Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 16
Глава 1 Плазмоцитоидные дендритные клетки и их роль в организме человека 16
Глава 2 Плазмоцитоидные дендритньш клетки в патогенезе вирусного гепатита с 28
ЧАСТЬ II. Собственные исследования 36
Глава 3. Пациенты и методы 36
3.1. Клиническая характеристика обследованных 38
3.1.1. Состав всех обследованных 38
3.1.2. Клиническая характеристика больных 38
3.2. Методы обследования 50
3.2.1 Базовые методы обследования 50
3.2.2. Методы тестирования маркёров вируса гепатита С 50
3.2.3. Дополнительные методы обследования 50
3.2.4. Специальные методы исследования 51
3.2.5 Дополнительные специальные методы 3.2.6. Дизайн исследования 54
3.2.7. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 4. Количественная характеристика пдк в патогенезе хронического вирусного гепатита С
4.1. Количественные показатели ПДК у здоровых детей и взрослых 56
4.1.1 Количественные показатели ПДК у больных ХГС и здоро вых 57
4.2. Связь количественных показателей ПДК с клинико лабораторными параметрами у детей, больных ХГС 61
4.3.Связь количественных показателей ПДК с клинико лабораторными параметрами у взрослых, больных ХГС 69
4.4.Сравнительная количественная характеристика ПДК у детей и взрослых, больных ХГС 76
ГЛАВА 5. Функциональное состояние пдк при хроническом вирусном гепатите с 81
5.1. Функциональное состояние ПДК у здоровых детей и взрослых
5.2 Функциональное состояние ПДК у больных ХГС детей и взрослых 83
5.2.1 Связь функционального состояния ПДК с клинико лабораторными параметрами у детей, больных ХГС 84
5.3.Связь функционального состояния ПДК с клинико лабораторными параметрами у взрослых, больных ХГС 90
5.4.Сравнительный анализ функционального состояния ПДК у
детей и взрослых, больных ХГС
ГЛАВА 6. Соотношение параметров пдк и противо вирусной терапии (ПВТ) у больных ХГС 102
6.1.Соотношение количественных показателей ПДК и ПВТ у детей 102
6.2. Соотношение количественных показателей ПДК и ПВТ у взрослых 106
6.3. Сравнительная характеристика количественных показателей ПДК и ПВТ у детей и взрослых, больных ХГС 107
6.4.Соотношение функциональных показателей ПДК и ПВТ у де тей, больных ХГС 109
6.5. Соотношение функциональных показателей ПДК и ПВТ у взрослых 111
6.6. Сравнительная характеристика функциональных показателей ПДК и ПВТ у детей и взрослых 113
6.7. Соотношение функциональных показателей ПДК и эффективности ПВТ у детей 119
6.8. Соотношение функциональных показателей ПДК и эффективности ПВТ у взрослых 119
6.9 Соотношение показателей ПДК с ПВТ у пациентов с отсутствием вирусной репликации (с авиремией). 122
Новый тест для прогнозирования ответа на противовирус ную терапию (ПВТ) при хроническом гепатите С (ХГС) 125
Заключение 135
Выводы 143
практические рекомендации 145
Список цитированной литературы
- Плазмоцитоидные дендритньш клетки в патогенезе вирусного гепатита
- Методы тестирования маркёров вируса гепатита С
- Связь количественных показателей ПДК с клинико лабораторными параметрами у детей, больных ХГС
- Связь функционального состояния ПДК с клинико лабораторными параметрами у детей, больных ХГС
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирусные гепатиты представляют серьёзную проблему здравоохранения, подлинную угрозу для человечества, ввиду повсеместного распространения гепатитов В, С, Д, наличия хронического носительства, а также тяжёлых и фульминантных форм и исхода в цирроз печени с угрозой малигнизации и развития гепатокарциномы [Покровский В.И., 1996-2004г.; Соринсон С.Н., 1996-1998г.; Михайлов М.И. и др., 1996-2004г.].
В настоящее время особенно тревожна ситуация с хроническим гепатитом С (ХГС): в мире насчитывается 180 миллионов (по некоторым данным до 500 миллионов) инфицированных людей, то есть от 3% до 8% всемирной популяции, и ежегодно выявляются новые 3-4 миллиона случаев. В связи с этим, изучение данной проблемы приобретает с каждым годом всё большую актуальность.
