Введение к работе
Актуальность проблемы
Традиционным методом обнаружения хромосомных аберраций при лейкозах является цитогенетический метод дифференциальной G-окраски хромосом в метафазных пластинках [Seabright М., 1971]. Данный метод стал широко применяться в мировой практике с 70-х годов и в настоящее время продолжает играть ведущую роль в генетическом анализе опухолевых клеток. Наличие той или иной аномалии кариотипа позволяет судить о степени злокачественности опухоли (низкая, средняя, высокая) и, в соответствии с этим, назначать адекватное лечение и прогнозировать эффективность терапии [Румянцев А.Г., Самочатова Е.В., 1995; Walker Н. et al.,1994; Martinez-Climent J.A., 1997]. Однако эффективность цитогенетического метода ограничена возможностями светового микроскопа. Кроме того, в некоторых случаях по ряду причин не удается получить качественных препаратов метафазных пластинок [Roony E.D., Czepulkowski В.Н., 1986].
Успехи в области лечения лейкозов во многом обусловлены бурным развитием молекулярной генетики. Классический цитогенетический метод подготовил почву для расшифровки молекулярной структуры генной патологии опухолевых клеток, а изобретение метода полимеразной цепной реакции (ПІДР) K.Mullis в 1986 году открыло перспективу широкого внедрения методов молекулярной диагностики в различные отрасли медицины. Область применения методов молекулярно-генетического анализа постоянно расширялась и охватывает в настоящее время диагностику ряда наиболее актуальных бактериальных и вирусных инфекций, идентификацию личности в судебной медицине, генную инженерию, HLA-типирование, молекулярную диагностику наследственных заболеваний, а также повреждений генома, приводящих к злокачественной трансформации клеток [McPherson M.J. et al., 1992].
С изобретением ПЦР онкогематологи получили возможность пользоваться высокочувствительной молекулярно-генетической технологией для скринингового обследования больших групп больных на наличие генетических аномалий в опухолевых клетках. Однако, до недавнего времени возможности применения ПЦР в этой области ограничивались выявлением нескольких, относительно редко встречающихся хромосомных аберраций. В последнее время, в связи с расшифровкой молекулярных механизмов большинства часто встречающихся хромосомных аберраций и открытием криптической транслокации t(12;21), диагностический потенциал молекулярно-генетических методов существенно возрос [Shurtleff S.A. et al., 1995]. В
течение 10 лет область применения молекулярных методов диагностики в онкогематологии расширилась от единичных исследовательских работ до образования отдельного научного направления и, с другой стороны, до признания необходимости скорейшего их внедрения в практику [Melo J.etal., 1996].
Принцип ПЦР-диагностики хромосомных аберраций заключается в
использовании праймеров (олигонуклеотидных затравок),
комплементарных нуклеотидным последовательностям, которые в норме располагаются на различных хромосомах, а в результате транслокации формируют единый гибридный (химерный) ген. Разрывы генов при транслокациях происходят в интронах, причем локализация точек разрыва может варьировать. Область гена, в которой наиболее часто обнаруживаются разрывы при транслокациях, называют "кластером точек разрыва". После вырезания интронов в продуктах транскрипции химерных генов стыкуются экзон, расположенный перед кластером разрывов на одной хромосоме, и первый экзон, расположенный в 3' направлении от точки разрыва на другой хромосоме. Непостоянство локализации точек разрыва внутри одного интрона не влияет на структуру продукта транскрипции, поэтому объектом исследования для ПЦР-диагностики тракслокаций служит кДНК, полученная с помощью реакции обратной транскрипции (ОТ) химерной мРНК [Yamamoto К. et al., 1994].
В настоящее время описаны хромосомные аберрации, в которые вовлекаются практически все хромосомы. Из них 5 встречаются наиболее часто при остром лимфобластном лейкозе у детей (ОЛЛ): t(9;22), t(4;ll), t(l;19), t(8;14) и t(12;21) [Kobayashi H., 1994]. Четыре аберрации с высокой частотой обнаруживаются при остром нелимфобластном лейкозе (ОНЛЛ): t(8;21), t(15;17), inv(16) и t(9;ll). Транслокация t(9;22) является генетическим маркером хронического миелолейкоза (ХМЛ) [Rowley J.D., 1973].
При наличии в лаборатории полного набора праймеров, с помощью ПЦР в настоящее время можно обнаруживать хромосомные аберрации более чем у 30% больных с острым лейкозом, а также у подавляющего большинства больных ХМЛ.
