Структурно-функциональная организация, механизм действия и иммунобиологические свойства [Г]-D-глутамил-L-триптоана (Бестима) Колобов Александр Александрович

Введение к работе

Актуальность исследования:

В настоящее время гуморальные регуляторные факторы иммунной системы, действующие как местно, так и на системном уровне, находятся в центре внимания клинических иммунологов как потенциальные лекарственные препараты. Они используются для модуляции активности иммунной системы с целью лечения целого ряда патологических состояний и заболеваний (Кетлинский и др., 1992; Кетлинский, Калинина, 1998; Новиков, 1999; Jeffery, 2004). Особое место среди биорегуляторов иммунной системы занимают низкомолекулярные медиаторы полипептидной природы. Их особая роль заключается в тесной функциональной взаимосвязи с другими гормонами, особенно с гормонами гипоталамуса, гипофиза, надпочечников и половых желез, обеспечивающей один из механизмов реализации нейроиммуноэндокринных взаимодействий (Blalock, 1989, Jiang et al., 1998, Dantzer, 2004).

Действие низкомолекулярных пептидных биорегуляторов селективно и высокоспецифично, их эффективные концентрации лежат в зоне микро- наномолярных значений. Как правило, они нетоксичны и неиммуногенны, время их действия ограничено, они быстро разлагаются до аминокислот под действием протеолитических ферментов. Совокупность уникальных биологических свойств и возможности промышленного получения низкомолекулярных пептидов с помощью методов химического синтеза делают этот класс соединений одним из наиболее перспективных кандидатов для разработки новых лекарственных препаратов (Шабанов, 2006).

Одной из задач современной иммунофармакологии является изучение структурно-функциональной организации биорегуляторов, т.е. зависимости проявления биологической активности от структуры молекул, которое помогает установить механизмы их действия на молекулярном и клеточном уровнях. Знание структурно-функциональной организации позволяет целенаправленно подходить к конструированию новых аналогов, обладающих селективной активностью и уникальными фармакологическими свойствами, стимулирует разработку лекарственных препаратов на их основе. В тоже время понимание механизмов функционирования лекарственных препаратов позволяют более обоснованно и эффективно применять их в иммунокорригирующей терапии (Козлов и др., 2001; Нестерова и др., 2002). В связи с этим, разработка новых синтетических иммуномодуляторов пептидной природы и изучение механизмов их действия является актуальной теоретической и практической задачей.

Настоящее исследование посвящено изучению иммунотропной активности нового семейства иммуномодулирующих препаратов – -глутамил содержащих дипептидов, исследованию их структурно-функциональной организации, установлению механизма действия и клинико-иммунологической характеристике наиболее активного по совокупности использованных тестов соединения -D-глутамил-L-триптофана.

Результаты проведенных исследований положены в основу включения лекарственного препарата Бестим, в котором -D-глутамил-L-триптофан используется в качестве фармакологически активной субстанции, в терапию заболеваний, сопровождающихся дисбалансом Тх-1/Тх-2 звеньев иммунитета и снижением функциональной активности макрофагов.

Цели исследования:

Изучение закономерностей структурно-функциональной организации -глутамил содержащих дипептидов, исследование спектра иммуномодулирующей активности и механизма действия -D-глутамил-L-триптофана, разработка нового иммунотропного препарата пептидной природы на его основе.

Основные задачи исследования:

1. исследовать взаимосвязь структура-активность в ряду -глутамил содержащих дипептидов и осуществить дизайн структуры с наиболее высокой иммуномодулирующей активностью;

2. изучить влияние -D-глутамил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку, пролиферативную и функциональную активность иммунокомпетентных клеток;

3. провести исследование взаимодействие Бестима с клеточными рецепторами;

4. исследовать фармакокинетические свойства Бестима при различных путях введения препарата;

5. изучить иммуномодулирующее действие Бестима в экспериментальных моделях с преимущественной активацией иммунного ответа по Тх-1 или Тх-2 типу при различных путях введения препарата;

6. провести клинико-иммунологическую характеристику лекарственного препарата Бестим в ходе клинических испытаний.

