Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Растворимые формы дифференцировочных антигенов 10
Характеристика антигенов главного комплекса гистосовместимости человека 12
Комплекс HLA I класса - р2-микроглобулин 12
HLA II класса 17
1.3. Характеристика антигенов межклеточной адгезии 20
Характеристика CD54 антигена (ICAM-1) 21
Характеристика CD50 антигена (ICAM-3) 24
Характеристика CD38 антигена 27
Характеристика CD25 антигена 31
Характеристика CD95 (Fas/Apo-1) антигена 32
Растворимые формы мембранных антигенов крови человека при ВИЧ-инфекции 35
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
Исследуемые образцы и объем наблюдений 44
Используемые моноклональные антитела 45
Получение козьих поликлональных антител, специфичных к поверхностным антигенам мононуклеарных клеток крови человека 47
Перийодатный метод синтеза конъюгата 47
Иммуноферментные методы определения растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы 48
Статистическая обработка данных 53
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 54
Разработка и апробация иммуноферментного метода выявления растворимой формы HLA-DR антигена 54
Анализ распространенности сопутствующих инфекций у ВИЧ-инфицированных лиц 66
Исследование содержания растворимых форм антигенов главного комплекса гистосовместимости I и II классов при ВИЧ-инфекции 69
Исследование содержания растворимых форм молекул адгезии
при ВИЧ-инфекции 82
Исследование сывороточного содержания растворимых форм CD95 (Fas/APO-1) антигена 96
Исследование содержания растворимой формы CD25 антигена . 102
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
ВЫВОДЫ 115
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 116
4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
ИФА - иммуноферментный анализ
МКА - моноклональные антитела
ПХ - пероксидаза хрена
ПЦР - полимеразная цепная реакция
CMV - cytomegalovirus (цитомегаловирус)
HBV - hepatitis В virus (вирус гепатита В)
HCV - hepatitis С virus (вирус гепатита С)
HGV - hepatitis G virus (вирус гепатита G)
OD - optical density (оптическая плотность)
sCD25 - растворимая форма CD25 антигена
SCD38 - растворимая форма CD38 антигена
SCD50 - растворимая форма CD50 антигена
sCD54 - растворимая форма CD54 антигена
sCD95 - растворимая форма CD95 антигена
sHLA-l - растворимая форма молекул главного комплекса
гистосовместимости I класса
sHLA-DR - растворимая форма молекул главного комплекса
гистосовместимости II класса (HLA-DR)
Введение к работе
Актуальность проблемы
В России, как и в большинстве стран мира, ВИЧ-инфекция остается одной из главных проблем здравоохранения. По экспертным оценкам ВОЗ в мире в настоящее время насчитывается более 36 млн. ВИЧ-инфицированных. По данным Российского Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИД на октябрь 2003 г. в России было более 250 тысяч ВИЧ-инфицированных [30].
В конце 90-х гг. основным путем заражения ВИЧ в России являлось инфицирование при внутривенном употреблении психоактивных веществ. Вследствие этого значительная часть ВИЧ-инфицированных лиц одновременно несет маркеры вирусных гепатитов В, С, G и других инфекций. [2, 10, 22, 45]. Патогенез смешанной инфекции, вызываемой сочетанием этих вирусов, изучен мало, что определяет актуальность детального исследования молекулярных механизмов иммунного ответа при данных социально-значимых вирусных заболеваниях.
Важную роль в регуляции иммунного ответа играют растворимые формы поверхностных протеинов клеток иммунной системы, образующиеся за счет шеддинга или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Получены данные о том, что они могут выполнять функции ограничителей иммунных реакций или же выступать в роли активаторов иммунологических процессов. Кроме того, сывороточный уровень отдельных белков является мониторинговым показателем течения патологического процесса при ряде заболеваний, в том числе и при ВИЧ-инфекции [55, 96, 122]. Информация о наличии и функциональной роли растворимых форм получена лишь для немногих из более 240 идентифицированных в настоящее время дифференцировочных антигенов. Таким образом, исследование количественного содержания растворимых форм (s-форм) мембранных белков клеток иммунной системы имеет как практическое, так и теоретическое значение.
Цель исследования
Изучить характер изменения уровня растворимых форм CD25, CD38, CD50, CD54, CD95 антигенов и растворимых антигенов HLA класса I и II в сыворотке крови ВИЧ-инфицированных лиц, имеющих маркеры сопутствующих вирусных инфекций.
Задачи
Разработать иммуноферментный метод определения растворимой формы HLA-DR антигенов.
Исследовать сывороточное содержание этих протеинов при хроническом гепатите С, цитомегаловирусной инфекции, при коинфицировании вирусами гепатитов В и С, у носителей молекулярно-генетических и иммунологических маркеров вирусного гепатита G.
Определить сывороточный уровень растворимых молекул HLA I класса, HLA-DR, CD38, CD50, CD54, CD95 антигенов при моноинфицировании ВИЧ.
