биологических мембранах. Было установлено, что фазовое разделение может встречаться также в смесях холестерина с двумя различными фосфолипидами (или фосфолипидом и сфинголипидом), которые имеют различные температуры плавления и таким образом могут находиться в различных фазовых состояниях [28,30]. В таких смесях, домены в 10 фазе, содержащие липиды с высокой температурой плавления (Тт) отделены от доменов в 1с фазе, где находятся липиды с низкой температурой плавления (Тт). Из-за значительных различий в Тт между сфинголипидами и биологическими фосфолипидами эти липидные смеси являются подходящей (хотя и грубой) моделью холестерин-содержащих клеточных мембран, подобных плазматической мембране животных клеток. Таким образом, с большой долей вероятности можно предполагать, что рафты, вероятно, существуют в 10 фазе или в состоянии с похожими свойствами. Наличием холестерина обусловлена одна интересная особенность фазового поведения липидов. Так, например, сравнение фазового поведения смесей в присутствии и отсутствии холестерина показывает, что стерол может иногда способствовать фазовому разделению, очевидно, из-за предпочтительных взаимодействий между насыщенными липидами и холестерином [31]. Таким образом, в смесях фосфолипид/сфинголипид меньшее количество сфинголипидов необходимо для образования 10 фазы в присутствии холестерина, чем для формирования гелевой фазы в его отсутствии [28,29]. Данный эффект холестерина, вероятно, объясняет, почему рафты могут образовываться в мембранах, имеющих относительно низкое содержание сфинголипидов. Он также объясняет, почему удаление холестерина приводит к разрушению рафтов и влияет на их функции. Наконец, этот эффект объясняет, почему сфингомиелин, имеющий Тт 37-41 С, может участвовать в образовании рафтов также эффективно, как и сфинголипиды, имеющие более высокую Тт [32]. Любые различия в стабильности рафтов, которые объясняются разными Тт двух липидов, являются незначительными, по сравнению с сильным рафт-стабилизирующим влиянием холестерина.
Плазматическая мембрана клетки содержит разнообразные поверхностные белки. Одни гликопротеины обеспечивают транспорт молекул, другие являются ферментами и катализируют ассоциированные с мембраной реакции. Еще один класс белков осуществляет структурную связь плазматической мембраны с цитоскелетом, с одной стороны и (или) с внеклеточным матриксом - с другой. Отдельную группу составляют белки, исполняющие роль рецепторов для получения и преобразования биохимических сигналов из окружающей среды [1].
По способу прикрепления к мембране различают следующие типы белков: периферические, интегральные, а также белки, прикрепленные к мембране посредством заякоривания с помощью ковалентно связанного липида. Периферические белки связаны с поверхностью мембраны за счет слабых электростатических взаимодействий с полярными головками липидных молекул (например: миелиновый основный белок) либо с молекулами других белков (типичный пример: сукцинатдегидрогеназа) [1]. Интегральные (трансмембранные) белки удерживаются в мембране, в основном, гидрофобными взаимодействиями. Одни из них пересекают мембрану только один раз, другие-несколько раз.
Растворы, использованные в работе
Гипотеза о существовании липидных рафтов была впервые высказана в 1988 году [4,14]. Было обнаружено, что некоторые мембранные белки и липиды образуют макромолекулярные комплексы, которые устойчивы к солюбилизации в растворе неионного детергента Тритона Х-100 (ТХ-100) при низкой температуре [14,25].
Такие комплексы получили название DIG (detergent-insoluble glycolipid complex). У других авторов они назывались DIM (detergen-insoluble microdomains), DRM (detergent-resistant membranes), GEM (glycolipid-enriched membrane domains) или TIFF (тритон-несолюбилизируемая плавучая фракция).
Позднее все эти названия были объединены в одном понятии: "липидный микродомен" или "рафт" Несолюбилизируемость рафтов в ТХ-100 обусловлена плотной укладкой ацильных цепей рафтовых липидов, которая при пониженной температуре еще более стабилизируется, и в этом случае липид-липидные взаимодействия становятся более стабильными, чем липид-детергентные [79].
