Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ 2
ВВЕДЕНИЕ 3
Глава 1. Обзор литературы. Особенности антиэритроцитарных антител и
методов их выявления 9
Структура антител 9
Классы Ig 10
Характеристика классов Ig 13
Функциональная активность субклассов IgG 17
Клиническое значение антител 19
Методы исследования антиэритроцитарных антител 21
Факторы, влияющие на реакцию антиген-антитело 28
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 32
Глава 2. Материал и методы исследования 32
Материал исследования 32
Методы исследования 34
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 40
Глава 3. Сравнительная характеристика антиэритроцитарных антител и
методов их выявления 40
Оценка серологических параметров сывороток 40
Частота антиэритроцитарных антител IgGl и IgG3 у аллосенсибилизированных лиц русской национальности 51
Частота субклассов IgG антиэритроцитарных антител, не выявляемых в каком-либо из методов 57
Глава 4. Гемолизирующая активность антител 61
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 71
ВЫВОДЫ 76
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 78
Введение к работе
Актуальность темы. Аллоиммунизация является одной из причин возникновения посттрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных. Выявление аллоиммунных антиэритроцитарных антител имеет большое значение для пациентов, нуждающихся в многократных трансфузиях эрит-роцитсодержащих компонентов (Walker et al., 1989 [191]; Regan et al, 1997 [159]). Кроме того, наличие аллоиммунных антител к эритроцитарным антигенам у реципиента существенно снижает лечебный эффект проводимой гемо-трансфузионной терапии (Ю. М. Зарецкая 1983 [26]; Е. В. Бутина и соавт., 1998 [8]). Таким образом, аллоиммунизация антигенами эритроцитов представляет собой глобальный популяционный процесс (С. И. Донсков и соавт., 2001 [19]).
До настоящего времени сравнительная оценка (валидация) методов исследования антиэритроцитарных антител, применяемых в Российской Федерации, в полном объеме не проводилась. Рядом авторов осуществлялись работы по сравнению отдельных методов, предназначенных в основном для определения резус-фактора. Так, А. Г. Башлай в 1960 году [5, 6] провела сравнение усовершенствованного ею желатинового метода Фиска-Мак Ги [88] с методом агглютинации в солевой среде Винера [197]. Метод А. Г. Башлай, получивший название: «реакции конглютинации в пробирках с 10% желатином при температуре 46-48С», до сих пор с успехом используется в учреждениях службы крови Российской Федерации.
А. Я. Ашкенази в 1962 году [3, 4] сравнивала два метода: разработанный ею экспресс-метод определения резус-фактора на предметных стеклах с использованием гепаринизированных сывороток и широко применяемый в то время метод определения резус-фактора в сывороточной среде на чашках Петри, предложенный Н. И. Блиновым и Н. С. Дробышевой [7]. Результаты исследования обоими методами практически совпали за исключением редких случаев трудноопределимого антигена Du.
О. В. Успенская в 1966 году [60] привела данные сравнения метода на пластмассовых тарелках с желатиной, на чашках Петри и ускоренного метода с
4 применением желатины. А. А. Михайлова [36] проводила сравнительную оценку предложенной ею реакции конглютинации в пробирках с 33% полиглюкином при комнатной температуре и чашечного метода Н. И. Блинова и Н. С. Дробышевой. Результаты обоих методов были в достаточной степени воспроизводимы.
Имеются данные сравнительной оценки чувствительности методов с 10% желатином, с 33%) полиглюкином и антиглобулиновым тестом (Н.В. Минеева, 1991 г. [33]), поликатионного метода выявления антиэритроцитарных антител (Г. В. Скосырев, 1998 [52]), альбуминового метода (С. И. Донсков, 1968 [14, 15]), двухэтапной модернизированной пробы с использованием антиглобулина (Н. И. Васильев, 2002 [9]), гелевой технологии (М. Элламаа и соавт., 1998 [63]), ферментных (С. И. Донсков, 1969 [16]; Р. С. Сахаров, 1968 [48]) и других методов выявления антител.
Упомянутые авторы проводили сравнение воспроизводимости и чувствительности разработанных или модифицированных ими методов лишь с некоторыми, отдельно взятыми методами, применяемыми в РФ. В целом же сопоставление одновременно всех используемых в РФ методов, как уже указывалось выше, не проводилось.
Вторым побудительным мотивом, продиктовавшим необходимость проведения настоящей работы, послужили накопленные в литературе последних лет многочисленные данные о различном химическом строении и своеобразии пространственной структуры антиэритроцитарных антител. Указанные особенности антител, по-видимому, обусловливают неодинаковое их клиническое значение, а также неодинаковую возможность детекции тем или иным методом.
Антиэритроцитарные антитела дифференцируются на три основных класса: IgM, IgA, IgG, и несколько субклассов (Furukawa et al., 1991 [89]). Однако не все классы и субклассы иммуноглобулинов способны вызвать in vivo разрушение эритроцитов (Giblett, 1977 [93]; Walker et al., 1989 [191]). Shaw et al. (1988) [170], Lynen et al. (1994) [131] отметили, что в трансфузиологической и акушерской практике имеют значение антитела, относящиеся к классам М и G и суб-
5 классам IgGl и IgG3, что связано с некоторыми особенностями их строения, способностью активировать комплемент.
Morell et al. (1971) [145] и другие авторы (Nieuwenhuys et al., 1989 [148]; Lynen et al., 1994 [131]) показали, что антитела всех субклассов IgG проходят через плаценту, однако, не все вызывают гемолитическую болезнь новорожденных. Последняя обусловлена IgGl и IgG3, причем гемолиз эритроцитов зависит от количества только IgGl. Авторы объясняют это тем, что, по-видимому, только IgGl и IgG3 реагируют с Fc-фрагментами Ig-рецепторов лимфоцитов и в большей степени, чем IgG2 и IgG4, активируют комплемент. По данным Van der Winkel et al., (1991) [186], наибольшую активность при этом проявляют антитела, относящиеся к IgG3. В то же время большинство антител независимо от их класса и субкласса, включая антитела, не имеющие клинического значения, детектируются применяемыми в настоящее время методами.