Наряду с огромными успехами, связанными с открытием возбудителя, внедрением молекулярно-биологических методов диагностики и возможностей противовирусной терапии [Михайлов М.И., 1990г.; Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., Онищенко Г.Г., 2003г.; Мукомолов С.Л. и др., 1994г.], многое в проблеме вирусных гепатитов остаётся не изученным.
Для решения вопросов течения, прогрессирования и исходов вирусных гепатитов первостепенное значение имеет знание глубинных механизмов патогенеза этих заболеваний, в том числе особенностей иммунного ответа.
Одним из новейших и многообещающих направлений в понимании механизмов иммунного ответа при вирусных гепатитах является изучение недавно открытого уникального типа иммунных клеток - плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК), роль и значение которых, как возможных ключевых факторов патогенеза вирусных гепатитов, начали изучать лишь в самое последнее время.
ПДК являются отдельным видом клеток крови, близким по развитию и генетическому профилю общим дендритным клеткам, впервые описанным R.M. Steinman и Z.A. Cohn в 1973 году. ПДК были открыты Cella M., Jarrosay D., Fecchetti F. et al ; Siegal F.P., Kadowaki N., Shodell M. et al в 1999году. Они имеют костномозговое происхождение и развиваются из стволовой клетки через ряд предшественников [Merad M., Manz M.G. 2009], в этом процессе основополагающую роль играет ген, названный Е2-2 [открыт в 2008 году Reizis B. et al], который регулирует этапы развития и дифференцировки ПДК. У здоровых людей ПДК обнаружены в крови и лимфоидных органах и в минимальных количествах присутствуют в других органах и тканях. Единственным органом, где они представительствуют и куда могут эффективно мигрировать в зрелом состоянии, является печень.
При активации во время воспалительного ответа ПДК мигрируют как в зону Т-клеток лимфоидных органов, так и в воспалённую ткань паренхимы [Cella M., Jarrossay F. et al 1999; Lai W.K., Curbishley S.M. et al 2007]. Эти клетки, генетически родственны дендритным клеткам и обладают морфологией плазматических клеток, в связи с чем имеют уникальную двойственную природу.
С одной стороны, ПДК являются основными естественными продуцентами интерферонов (ИНФ) I типа и способны продуцировать в 100-1000 раз больше интерферона – , чем другие типы клеток, в ответ на вирусемию, что ставит их на первое место, как принципиально важных участников антивирусного иммунного ответа [Cella M., Jarrosay D., Fecchetti F. et al 1999год, Kadowaki N., Shodell M. et al 1999]. Первый тип интерферона напрямую активирует натуральные киллеры, усиливая их цитотоксическую активность [Lee C.K., Rao D. T., Gertner R. 2000] и стимулирует продукцию интерлейкина-15 [Nguyen K.B., Salazar-Mather T.P. et al 2002], который играет роль в их пролиферации. С другой стороны, кроме продуцирования интерферона, ПДК могут напрямую взаимодействовать почти со всеми клетками иммунного типа, в том числе с антигенпрезентирующими дендритными клетками (АПК), обеспечивая отчётливый механизм их активации [Yoneyama H., Matsuno K., Matsuno N., Toda E. et al 2005], а также самостоятельно выступать в этом качестве.
Таким образом, характеризуясь сочетанием уникально быстрой и массивной продукции интерферона I типа с активацией презентации антигена, ПДК обладают одновременно свойствами как лимфоцитов, так и классических дендритных клеток, что позволяет им быть ключевым связующим звеном между врождённым и приобретённым иммунитетом [B.Reizis et al 2010].
Клинические работы по изучению ПДК появились в самое последнее время [Banchereau J., Palucka A.K. 2005; Vicari A. 2002; Pacrensny S. 2004; De Vries 2003]. Работы по изучению роли ПДК при вирусных гепатитах единичны и касаются только взрослых пациентов [Ito T., Kanzler H., Liu Y.J. 2006; Ulsenheimer A., Gerlach J.T., Jung M.C. et al 2005;Kanto T., Inoue M., Miyatake H. 2004]. У детей подобные исследования отсутствуют.
Всё это определяет актуальность и перспективность избранной нами темы, и явилось основанием для проведения настоящей работы.
Цель исследования
Установление патогенетического и клинического значения плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК) при хроническом гепатите С у детей и взрослых.
Задачи исследования
-
Определить нормальные количественные показатели и функциональное состояние ПДК (выработка ими интерферона) у детей и взрослых.
-
Установить количество и функциональное состояние ПДК у детей с вирусным гепатитом С, в зависимости от течения и фазы инфекционного процесса, характера и стадии противовирусного лечения.