Рафты в форме DRM выделяют по следующей схеме: клетки лизируют в холодном растворе ТХ-100, полученный лизат ультрацентрифугируют в градиенте плотности сахарозы и, анализируя полученные фракции, отбирают фракцию детергент-резистентных мембран (DRM) [25].
DRM представляют собой разновидность рафтов, и их выделение является одним из наиболее широко используемых методов изучения липидных микродоменов. Метод, основанный на получении DRM, позволяет идентифицировать ассоциацию с рафтами различных белков и липидов.
Однако, несмотря на преимущества, этот метод имеет ряд ограничений. А, именно: рафтовые белки могут быть ассоциированы с цитоскелетом и, как следствие этого, после детергентной экстракции не попадать во фракцию DRM. Изменения в условиях экстракции может приводить к совершенно различным результатам [80,81,82]. Кроме того, в некоторых случаях ассоциация белка с рафтом может быть настолько слабой, что при действии детергента происходит его частичная солюбилизация из микродомена, и таким образом это может приводить к некоторой недооценке ассоциации с рафтами белков и липидов [29,83].
В ранней литературе использование детергентной обработки для изучения рафтов вызывало некоторое беспокойство. Усиленно дискутировался вопрос об эквивалентности выделенных детергент-резистентных мембранных фракций и липидных рафтов in vivo. Некоторые авторы полагали, что сами биохимически выделенные рафтовые фракции или ассоциация специфических белков с этими фракциями является детергент-индуцированным артефактом [77,84,85].
Впоследствии, когда появились методы изучения липидных рафтов без использования детергентной обработки клеток, было реально доказано, что липидные рафты являются физиологически значимыми мембранными компартментами, которые существуют в интактных клетках до детергентной обработки [28].
Одним из наиболее распространенных методов изучения рафтов без использования детергента является иммунофлуоресцентная микроскопия. Этот подход включает в себя кросс-линкирование рафтовых антигенов с помощью соответствующих лигандов, что приводит к коалесценции рафтов до размеров видимых в микроскоп. Далее компоненты липидных микродоменов визуализируют посредством иммунофлуоресцентного окрашивания и конфокальной микроскопии [81].
Особенность данной методики заключается в том, что она позволяет определять даже слабые ассоциации молекул с липидными рафтами.
В своей работе Harder et al. [78] кросс-линкировали некоторые GPI-заякоренные белки, трансмембранные белки, рафтовый ганглиозид GM1 и определяли локализацию рафтовых компонентов, используя иммунофлуоресцентную микроскопию. Авторами было показано, что GPI-заякоренные белки, такие как PLAP (плацентарная щелочная фосфатаза), Thy-1 (CD90) и НА, трансмембранный белок, обнаруженный в детергент-резистентных мембранах, солокализовались с рафтовым маркером GM1, что указывало на ассоциацию данных молекул с рафтами. Напротив, для трансферринового рецептора (CD71), обнаруживаемого в детергент-солюбилизируемой фракции, солокализации с рафтовыми компонентами не наблюдалось.
Одним из успешных подходов, используемых для изучения рафтов, является изменение липидного состава микродоменов, путем: 1). Разрушения рафтов, посредством удаления холестерина [86]; 2). Нарушения стабильности рафтов при экзогенном введении ганглиозидов [87] и полиненасыщенных жирных кислот [88].
Использование данного подхода позволяет оценить вклад каждого из перечисленных компонентов в формирование структуры липидного микродомена. В частности, некоторые работы полностью подтверждают заключение о том, что именно насыщенные жирнокислотные остатки ответственны за сродство белков к рафтам. Так, например, было показано, что введение в мембрану полиненасыщенных жирных кислот приводит к замене насыщенных жирнокислотных остатков на ненасыщенные в ацилированных белках, что в конечном итоге приводит к диссоциации этих белко в из липидных микродоменов [88]. Встраивание ганглиозидов в мембрану клетки также вызывает выход рафтовых белков из микро доменов [87].
Некоторые данные о структуре рафтов были получены при использовании методики химического кросс-линкирования белков [73]. Данный метод позволяет идентифицировать белковые комплексы в нативных рафтах.
