Введение к работе
Актуальность темы. Подкласс диффузных болезней соединительной ткани (ДБСТ) включает группу нозологических форм, характеризующихся системным типом воспаления различных органов и систем, сочетающимся с развитием аутоиммунных и иммунокомплексньгх процессов, а также избыточным фиброзообразованием [Насонова В А, 1989] К данному подклассу относятся такие распространенные заболевания как системная красная волчанка (СКВ), синдром Шогрена (СШ), системная склеродермия (СС), смешанное заболевание соединительной ткани (СЗСТ)
Обычное клинико-лабора горное обследование и инструментальные исследования в большинстве случаев не позволяют подтвердить диагноз ДБСТ, и именно иммунологическое обследование помогает в объективизации диагноза Важность его применения можно подчеркнуть тем, что иммунологические показатели составляют 2 из 11 критериев, используемых для постановки диагноза СКВ [Tan ЕМ, 1982] Также велика роль иммунологического обследования при необходимости дифференциальной диагностики близких нозологических форм и других заболеваний с воспалительной симптоматикой
Основным иммунологическим феноменом, характерным для ДБСТ, является присутствие в сыворотке крови больных антинуклеарных антител Антинуклеарные антитела (AHA) представляют собой семейство из более чем 100 аутоантител, направленных против нуклеопротеиновых и белковых компонентов ядра и цитоплазмы клетки [Bradwell А, 2003] Разнообразные методы используются в клинической практике для выявления лишь 20 из них Хотя клиническое применение конкретных показателей исследовано сравнительно хорошо, однако четких рекомендаций о последовательности использования различных тестов, комбинации тестов, а также о предпочтительных методах выявления аутоантител не разработано Это затрудняет иммунологическую диагностику системных заболеваний и требует выработки клинически обоснованного алгоритма диагностики
Апоптоз клеток кожи и лимфоцитов периферической крови, по всей видимости, представляет основной источник антигенного материала при СКВ и является основным механизмом индукции AHA [Carciola-Rosen LA, 1994] Нарушение клиренса иммунных комплексов рассматривается в качестве основного механизма патогенеза СКВ
Классическая иммунологическая теория указывает на то, что продукция антител, в том числе аутоантител, контрошгруется и управляется соответствующими цитокинами В то же время, экспериментальные исследования показали, что сыворотка больных СКВ способна индуцировать синтез цитокинов, в том числе IL-ip, EL-8, ГЬ-Ю и TNF-a в культурах моноігуклеаров периферической крови [Ronnelid J, 2003] Этот механизм опосредован FcyRs, что позволяет рассматривать иммунные комплексы (ИК), содержащие аутоантитела, в качестве одной из причин увеличения продукции цитокинов
Кроме того, современные исследования указывают на то, что не только иммуноглобулины в составе ИК имеют иммуномодулирующую функцию, но и аутоантигены, прежде всего содержащие нуклеиновые кислоты, стимулируют клетки иммунной системы и индуцируют иммунные ответы, включая синтез провоспалительньгх цитокинов Этот механизм опосредован связыванием ДНК- и РНК- содержащих аутоанигенов в составе ИК с Toll like receptors (TLR), в частности TLR 7/9, на поверхности агшгегагрезентирующих клеток [Chnstensen S R., 2007]
Цель работы. Цель настоящего исследования состояла в изучении роли цитокинов и аутоантител в патогенезе и диагностике диффузных болезней соединительной ткани
Для достижения этой цели были поста&тены следующие задачи
-
Оптимизировать метод определения антинуклеарных антител с использованием в качестве субстрата клеточной линии НЕр-2
-
Изучить изолировашгую встречаемость и сочетанную встречаемость аитинуклеарного фактора, антител к двуспиралыюй ДНК, антител к экстрагируемому нуклеарному антигену и антител к кардиолипину у больных с подозрением на диффузные болезни соединительной ткани
-
Изучить клиническое значеіше выявление аитинуклеарного фактора, антител к двуспиралыюй ДНК и антител к кардиолипину при системной красной волчанке
-
Изучить клиническое значение выявления антинуклеарного фактора, криоглобулинов с активностью ревматоидного фактора, ангител к альфа-фодрину у больных синдромом Шогрена
-
Изучить клинико-патогенетическое значение определения цитокинов у больных с системной красной волчанкой и роль иммунологических показателей для оценки клинической активности заболевания у больных системной красной волчанкой
5 6 Разработать алгоритмы поэтапного, комплексного обследования пациентов с диффузными болезнями соединительной ткани
Научная новизна. В данной работе была впервые определена сочетанная встречаемость широкого спектра антинуклеарных антител в популяции больных диффузными болезнями соединительной ткаїш Санкт-Петербурга и Ленинградской области
Впервые была проанализирована диагностическая значимость панели тестов, включающих определение антинуклеарного фактора, антител к экстрагируемому нуклеарному антигену, антител к двуспиралыюй ДНК, антител к кардиолипину, что позволило определить их место в диагностике диффузных болезней соединительной ткани На основании полученных данных бьши разработаны диагностические алгоритмы использования лабораторных методов выявления аутоантител для диагностики диффузных болезней соединительной ткани