-
Исследовать те же параметры ПДК у взрослых пациентов, больных вирусным гепатитом С.
-
Выявить особенности и дать сравнительную характеристику изменений количества и функционального состояния ПДК у взрослых и детей, больных вирусным гепатитом С.
-
На основании полученных результатов сформулировать положения о роли ПДК в патогенезе вирусного гепатита С, их влиянии на течение инфекционного процесса, а также на эффективность противовирусной терапии (ПВТ).
Научная новизна
-
Впервые установлены нормальные количественные и функциональные показатели (интенсивность интерфероногенеза (ИФН-генез)) ПДК у здоровых детей и их соотношение с показателями у здоровых взрослых лиц.
-
Обнаружен феномен наличия в крови здоровых детей и взрослых ингибиторов ИФН - генеза в ПДК, в связи с чем ПДК здоровых лиц находятся в состоянии «покоя» (выработка ИФН в них не определяется).
-
Выявлено, что количественные и функциональные показатели ПДК у детей и взрослых, страдающих ХГС, достоверно отличаются от таковых у здоровых лиц, а также, что параметры ПДК в детском возрасте существенно отличаются от показателей у взрослых, больных ХГС.
-
Впервые продемонстрировано важное участие ПДК в патогенезе ХГС у взрослых и детей в виде тесной взаимосвязи количества и функции ПДК с вирусной нагрузкой, степенью цитолиза и фиброза, т.е. с основными факторами, определяющими течение и исход ХГС:
- Количество ПДК снижено у всех больных ХГС.
- Количество клеток обратнопропорционально уровню цитолиза (снижается при повышении активности трансаминаз).
- Степень снижения максимальна при продвинутом фиброзе (4 балла).
- Высокой виремии соответствует низкий интерфероногенез в ПДК.
-
Впервые установлено, что противовирусная терапия (ПВТ) существенно влияет на показатели ПДК: резко стимулирует ИФН - генез в ПДК в процессе терапии. Показано, что ответ на ПВТ закономерно связан с изменениями количества и функции ПДК, а степень подъёма выработки ИФН в ПДК может служить надёжным прогностическим тестом ответа на противовирусную терапию (заявка на патент № 2012157606 от 27.12.2012).
-
Продемонстрирован особый механизм воздействия ПВТ на характер иммунного ответа при ХГС: без неё состояние авиремии достигается максимальным напряжением ИФН - генеза в ПДК. Напротив, после ПВТ при достижении авиремии происходит нормализация функции ПДК.
-
На основании полученных данных сформулированы новые научные положения о роли ПДК при ХГС, их влиянии на течение заболевания и эффективность противовирусной терапии.
Практическая значимость работы.
-
Установление нормальных параметров количества и функционального состояния ПДК у детей делает возможным использование этих методов в педиатрии.
-
Полученные данные могут служить дополнительными критериями оценки течения и прогнозирования исходов ХГС у детей и взрослых.
-
На основании результатов исследования предложен прогностический тест, который может служить критерием оценки эффективности проводимой терапии. Суть нового прогностического теста заключается в том, что степень повышения уровня ИФН - генеза в ПДК на 12ой неделе терапии является показателем её эффективности: повышение выработки ИФН в 2,6102 раз у взрослых и 1,2102 у детей позволяет надёжно (с достоверностью 96%) предсказать стойкий вирологический ответ (заявка на патент: рег. № 2012157606 от 27.12.2012).
Своевременная (в первые 12недель) оценка ответа на противовирусную терапию является важнейшей составляющей современной персонализированной терапии ХГС.
Внедрение результатов
Результаты исследования внедрены в практику работы клинико-диагностического центра ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора и Детского Гастроэнтерологического Центра Департамента Здравоохранения г. Москвы.
Апробация материалов диссертации
Результаты исследований были доложены на IV и V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (март 2012г и 2013г, Москва); XVII и XVIII Ежегодном Российском Конгрессе «Гепатология сегодня» (март 2012г и 2013г); на 18-й Российской Гастроэнтерологической неделе с международным участием (октябрь 2012г.); на Всероссийской конференции «Хочу всё знать по вирусным гепатитам» (декабрь 2012г.) Работа принимала участие и заняла I место в Конкурсе молодых ученых на V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (март 2013г.) и XVIII Ежегодном Российском Конгрессе «Гепатология сегодня» (март 2013г). Материалы работы приняты к публикации и постерному докладу на конференции «GASTRO 2013 APDW/WCOG Shanghai» (сентябрь 2013г.), а также к устному докладу на конференции «United European Gastroenterology Week Berlin» (октябрь 2013г.). United European Gastroenterology присудило автору работы звание «National Scholar Award 2013».