При этом, однако, неизбежно возникает вопрос об экономической целесообразности и практической значимости внедрения методов молекулярной диагностики хромосомных аберраций в клиническую онкогематологию на современном этапе. Следует учитывать тот факт, что доля большинства из известных в настоящее время аберраций в общей структуре хромосомной патологии при лейкозах составляет 1 -2%, и их изучение остается предметом академической науки. В то же время, круг аберраций, действительно актуальных для решения практических задач, связанных с диагностикой, лечением и прогнозом течения лейкоза у детей, может быть ограничен следующими:
l)t(9;22)(q34;qll) - показание к назначению лечения по протоколу высокого риска и трансплантации костного мозга при ОЛЛ; дифференциальная диагностика ХМЛ [Schlieben S. et al., 1996];
2)t(4;ll)(q21;q23) - низкий индекс выживаемости пациентов (0,2-0,3), и, следовательно, показание к назначению лечения по протоколу высокого риска и трансплантации костного мозга [Heerema N.A. et al., 1994];
-
t(12;21)(pl3;q22) - самая часто встречающаяся транслокация при В-линейном ОЛЛ у детей (20%); хороший ответ на терапию, 100% выход больных в ремиссию, благоприятный прогноз [Shurtleff S.A. et al., 1995];
-
t(15;17)(q22;q21) - около 100% случаев острого промиелоцитарного лейкоза (ОПМЛ), хороший ответ на лечение транс-ретиноевой кислотой [Huang М-Е. et al., 1988].
Следует отметить, что несмотря на большое количество работ, посвященных использованию методов молекулярной диагностики хромосомных аберраций у больных лейкозом, прикладные аспекты их использования для комплексной диагностики актуальных хромосомных аберраций в клинической практике до настоящего времени не получили должного освещения.
Цель работы
Разработка и внедрение в практику новых методов молекулярной диагностики и прогноза течения лейкозов у детей на основе анализа цитогенетических и молекулярно-генетических особенностей опухолевых клеток.
Основные задачи исследования
1.Анализ частоты встречаемости, оценка диагностической, прогностической значимости и особенностей аномалий кариотипа у детей, больных лейкозом, из Уральского региона России.
2.0тработка и внедрение в практику полимеразной цепной реакции для выявления наличия актуальных транслокаций t(4;ll), t(9;22), t(12;22) и t(15;17) в образцах костного мозга и крови у больных лейкозом и анализ клинико-лабораторных и молекулярных изменений у пациентов с выявленными хромосомными аберрациями для установления прогноза течения заболевания.
З.Оптимизация протоколов постановки ПЦР для обнаружения химерных продуктов опухолевых клонов при хроническом миелолейкозе.
4. Разработка и внедрение в практику метода количественного ПЦР-мониторинга концентрации химерных транскриптов у больных
хроническим миелолейкозом, получающих поддерживающую терапию, для ранней диагностики бластного криза.
Научная новизна
Впервые проведен анализ аномалий кариотипа опухолевых клеток и выявлены некоторые особенности в распределении хромосомных аберраций у детей, больных лейкозом, из центрального и южного регионов Урала России.
Впервые выявлено 3 случая острого лимфобластного лейкоза у детей, ассоциированного с делецией длинного плеча 4 хромосомы.
Впервые установлена высокая частота развития поздних рецидивов у больных с В-линейным t(12;21) - позитивным острым лимфобластным лейкозом.
Впервые описан случай Т-линейного острого лимфобластного лейкоза, ассоциированного с транслокацией t(12;21).
Впервые описан случай Ph-позитивного BCR/ABL-негативного периода у ребенка с хроническим миелолейкозом.
Впервые обнаружены волнообразные колебания уровня экспрессии химерного BCR/ABL гена у детей, больных хроническим миелолейкозом, на фоне лечения интерфероном.
Показана необходимость использования для ПЦР-диагностики минимальной резидуальной болезни специфического 3' праймера на стадии обратной транскрипции.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Выявлены некоторые особенности патологии кариотипа опухолевых клеток у детей, больных острым лейкозом, из Уральского региона России. В группе больных острым лимфобластным лейкозом преобладают пациенты (63%) с кариотипом, ассоциированным с очень хорошим и относительно благоприятным прогнозом (гипердиплоидный п>50 и диплоидный набор хромосом, соответственно), в то время как частота встречаемости аберраций, связанных с высокой степенью злокачественности опухолевых клеток -t(4;l 1), t(9;22), der(l l)(q23) - оказалась достаточно низкой (11,6%). У больных с острым нелимфобластным лейкозом отмечена высокая частота (21%) обнаружения t(15;17).