Научная новизна:

Впервые показано, что дипептиды, содержащие глутаминовую кислоту, соединенную -связью со следующим аминокислотным остатком, а также их аналоги с -связью по аспарагиновой кислоте обладают выраженным иммуномодулирующим действием. Проведенные исследования выявили такие структурные особенности нового семейства иммуномодуляторов как предпочтительность глутаминовой кислоты по отношению к аспарагиновой в первом положении, наличие триптофана с немодифицированным индольным кольцом и глутаминовой кислоты в D-конфигурации, отсутствие модификаций на N- и С-концах молекулы. Доказано, что наибольшей иммуностимулирующей активностью обладает активностью -D-глутамил-L-триптофан (Бестим, от BE(neficial) ST(imulator) of IM(munity)).

Установлено, что [³H]Бестим с высоким сродством связывается с перитонеальными макрофагами и тимоцитами мыши, а также плазматическими мембранами, выделенным из этих клеток. В концентрациях 10^-10–10^-6М Бестим снижает аденилатциклазную активность мембран макрофагов и тимоцитов мыши.

Фармакологическое действие препарата определяется усилением дифференцировки и пролиферации предшественников Т-лимфоцитов. При действии in vitro Бестим усиливает продукцию ИЛ-2 и экспрессию его рецептора лимфоцитами, усиливает их пролиферативную активность. В модельных системах in vivo Бестим стимулирует Т-клеточное звено иммунитета, активирует макрофаги и естественные киллерные клетки. Установлено, что иммуномодулирующее действие Бестима идентично как при парентеральном, так и пероральном применении.

В модели экспериментального генерализованного туберкулеза у мышей Бестим обладает противоинфекционным и иммуномодулирующим действием, усиливая антиген-специфический иммунный ответ с преимущественной активацией Т-хелперов 1 типа. В модели аллергической бронхиальной астмы показано ингибирующее действие препарата на местные и системные проявления патологического процесса.

Иммуномодулирующее действие Бестима изучено при его применении в комплексной терапии пациентов с гнойно-септическими процессами, больных распространенными и локализованными формами мочеполового хламидиоза и инфильтративным туберкулезом легких. Динамика клинико-иммунологических показателей после курса препарата свидетельствует о стимуляции антиген-специфического иммунного ответа, функциональной активности Т-клеток, преимущественной активации Т-хелперов 1 типа.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. -D-гутамил-L-триптофан (Бестим) обладает дозозависимым, невидоспецифичным иммуномодулирующим действием и наиболее активен среди -глутамил содержащих пептидов.

2. Биологическая активность Бестима обусловлена высокоаффинным селективным взаимодействием со специфическими сайтами на мембранах макрофагов и тимоцитов.

3. Биодоступность препарата при внутрибрюшинном и пероральном путях введения одинакова и составляет 55-60%.

4. Механизм иммуностимулирующего действия Бестима связан с увеличением дифференцировки и преимущественным усилением функциональной активности Т-хелперов 1 типа.

5. Введение Бестима приводит к усилению антиген-специфического иммунного ответа.

6. Бестим обладает противоинфекционным и иммуномодулирующим действием в модели экспериментального генерализованного туберкулеза.

7. В модели экспериментальной аллергической бронхиальной астмы Бестим снижает титры аллерген-специфических IgE и тканевые проявления аллергического иммунного ответа.

8. Бестим эффективен при комбинированном лечении больных со вторичными иммунодефицитами различной этиологии, причем положительная клиническая динамика сопровождается иммуномодулирующим действием препарата.

Практическая значимость:

Практическая ценность работы заключается в установлении закономерностей структурно-функциональной организации нового семейства иммуномодулирующих соединений – -глутамил содержащих пептидов; дизайне структуры нового иммуномодулирующего соединения и создании на ее основе нового отечественного лекарственного препарата Бестим; демонстрации иммуномодулирующего эффекта Бестима, связанного с преимущественной активацией Т-хелперов первого типа и нормализацией баланса между Тх-1 и Тх-2, при парентеральном и пероральном применении; установлении механизмов его действия; определении оптимальных схем использования препарата; изучении эффективности включения иммуномодулирующей терапии с помощью препарата Бестим в стандартные схемы лечения инфекционных заболеваний.

Результаты, полученные в ходе выполнения исследования, использованы для регистрации и получения разрешения на выпуск в обращение препарата «Бестим, 100 мкг, лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения» (рег.уд. PN03335/03 от 29.12.2006). В настоящее время препарат выпускается ФГУП Гос.НИИ ОЧБ ФМБА России.