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 научные работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ и 1 работа в зарубежном журнале.
Личный вклад. Автор осуществлял планирование и принимал непосредственное участие в сборе анамнеза, осмотре, иммунологическом обследовании больных, в назначении патогенетической терапии. Лично автором проводилось регулярное наблюдение больных. Автором лично проведена оценка клинико-лабораторных, иммунологических, вирусологических показателей в динамике, на фоне проводимой ПВТ. Автором подготовлен аналитический обзор зарубежных и отечественных источников, осуществлен отбор методов исследования и статистическая обработка полученных результатов; проведен анализ и интерпретация данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.
Объем и структура диссертации
Плазмоцитоидные дендритньш клетки в патогенезе вирусного гепатита
На сегодняшний день различают миелоидные дендритные клетки (mDC), отличительными особенностями которых являются презентация антигена при помощи МНС II типа и экспрессия на их поверхности специфических антигенов- CD13, CD33 и CD 11 с. Для сохранения жизнеспособности эти клетки нуждаются в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ). mDC также называют классическими дендритными клетками (cDC), они продуцируют значительные количества ИЛ-12, что приводит к диффе-ренцировке наивных Т-клеток в сторону Thl-ответа.
Выделяют ещё одну группу ДК - фолликулярные ДК (ЮС). Их принято считать клетками иммунной памяти, способными презентиро-вать антиген В-лимфоцитам. Они экспрессируют на своей поверхности CD21, CD23, CD25 [10], молекулы МНС II в этих клетках отсутствуют. ЮС были выделены из миндалин человека, они презентируют антиген при помощи антительного Fc - рецептора (Fey R) и рецепторов к комплименту (CR1, CR2), связанных с мембраной ЮС.
В последнее время появились доказательства того, что вся палитра ДК, начиная от незрелых и заканчивая ДК «памяти», способна вли -19 ять на регуляцию иммунных реакций организма, обеспечивая активацию врожденного и адаптивного иммунных ответов.
К третьей группе, относятся плазмоцитоидные дендритные клетки (pDC, ПДК), способные к немедленной и массивной выработке ИФН I типа и не экспрессирующие на своей поверхности CD 11с-антиген, они не несут миелоидных маркеров, имеют очень высокий уровень экспрессии - Т-клеточного рецептора BDCA-2 (CD303), их жизнедеятельность и дифференцировка зависят от ИЛ-3 (CD123) [11], а не от ГМ-КСФ как в миелоидной линии. При определенных условиях, ПДК способны активировать Т-лимфоциты в сторону Т1і2-ответа.
Развитие и свойства ПДК. ПДК имеют общего предка с классическими ДК - плюрипотент-ную гемопоэтическую стволовую клетку и образуются в костном мозге через ряд предшественников. В зрелом виде ПДК циркулируют в периферической крови, где их количество не велико и составляет всего 0,3-0,5%, также присутствуют в костном мозге (до 1%), тимусе, селезёнке и лимфатических узлах. ПДК практически отсутствуют в периферических тканях. Исключением являются ткани печени, в которой количество ПДК достигает 10%.
В покоящемся состоянии (вне активации), ПДК имеют лимфоид-ную форму и морфологию секреторных клеток. После активации, в ответ на воздействие вирусов и нуклеиновых кислот ПДК способны вырабатывать в 100-1000 раз больше ИФН широкого спектра (ИФН I и III типа), чем другие клетки организма, а также презентировать АГ Т-лимфоцитам [12,15]. Уникальная двойственная природа ПДК даёт возможность говорить о ключевой роли этих клеток во врожденном иммунном ответе на многие вирусные инфекции, включая ВИЧ (HIV), ВГС (HCV) и ВГВ (HBV). Однако, постоянная активация ПДК приводит к массивной и неконтролируемой выработке ИФН и как следствие может быть причиной таких аутоиммунных заболеваний как псориаз и СКВ [69,111,112,114,116,117].