-
Использование, наряду с цитогенетическим методом, молекулярно-генетического анализа позволяет существенно повысить эффективность диагностики. Панель праймеров должна быть
рассчитана на обнаружение с помощью ПЦР по крайней мере четырех аберраций, наличие которых может помочь клиницисту в выборе стратегии лечения и определении прогноза течения заболевания: t(4;ll),t(9;22),t(12;21)Ht(15;17).
-
Наличие в опухолевых клетках при В-линейном остром лимфобластном лейкозе критической транслокации t(12;21) ассоциировано с хорошим ответом на химиотерапию и быстрым выходом больных в стойкую ремиссию. Однако для этой группы пациентов существует высокая вероятность развития позднего рецидива заболевания, что служит основанием для увеличения срока мониторинга минимальной резидуальной болезни с 2 - 3 до 5 - 6 лет.
-
У детей, больных хроническим миелолейкозом, на фоне лечения интерфероном наблюдаются волнообразные изменения концентрации BCR/ABL транскриптов в костном мозге и крови, что связано, по-видимому, с изменением уровня экспрессии химерного гена. Наличие BCR/ABL-негативного периода в хронической фазе заболевания не может быть интерпретировано как однозначно позитивный прогностический фактор.
-
При диагностике минимальной резидуальной болезни следует учитывать вероятность крайне малого числа опухолевых клеток в исследуемом образце костного мозга и низкого уровня экспрессии химерного гена в период ремиссии. В этих условиях необходимо использование максимально чувствительного варианта ОТ-ПЦР, что достигается применением на стадии обратной транскрипции специфического внешнего 3' праймера. Данная модификация протокола ОТ-ПЦР позволяет на порядок повысить чувствительность реакции и эффективность диагностики минимальной резидуальной болезни.
Практическая значимость работы
Применение ПЦР повышает эффективность лабораторных методов обследования при лейкозах у детей, позволяет осуществлять раннее выявление актуальных хромосомных аберраций и диагностику минимальной резидуальной болезни.
Рекомендована оптимальная схема работы клинической лаборатории молекулярной диагностики в структуре детского онкогематологического центра, включающая в себя скрининговое обследование всех первичных больных острым лимфобластным лейкозом на наличие транслокаций t(9;22) и t(12;21) и выборочное обследование на наличие транслокации t(4;ll). У пациентов с острым промиелоцитарным лейкозом (МЗ) необходимо определять наличие PML/RARA транскриптов до начала и после окончания протокола
лечения. Больные, поступающие с диагнозом хронический миелолейкоз, нуждаются в обследовании на наличие BCR/ABL транскриптов с разрывом в области M-bcr.
Разработанный метод количественного ПЦР-анализа химерных BCR/ABL транскриптов позволяет осуществлять раннюю диагностику бластного криза у больных хроническим миелолейкозом.
Проведенные исследования позволяют рекомендовать для использования отечественное оборудование и реактивы для проведения ПЦР, что существенно снижает стоимость анализов, не отражаясь на качестве получаемых результатов.
Практическое внедрение полученных результатов
ПЦР-диагностика актуальных транслокаций при лейкозах внедрена в работу Межрегионального детского онкогематологического центра Областной детской клинической больницы №1, отделений гематологии Областной клинической больницы №1 и Городской больницы №7 г.Екатеринбурга.
Апробация работы
Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики Межрегионального детского онкогематологического центра Областной детской клинической больницы №1 г.Екатеринбурга.
Основные материалы диссертации доложены на итоговых научных конференциях Уральской государственной медицинской академии (1995,1996), на III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996), на научно-практических конференции специалистов Детских онкогематологи-ческих центров России и стран СНГ (Ростов, 1996, Москва, 1997, Екатеринбург, 1998), на 1-м Международном конгрессе по молекулярной медицине (Берлин, 1997), на 2-й Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения заболеваний" (Москва, 1998), на Уральской региональной конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных и онкологических заболеваний" (Екатеринбург, 1998), на международном семинаре "Диагностика и лечение лейкозов у детей" (Гиссен, 1998).
Публикации
Основное содержание работы отражено в 18 публикациях.
Объем и структура диссертации