В частности, Friedrichson et al показали, что обработка интактных клеток химическими перекрестно-сшивающими агентами приводила к образованию олигомеров GPI-заякоренной формы рецептора гормона роста. Полученные кластеры включали в себя около 15 молекул. Удаление с клеточной поверхности холестерина, способствующее экстракции рафтовых белков и изменению морфологии кавеол, разрушало отмеченную кластеризацию GPI-заякоренной формы рецептора и предотвращало образование олигомеров [73]. Необходимо подчеркнуть, что при тех же условиях кросс-линкирование трансмембранной формы изучаемого рецептора не приводило к его кластеризации.
Микроскопия слежения за отдельным флуорохромом применяется для наблюдения за латеральной подвижностью отдельной молекулы или небольшой группы молекул, меченных частицами коллоидного золота или флуорохромом. Эта методика также нашла свое применение в изучении липидных микродоменов. Так, например, было обнаружено существование подвижных, ограниченных зон -200-300 нм в диаметре, в которых локализованы GPI-заякоренный белок Thy-І и рафтовый маркер-ганглиозид GM1 [89]. Количество и размер этих зон уменьшается, когда синтез гликосфинголипидов метаболически ингибируется. Кроме того, было показано, что фосфолипидный аналог фосфатидилэтаноламина, меченный FITC, у которого все жирнокислотные остатки являются насыщенными, также локализован в этих ограниченных зонах.
Сравнение детергентной резистентности поверхностных антигенов на различных мишенях
Мононуклеары периферической крови человека от здоровых доноров выделяли центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографин (р= 1,077) (Sigma,CIJIA). В данной работе были использованы следующие клеточные линии: К-562, KG-la, ТНР-1, U-937, СЕМ, HUT-78, Nalm-6, Daudi, IM-9, Ramos и Raji. Клеточные линии поддерживали культивированием в среде RPMI 1640 (Пан Эко, Москва) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. (ICN, Pharmaceuticals, Costa Mesa, СА). Источником тимоцитов служили фрагменты тимуса, удаляемые во время операций на сердце. Суспензию тимоцитов получали с помощью гомогенизатора из измельченных фрагментов тимуса.
Большинство моноклональных антител (МкАт), использованных в данной работе, были получены в лаборатории иммунохимии Института иммунологии Минздрава России. Некоторые МкАт были получены в рамках Международных рабочих совещаний по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека. Биотинилированные МкАт были получены в лаборатории иммунохимии Института иммунологии Минздрава России.
В качестве вторичных антител, меченных FITC, использовались либо F(ab)2 фрагменты бараньих антител против IgG мыши (Sigma, США), либо козьи антитела против IgM мыши (Sigma, США). Для трехстадийного окрашивания в настоящей работе использовались RAM (кроличьи антитела против IgG мыши) (Miles), а также GAR (козьи антитела против IgG кролика), меченные TRITC (Sigma, США). 2.1.3. Растворы, использованные в работе.
Детергенты: Tween 20 (Ferak, Германия), Tween 80 (Serva, Германия), Brij 35 (Serva, Германия), Brij 58 (Sigma, США), Brij 96 (Fluka, Швейцария), CHAPS (Sigma, США), Тритон X-114 (Ferak, Германия), NP- 0 (нонидет P-40) (CALBIOCHEM corp.), октилглюкозид (Sigma, США), бычий сывороточный альбумин (марка Б, Реахим), метил-Р-циклодекстрин (Sigma, США), фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (Sigma, США), DMSO (диметилсульфоксид) (Sigma, США), проназа (протеаза Р5147, Sigma,CIIIA), изопропанол (Serva, Германия), азид натрия (Sigma, США), трипановый синий (CHEMAROL, Чехия), конканавалин A (Sigma, США), эозин калия (Sigma, США), фаллоидин, меченный TRITC ( Sigma, США), стрептавидин (Amersham, Великобритания), цитохалазин Б (Sigma, США), стрептавидин, меченный СуЗ, стрептавидин, меченный фикоэритрином (Sigma, США).