Особенности ПДК и уникальные механизмы их активации. Ключевым и специфическим фактором дифференцировки ПДК, обуславливающим их «ответвление» от ДК, является, открытый в 2008 году B.Reizis et al., ген транскрипции Е2-2 [13]. Это открытие стало мощным стимулом для более глубокого изучения ПДК и их роли в иммунном ответе организма. Фактор транскрипции Е2-2 играет важную роль в приобретении ПДК общих свойств с лимфоцитами, в частности, секреторной морфологии. Отсутствие гена Е2-2 или его дефект вызывает спонтанное превращение ПДК в КДК. Однако, только незрелые ПДК костного мозга могут преобразовываться в КДК. ПДК, прошедшие дифференцировку и полностью зрелые, не могут преобразовываться в КДК. Белки Е-типа необходимы практически на всём пути развития Т- и В-лимфоцитов. Наличие гена дифференцировки Е2-2 в ПДК и заинтересованность Е - белков в развитии Т- и В-лимфоцитов, вероятно объясняет лимфоидную морфологию ПДК [12,13,14].
Наличие ИФН в сыворотке крови является маркером активации одной из первых линий защиты, направленной против внутриклеточных инфекционных агентов. Каждая клетка организма способна вырабатывать ИФН. Однако, пути активации выработки ИФН в обычных клетках существенно отличаются от таковых в ПДК.
Развитие вирусных инфекций сопровождается возбуждением Toll-подобных рецепторов (TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9) и цитоплазма-тических РНК геликаз, активирующих сигнальные пути, которые при -21 водят к транскрипции интерфероновых генов (ISG) [20,26,27,28]. Обычные клетки экспрессируют на своей поверхности Toll- подобный рецептор 3(TLR3), распознающий вирусную РНК\ДНК. TLR3 имеет большое значение для индукции ИФН в ответ на воздействие двухце-почечной вирусной РНК. После распознавания образуется комплекс, который при помощи эндоцитоза попадает в клетку, после чего в комплексе «рецептор-вирус» происходит разрыв связи и распознающий рецептор возвращается на клеточную поверхность. Под воздействием цитоплазматических геликаз активируются транскрипционные факторы IRF3 и NF-kB, которые важны для синтеза эффекторных белков, тормозящих вирусную репликацию. В обычной клетке IRF3 находится в неактивной цитоплазматической форме [25]. После активации IRF3 происходит «пробная» выработка сравнительно небольшой порции ИФН. Интерферон, взаимодействуя со специфическими рецепторами (IFNAR) активирует цитоплазматические транскрипционные факторы STAT 1 и STAT 2, которые в свою очередь включают интерферон стимулирующие гены (ISG), расположенные в ядре клетки. Там же находится активный интерферон - регулирующий фактор (IRF 7), который включает транскрипцию ИФН и ISG, что приводит к массивной выработке ИФН. Все эти механизмы происходят в обычной клетке при продолжающемся действии вируса. Пик секреции ИФН в сыворотке достигается только через 24 часа.
Методы тестирования маркёров вируса гепатита С
Так, в одной из недавних клинических работ [89], показано, что процент ПДК у пациентов (64 пациента с генотипом вируса ГС 1 В) при хронической HCV инфекции (0.32 %, диапазон 0.08-1.44 %) был немного уменьшен, по сравнению со здоровыми людьми (0.39 %, 0.17-5.1 % р=0.0323). В группе пациентов со стойким вирологическим ответом процент ПДК значительно увеличился, приближаясь к нормальным показателям после терапии (в среднем 0.31-0.36%, р=0.0497), а у пациентов с рецидивом ГС количественные показатели ПДК не изменились (0.33-0.30%). По данным авторов другой работы [90] (обследовано 13 больных с ОГС, 32 пациента страдающих ХГС и 20 здоровых лиц), при ОГС уровни ПДК в периферической крови были значительно снижены по сравнению со здоровыми (в среднем 0.1% против 0.36%, р 0.0005) и были обратно пропорциональны показателям уровня ала-нинаминотрансферазы (г = -0.823, р О.005), также в работе говорится о незрелости ПДК и снижении их способности продуцировать ИФН I типа (в среднем 3,5 pg/50, 000 мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), против 498,4 pg/50, 000 РВМС у здоровых контроля, р 0,0005). Менее выраженные изменения были представлены в группе с ХГС (в среднем 0,17%, 28,0 pg/50, 000 РВМС ИФН-а, соответственно). При ХГС восстановление функции ПДК происходит не полностью, что может быть связано с хроническим воспалительным процессом.