Личный вклад автора в проведенные исследования:

Работа выполнена лично автором на базе ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России. Вклад автора состоит в организации и проведении экспериментальных исследований, теоретическом обобщении и интерпретации полученных результатов. Ряд исследований выполнен совместно с сотрудниками ГосНИИ ОЧБ к.х.н. Смирновой М.П., к.х.н. Колодкиным Н.И., Шпенем В.М., к.х.н. Прусаковым А.Н., Афониной И.В., Трофимовым А.В., Родиным С.В., к.м.н. Пигаревой Н.В., к.м.н. Петровым А.В., Демьяновым А.В., Боковановым В.Е. и другими. Работы по радиорецепторному анализу Бестима проводились на базе Филиала института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Пущино) под руководством д.б.н. Наволоцкой Е.В. Работы по изучению влияния Бестима в модели экспериментального генерализованного туберкулезного процесса проводились на базе Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи под руководством д.м.н. Виноградовой Т.И. Обработка результатов фармакокинетических исследований проведена совместно с сотрудником Института токсикологии ФМБА России (Санкт-Петербург) Трефиловым В.В. Клинические испытания Бестима в терапии хламидиоза проведены на базе клиники кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской Академии им. С.М.Кирова МО России (Санкт-Петербург) под руководством д.м.н. Позняка А.Л., в терапии туберкулеза легких – на базе клиники Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии под руководством д.м.н. Скворцовой Л.А., в терапии гнойно-воспалительных хирургических заболеваний – на базе клинической больницы №83 ФУ МБ и ЭП при МЗ РФ (Москва) под руководством к.м.н. Захарченкова В.А. По всем полученным совместно результатам имеются совместные публикации. Соискатель приносит своим соавторам искреннюю благодарность.

Апробация работы:

Основные результаты исследований и положения диссертационной работы были представлены и доложены на: 25 Европейском пептидном симпозиуме (Будапешт, Венгрия, 1998), 16 Американском пептидном симпозиуме (Миннеаполис, США, 1999), 17 Международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Сидней, Австралия, 2000), 26 Европейском пептидном симпозиуме (Монпелье, Франция, 2000), 42 Междисциплинарной конференции по антимикробным агентам и химиотерапии (Сан-Диего, США, 2002), 27 Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), 12 Международном иммунологическом конгрессе (Монреаль, Канада, 2004), VIII и Х Всероссийском научном форуме им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2006), XIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта, 2005), 29 Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск, Польша, 2006), 6-ой ежегодной Конференции Американского Общества Клинических Иммунологов (Сан Франциско, 2006), 13 Международном иммунологическом конгрессе (Рио де Жанейро, Бразилия, 2007).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 44 научные работы, в их числе 13 российских и международных патентов и 10 работ, изданных в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, включая 86 таблиц и 32 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 8 глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 355 работ (40 отечественных и 315 зарубежных).

Похожие диссертации на Структурно-функциональная организация, механизм действия и иммунобиологические свойства [Г]-D-глутамил-L-триптоана (Бестима)

Изучение влияния [Г]-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность лимфоцитовПетров Александр Владимирович

Влияние бестима (Y-D-глутамил-L-триптофана) на клинические и иммунологические показатели больных с одонтогенными флегмонами лица и шеиПавлиенко Юлия Викторовна

Исследование клинической эффективности и механизмов действия имунофана при хронических обструктивных заболеваниях легких [Электронный ресурс]Бондаренко Наталья Леонидовна

Молекулярные и клеточные механизмы действия иммуномодуляторов микробного происхождения на функциональную активность эффекторов врожденного иммунитетаАхматова Нэлли Кимовна

Особенности механизма действия миелопептидов, обладающих противоопухолевой активностьюКалюжная Мария Викторовна

Исследование механизма действия цитолитических лимфоцитов: идентификация цитотоксических белков, характеристика процессов в клетках-мишенях, индуцированных действием лимфоцитовГнучев, Николай Васильевич

Механизмы действия статинов, их эффективность и безопасность у больных аутоиммунными заболеваниямиШиринский Иван Валерьевич

Основные механизмы действия хорионического гонадотропина на функциональную активность фагоцитирующих клетокЗаморина Светлана Анатольевна

Клеточные и гуморальные механизмы действия опухолеспецифической иммунотерапии и их модуляция под влиянием гипертермииКащенко, Эрика Александровна

Механизмы гипосенсибилизирующего действия пептидов, полученных протеолизом мажорного аллергена Asp f 2 из грибов Aspergillus fumigatusШевченко Марина Александровна