Бьша разработана модификация метода культивирования эпителиоидной клеточной линии аденокарциномы гортани человека НЕр-2 в лунках предметного стекла для определения антинуклеарного фактора
В результате применения метода мультиплексного анализа содержания цитокинов в сыворотке больных системной красной волчанкой была установлена взаимосвязь продукции цитокинов и повышения концентрации аутоантител в сыворотке больных системной красной волчанкой
Практическая значимость работы. В ходе работы бьша разработана, апробирована и внедрена в лабораторную практику панечь тестов, выявляющая антинуклеарный фактор, антитела к двуспиральной ДНК, антитела к экстрагируемым нуклеарным антигенам, антитела к кардиолипину Впервые в России были разработаны стандартные протоколы доаналитического, аналитического и постаналитического определения антинуклеарного фактора на клеточной линии НЕр-2
Бьша разработана программа внешнего контроля качества определения антинуклеарных антител, которая с 2006 года внедрена в Федеральную систему внешней оценки качества клинических лабораторных исследований
При анализе сочетанной встречаемости антинуклеарного фактора, антител к двуспиральной ДНК и антител к кардиолипину было установлено, что изолированно антитела к кардиолипину встречаются только в 0,6% случаев Установлено, что
6 повышение уровня патологии до 50 МЕ/мл при определении антител к двуспиральнои ДНК позволяет увеличить специфичность обследования до 95%
Теоретическая значимость работы. В ходе работы удалось показать взаимосвязь между продукцией цитокинов и содержанием аутоаитител в сыворотке больных системной красной волчанкой
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Повышение продукции цитокинов у больных с системной красной волчанкой связано с увеличением уровня аутоантител, что указывает на патогенетическую взаимосвязь этих иммунологических феноменов
-
Иммунологическое обследование больных с подозрением на диффузные болезни соединительной ткани должно быть этапным и комплексным, с использованием в качестве скриниговых тестов сочетанного определения антинуклеарного фактора и антител к экстрагируемому нуклеарному антигену, а в качестве подтверждающих тестов определение антител к двуспиральнои ДНК, антител к рибонуклеопротеиновым антигенам и антител к кардиолипину
-
Объем лабораторного иммунологического обследования больных с системной красной волчанкой включает определение антинуклеарного фактора, антител к двуспиральнои ДНК и антител к кардиолипину для проведения дифференциальной диагностики с диффузными болезнями соединительной ткани, определение теста волчаночной полоски для дифференциальной диагностики кожных и системных форм волчанки, определение концентрации IL-6, уровня антинуклеарного фактора и антител к двуспиральнои ДНК для мониторинга активности заболевания
Личный вклад автора в проведение исследования Данные, представленные в работе, получены лично автором Автором выполнены все этапы стандартизации тестов для выявления антинуклеарного фактора и антител к двуспиральнои ДНК методом непрямой иммунофлюоресценции Автором бьша проведена оценка наличия криоглобулинов с активностью ревматоидного фактора в сыворотке больных синдромом Шогрена, исследование материала биопсии кожи методом прямой иммунофлюоресценции Серологическое обследование образцов на наличие антител к двуспиральнои ДНК, кардиолипину, экстрагируемому нуклеарному антигену методом иммуноферментного анализа, измерение концентрации цитокинов производилось сотрудниками НМЦ по молекулярной
7 медицине СПбГМУ им акад И.П Павлова Клиническое обследование пациентов с ДБСТ и группы контроля производилось сотрудниками отделения ревматологии Ленинградской областной клинической больницы, городской больницы № 25 г Санкт-Петербурга, сотрудниками клиники кожных болезней СПбГМУ им акад И П Павлова, а также сотрудниками Российского НИИ гематологии и трансфузиологии Росздрава
Реализация работы.
Тесты по выявлению антинуклеарного фактора, методы определения специфичности антинуклеарных антител, иммунофлуоресцентное исследование биоптатов кожи внедрены в практическую диагностическую работу клиник СПбГМУ им акад ИП Павлова, и доступны для пациентов лечебно-профилактических учреждений Санкт-Петербурга и Ленинградской области
Апробация работы.
Основные положения диссертациошюго исследования были доложены на VII, УШ, IX и X Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003, 2004, 2005, 2006), XIth International Student Congress of Medical Sciences (Гронинген, 2004), IV и V конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа (2004, 2005), 7Ш John Humphrey Advanced Summer programme in immunology (Москва, 2005), на межвузовской конференции Общества Молодых Ученых СПбГМУ им акад ИП Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения — 2005», заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества иммунологов (2007)
Объем и структура работы.