Экстракция клеток раствором неионного детергента ТХ-100 Осадок, содержащий 10 клеток, ресуспендировали в 1 мл холодного 1% лизирующего буфера. Для предотвращения протеолитического расщепления в лизирующий буфер добавляли 1 мМ PMSF (ингибитор сериновых протеиназ). Лизис клеток проводили в течение 30 мин при температуре 4С. Затем экстрагированные клетки фиксировали 10-кратным избытком холодного 1% раствора параформальдегида в течение 30 мин при 4 С. Клеточные остатки, представляющие собой продукт экстракции клеток в детергенте, собирали центрифугированием при 1700 х g в течение 10 мин.
В данной работе использовались следующие детергенты: серии тритонов (NP-40, ТХ-114); серии твинов (Tween20, Tween80), серии Brij (Brij35, Brij58, Brij96), а также в CHAPSe (соль желчной кислоты) и в октилглюкозиде. Методика экстракции аналогична предыдущей, за исключением того, что в качестве лизирующих буферов использовались 1% растворы соответствующих детергентов в PBS.
К осадку, содержащему 0,5 х 106 клеток или клеточных остатков, добавляли 25 мкл МкАт и инкубировали при 4 С в течение 30 мин. Затем клетки или клеточные остатки дважды отмывали в растворе PBS центрифугированием при 320 х g в течение 5 мин или при 1700 х g в течение 10 мин, соответственно. Далее клетки или клеточные остатки окрашивали FITC-меченными вторичными антителами. Несвязавшиеся антитела дважды отмывали в растворе PBS. Полученные образцы клеток и клеточных остатков анализировали на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson Biosciences Immunocytometry Systems).
Клетки (0,5 х 106) обрабатывали проназой в концентрации 0,4 мг/мл в течение 45 мин при 26 С. Инкубацию проводили при постоянном перемешивании. Реакцию останавливали добавлением 2,5% раствора BSA в PBS. Далее клетки выдерживали в 1% растворе BSA в PBS, содержащем 0,1 мМ PMSF (растворитель: изопропанол) в течение 10 мин при С. Обработанные таким образом клетки дважды отмывали в PBS, окрашивали антителами и анализировали на проточном питометре.
Осадок клеток в концентрации 10 кл/мл инкубировали с ЮтМ метил-Р-циклодекстрином (метил-р-циклодекстрин растворяли в PBS) в течение 20 минут при 37С, периодически встряхивая. Обработанные клетки отмывали в PBS, окрашивали соответствующими антителами и анализировали на проточном цитометре.
Маточный раствор цитохалазина Б в DMSO (диметилсульфоксиде) хранили при -20 С. Осадок, содержащий 106клеток, инкубировали с цитохалазином Б, имеющим концентрацию 10мкг/мл. Инкубация проводилась при температуре 3(Е в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Затем клетки дважды отмывали в PBS, окрашивали соответствующими антителами и анализировали на проточном цитометре.
Определение локализации ТХ-100 резистентных антигенов лейкоцитов человека
Чтобы доказать, что поверхностный антиген действительно переходит в детергент-несолюбилизируемую форму и исключить вклад возможных артефактов, мы анализировали несолюбилизируемость молекулы sIgM в тех случаях, когда индукция и детекция осуществлялась разными антителами.
Предобработка клеток линии Ramos напрямую индуцирующими МкАт СН2 и LT20 приводила к переводу соответственно sIgM и CD20 молекул в ТХ-100 нерастворимое состояние, что хорошо видно при окрашивании полученных клеточных остатков FITC меченными поликлональными бараньими антителами против Ig мыши (верхний ряд панелей на рис.20).