Оценить характер изменения сывороточного содержания молекул HLA I и II класса, растворимых форм CD25, CD38, CD50, CD54 и CD95 антигенов при наличии у ВИЧ-инфицированных лиц маркеров вирусных гепатитов В, С, G и цитомегаловирусной инфекции в различных сочетаниях.
Положения, выносимые на защиту
Присутствие маркеров других вирусных инфекций у ВИЧ-инфицированных сопровождается изменением сывороточного содержания растворимых форм CD25, CD38, CD50, CD54, CD95 антигенов, HLA I и II класса.
Основным фактором, влияющим на содержание исследованных растворимых антигенов у ВИЧ-инфицированных лиц, несущих маркеры сопутствующих инфекций, является инфицирование вирусом гепатита С.
Научная новизна
Установлено, что уровень sHLA-DR увеличивается у ВИЧ-инфицированных лиц, положительных по антителам к вирусу гепатита С, независимо от наличия маркеров других тестируемых инфекций, в то время как концентрация растворимых антигенов HLA I класса статистически достоверно возрастает у ВИЧ-инфицированных лиц, имеющих маркеры вирусного гепатита С и цитомегаловирусной инфекции, а также у лиц, кроме того несущих HBs антиген. Статистически достоверно повышенный уровень sCD50 у ВИЧ-инфицированных лиц ассоциирован с одновременным инфицированием организма вирусами гепатитов В и С. Более высокое содержание sCD50 антигена зарегистрировано при дополнительном наличии антител класса IgM против цитомегаловируса.
Обнаружено, что сывороточный уровень sCD54 антигена у ВИЧ-инфицированных лиц статистически достоверно повышается при наличии антител против белков вируса гепатита С, а также в присутствии дополнительно антител класса IgM против цитомегаловируса, но не маркеров вирусных гепатитов В и G.
Установлено, что преимущественное влияние на сывороточное содержание суммарного sCD38 антигена оказывает наличие инфицирования ВИЧ. Обнаружено статистически достоверное повышение концентрации димерной фракции данного антигена при моноинфекции ВИЧ. Присутствие антител к вирусу гепатита С, HBs антигена или антител к Е2 протеину вируса гепатита G приводит к дополнительному увеличению уровня димерного sCD38 антигена.
Показано повышение концентрации sCD25 антигена в сыворотке крови ВИЧ-инфицированных лиц при наличии антител к вирусу гепатита С и одновременном инфицировании вирусом гепатита В или цитомегаловирусом, а также при одновременном обнаружении антител против Е2-протеина HGV.
Характер изменения уровня олигомерного sCD95 антигена при ВИЧ-инфекции отличается от характера изменения сывороточного содержания суммарного sCD95 антигена. Сывороточный уровень суммарного SCD95 антигена при моноинфицировании ВИЧ имеет тенденцию к повышению, тогда как
8 содержание олигомерной формы SCD95 антигена статистически достоверно снижается.
Установлено, что при инфицировании организма вирусом гепатита G повышается сывороточный уровень растворимой формы HLA-DR антигенов. Содержание sHLA-DR нормализуется при освобождении организма от вируса. Показано увеличение сывороточного содержания sHLA-DR антигенов при ци-томегаловирусной инфекции.
Полученные данные расширяют знания о роли растворимых форм мембранных антигенов в реализации иммунного ответа при вирусных инфекциях.
Практическая значимость работы
С использованием моноклональных и поликлональных антител разработан иммуноферментный метод определения суммарной фракции растворимых HLA-DR антигенов в биологических жидкостях. Метод применим для изучения роли этих белков в молекулярных механизмах иммунных реакций, а также для определения дифференциально-диагностической значимости уровня растворимых форм данных антигенов при различных заболеваниях. Примененные в работе методические подходы к определению сывороточного уровня растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы потенциально могут быть использованы в качестве методов оценки прогноза течения ВИЧ-инфекции, осложненной вирусными гепатитами.
Апробация работы
Результаты работы представлены на ll(IV) Конгрессе специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 2000); VII Нижегородской сессии молодых ученых (Н.Новгород, 2002); VI Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.Петербург, 2002); Научной конференции и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине» (С.-Петербург, 2002); Научно-практической международной конференции, посвященной памяти академика РАМН и РАМТН И.Н. Блохиной «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии»
9 (Москва, 2002); I научно-практической конференции Приволжского федерального округа «Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики ВИЧ-инфекции/СПИДа в Приволжском федеральном округе» (Ижевск, 2003); Научно-практической конференции «Актуальные проблемы ВИЧ-инфекции» (Астрахань, 2003); Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. АМН СССР С.П.Карпова (Томск, 2003); III Всероссийской научной конференции с международным участием по вопросам ВИЧ/СПИД и вирусных гепатитов (Суздаль, 2003); Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные аспекты инфекционной патологии и деятельности госсанэпидслужбы» (Омск, 2003).
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Апробация диссертации состоялась на расширенной межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной 16 октября 2003 года.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа в объеме 140 листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы: Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 234 источника литературы (48 отечественных и 186 иностранных авторов).