Имеется и иная точка зрения. По мнению классиков современной трансфу-зиологии Mollison et al., (1997) [143], Voak (1999) [190], Gustafsson et al., (2004) [100] не существует универсального метода выявления всех клинически значимых антител. Очевидно, что методы, детектирующие неполный спектр транс-фузионно опасных антител, неприемлемы, поскольку не исключают риска по-сттрансфузионных осложнений. Так же, по-видимому, неприемлемы и чрезмерно чувствительные методы, выявляющие параллельно с клинически значимыми клинически незначимые антитела. В этом случае дозы эритроцитов, которые фактически являются совместимыми с кровью реципиента, выбывают из арсенала средств трансфузионной помощи, что для некоторых реципиентов может оказаться фатальным, поскольку исключает возможность трансфузион-ного лечения.
В связи с выше перечисленным возникает ряд актуальных для клинической трансфузиологии вопросов. Какую степень чувствительности иммуносерологи-ческих методов следует считать достаточной для детекции антител в клинической практике? Насколько клинически значимы антиэритроцитарные антитела, не детектируемые некоторыми методами? Имеется ли взаимосвязь между час-
рыми методами? Имеется ли взаимосвязь между частотой распределения антител в популяции и их принадлежностью к тому или иному субклассу иммуноглобулинов? Какова частота субклассов иммуноглобулинов среди антител разной специфичности?
В отечественной литературе отсутствуют данные о частоте антиэритроци-тарных антител IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 у аллосенсибилизированных лиц. Нет сведений о гемолизирующей активности антиэритроцитарных антител, несмотря на то, что именно это свойство антител, как считается, обусловливает гемолиз эритроцитов in vivo и, соответственно, тяжесть посттрансфузионных осложнений.
В 2004 году Гематологическим научным центром РАМН совместно с другими учреждениями службы крови начаты кооперированные исследования под общим названием: «Валидация методов определения антиэритроцитарных антител». Цель этих исследований - оценить эффективность скрининга антиэритроцитарных антител в лечебно-профилактических учреждениях РФ, сравнить на большом материале чувствительность методов выявления антиэритроцитарных антител, дать научно обоснованные рекомендации по совершенствованию проб на индивидуальную совместимость донора и реципиента при переливании эритроцитов.
Целью настоящего исследования в рамках упомянутой программы явилась сравнительная оценка (валидация) методов выявления антиэритроцитарных антител, применяемых в Российской Федерации.
Задачи исследования:
Исследовать серологические параметры сывороток (активность, специфичность, титр и др.) семью методами, применяемыми в лечебно-профилактических учреждениях Российской Федерации.
Установить частоту антиэритроцитарных антител, относящихся к IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4, у аллосенсибилизированных лиц, а также
7 распределение субклассов иммуноглобулина G в зависимости от специфичности антител.
Установить возможную связь между субклассами, к которым относятся антиэритроцитарные антитела, и их способностью детектироваться разными серологическими методами.
Исследовать гемолизирующую активность антител в зависимости от их активности, специфичности и принадлежности к тому или иному субклассу IgG.
Научная новизна. Показано, что антиэритроцитарные антитела в силу структурного полиморфизма проявляют неодинаковую способность реагирования при их детекции разными методами. Установлена частота распределения антиэритроцитарных антител IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 среди сенсибилизированных лиц исследуемой популяции.
Установлена частота антител, обладающих гемолизирующей активностью, а также зависимость этого свойства от принадлежности антител к субклассам IgG. Показано, что уровень гемолизирующей активности антител не коррелирует с их специфичностью и титром, однако зависит от принадлежности антител к IgGl, IgG3 или IgG2, IgG4 субклассам.
Научно-практическая ценность. Установлена частота встречаемости субклассов IgG и частота распределения их в зависимости от специфической направленности и гемолизирующей активности антиэритроцитарных антител.
Пути практической реализации. Полученные данные показывают реальные возможности серологических методов детекции антиэритроцитарных антител и могут быть использованы в системе обеспечения иммунологической безопасности гемотрансфузий, в частности, при подборе совместимых пар донор - реципиент, прогнозировании степени риска посттрансфузионных осложнений.
8 Положения, выносимые на защиту.
Полиморфизм антиэритроцитарных антител обусловливает неодинаковую их способность детектироваться разными серологическими методами.
С помощью какого-либо одного из методов скрининга антиэритроцитарных антител не всегда удается выявить антитела, относящиеся к IgGl и IgG3.
Антитела, имеющие относительно низкую активность и титр, представляют собой не меньший фактор риска посттрансфузионных гемолитических осложнений, чем антитела с высокой серологической активностью.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на заседания проблемной комиссии «Проблемы донорства, производства и контроля компонентов и препаратов крови» (13.03.08) в ГНЦ РАМН; материалы диссертации представлены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (13-15 июня 2007 г.) С.-Петербург; на научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» (29-30 ноября 2007) Москва.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 113 траницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, приложения. Библиография включает 63 отечественных и 139 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 5 рисунками.
Работа выполнена в ГНЦ РАМН (г. Москва) и ОГУЗ - СЦК (г. Смоленск).
Отдельные разделы работы выполнены совместно с канд. мед. наук Н. И. Васильевым, канд. мед. наук Н. М. Михайловой, докт. мед. наук, проф. С. И. Донсковым, за что автор выражает им свою признательность.