Коиндукция ТХ-100 резистентности различных антигенов. Ramos клетки были предобработаны "индуцирующими" анти-sIgM СН2 (левый ряд) и анти-СБ20 LT20 (правый ряд) антителами или "неиндуцирующим" анти-IgM МА2 (средний ряд) антителом. Затем клетки были экстрагированы в ТХ-100 и окрашены проявляющими FITC-меченными антителами. MFI показана в верхнем правом углу каждой панели. Клеточные остатки, полученные из нативных клеток линии Ramos, предобработанных напрямую индуцирующим МкАт СН2, окрашивались антителами MA2-FITC и Rs4-FITC, реагирующими с лямбда цепью и Fab фрагментом slgM, соответственно, но не с антителами посторонней специфичности LT20-FITC или LT45 FITC. Естественно, что предварительная обработка клеток Ramos неиндуцирующими антителами МА2 и Rs4 не приводила к какому-нибудь заметному превышению связывания FITC-меченных антител с остатками по сравнению с остатками, полученными из необработанных клеток. Полученный результат убедительно доказывает то, что slgM действительно переходит в форму, устойчивую к экстракции в Тритоне Х-100. Когда клеточные остатки получали из нативных клеток линии Ramos, предобработанных напрямую индуцирующим антителом LT20 (CD20), то они не окрашивались ни антителом LT45-FITC, ни антителами MA2-FITC и Rs4-FITC. Это свидетельствует о том, что переход антигена CD20 в форму нерастворимую в ТХ-100 не препятствует экстракции детергентом других антигенов, таких как CD45 и slgM.
Важно отметить, что индукция резистентности к действию Тритона Х-100 являлась антиген специфической. Таким образом, проведенные эксперименты исключают возможность артефактов, которые могут возникать при детергентной обработке, неспецифическом связывании антител и др.
Антигены, находясь на поверхности клетки, взаимодействуют между собой и образуют агрегаты и макромолекулярные комплексы. При некоторых условиях, например, при лизисе в мягких детергентах данные комплексы можно выделить в интактном виде. Возникает вопрос, сохраняется ли ассоциация между молекулами, ассоциированными на мембране, если одна из них переходит в детергент-устойчивую форму. Для проверки этого предположения нами были проведены эксперименты с антигенами CD20 и HLA-DR. Известно, что антигены CD20 и HLA-DR ассоциированы на мембране. Как указывалось ранее, обработка анти-СБ20 антителом переводит антиген CD20 в детергент-несолюбилизируемую форму. Можно предположить, что молекулы, тесно ассоциированные на мембране, будут переходить в детергент-устойчивую форму вслед за индуцированным антигеном. Однако нами было обнаружено, что при трансформации CD20 в несолюбилизируемую форму не наблюдалось увеличения резистентности к действию ТХ-100 антигена HLA-DR. Таким образом, коиндукции между антигенами CD20 и HLA-DR не наблюдалось.
Анализ антитело-опосредованной резистентности.
При обработке моноклональным антителом антиген CD20 переходит в форму, устойчивую к действию Тритона Х-100. Как было обнаружено ранее, антиген CD48 проявляет высокую резистентность к действию этого детергента, что является следствием ассоциации данного антигена с мембранными микродоменами.
Чтобы проанализировать, с чем связана антитело-опосредованная резистентность к действию ТХ-100, мы проверили, наблюдается ли солокализация антигена CD48 и ставшего резистентным под действием антитела антигена CD20.
Был проведен следующий эксперимент: клетки сначала окрашивались антителом анти-СБ20, меченным FITC, затем антителом анти-С048, меченным СуЗ. Далее клетки лизировались в растворе ТХ-100. Детекция осуществлялась с помощью конфокальной микроскопии. Результаты приведены на рисунке 21.
Окрашивание клеток антителом CD20, меченным FITC, демонстрирует распределение в виде пэтчей на поверхности плазматической мембраны экстрагируемых клеток. При окрашивании предобработанных клеточных остатков антителом CD48, меченным СуЗ, также наблюдалось пэтчинговое распределение антигена. Из рисунка видно, что CD20 и CD48 концентрируются в одних и тех же областях мембраны экстрагированных клеток, что указывает на совместную локализацию этих антигенов на поверхности клеточных остатков.
Следовательно, антиген CD48, обладающий конститутивной ТХ-100 резистентностью, и антиген CD20 с ТХ-100 резистентностью, приобретенной под действием МкАт, локализуются в одних и тех же участках мембраны. Таким образом, при антитело-индуцированной ТХ-100 резистентности антиген CD20 транслоцируется из солюбилизируемых областей мембраны в ТХ-100 резистентные.