При обследовании 43 больных ХГС и 26 здоровых лиц Kanto Т et al [91] показывают снижение аллогенной стимуляции CD4 Т лимфоцитов, способность ПДК производить (IL)-12 р70 и ИФН a. Liang Н et al [87] в своей работе утверждают, что ПДК при ХГС являются функционально несовершенными за счет ингибрующего влияния HCV на экспрессию TLR7 in vitro. В другой работе [101] рассмотрено влияние вирусных белков на выработку ИФН в ПДК. Авторы утверждают, что в случае стимуляции ПДК, которые были обработаны NS3 белком, производство ИФН-а сократилось до 126 пг/мл по сравнению с 245 пг/мл в контрольной группе (р 0,01), а при обработке NS5 - ИФН-а производство сократилось до 92 ПГ/мл, по сравнению с 238 пг/мл в контроле (Р 0,05). При ВГС с наличием NS5 белка, отмечалось ослабление стимулирующей функции ПДК, необходимой для поляризации Т- клеточного ответа. Снижение пролиферации Т-клеток приводит к снижению производства ИФН-гамма - до 86 пг/мл, по сравнению с 260 пг/мл в контрольной группе (Р 0,05). Эти результаты свидетельствуют о том, что ВГС NS5 ухудшает функции ПДК in vitro.
В противоположность этому утверждению, Zhang YL et al [88] демонстрируют: геномная HCV РНК и полученный синтетическим методом CpG олигонуклеотид оказывают выраженный иммуностимулирующий эффект через возбуждение TLR7, a Lai WK, Curbishley СМ. et al [92] показали, что ПДК в печени присутствовали в более низких частотах при HCV инфекции, однако имели высокие уровни регулирующего рецептора BDCA-2.
С другой стороны, существуют работы, говорящие о том, что количество и функции ПДК не меняются при хроническом течении гепатита. Так, в клинической работе Piccioli D et al [93] авторы утверждают, что частота ПДК и продукция ими ИФН а у пациентов с хронической HCV инфекцией не отличаются от таковых у здоровых людей, при этом их аллостимуляторная активность также не снижается. Из этого авторы делают заключение, что ПДК не поражаются при HCV инфекции. Столь существенные противоречия объясняются различными методическими подходами и тем, что изучение этих вопросов только начинается.
Почти совсем не изучено влияние противовирусной терапии (ПВТ), применяемой для лечения пациентов с ХГС, на ПДК и их функциональные возможности. Единичные данные о том, что функции ПДК восстанавливаются после проведения ПВТ [89,90,94,96,97], требуют подтверждения.
В работе Shiina М et al. [94] авторы проанализировали влияние ПВТ на ПДК у 17 больных ХГС на 12 и 16 неделе её проведения. По данным работы отмечено снижение количества ПДК на фоне проведения ПВТ и восстановление показателей после её окончания. С другой стороны, Goutagny N et al. [96] говорят о снижении продукции ИФН в ПДК у пациентов, получавших ПВТ и ответивших на неё прекращением репликации вируса (78 шЛмл; п=10), в отличие от здоровых (1502 пг\мл; п=Т2), а также пациентов, не получавших ПВТ (1313 пг\мл; п=12). В исследовании показано, что этот «дефект» достоверно коррелирует с процентным содержанием ПДК.
Интересные данные представлены в исследовании Longman RS et al [97]. Авторы сообщают, что процент ПДК у больных ХГС достоверно ниже, чем у здоровых (0.11 против 0.34; Р = 0,004). Снижение ПДК, по их мнению , привело к уменьшению выработки ИФНа. Однако, когда был проведён полный анализ, выяснилось что у HCV-инфицированных больных уровни выработки ИФН были равнозначны таковым у здоровых.
Связь количественных показателей ПДК с клинико лабораторными параметрами у детей, больных ХГС
Базовые методы обследования проводились в лаборатории ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (заведующий - к.м.н. Шипулин Г.А.) и в иммунологической лаборатории СНИО и ЭП СПИД (заведующий - академик РАМН, профессор Покровский В.В.): -Клинический анализ крови определялся на гематологическом анализаторе AST diff (производство Beckman Coulter). -Биохимический анализ крови (определение ACT и АЛТ, билирубин, креа-тинин, ЩФ и др.) проводилось при помощи тест-системы Abbott Diagnostics ARCHITECT, в частности реагент для определения АЛТ и реагент для определения аспартат аминотрансферазы.
Исследование маркёров репликации вируса гепатита С (РНК вируса гепатита С качественное и количественное исследование) и определение генотипа вируса в сыворотке проводилось на базе ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, в клинико-диагностическом отделении (зав. отделением к.м.н. Чуланов В.П.). Для определения использовали метод полимеразной цепной реакции. РНК HCV определяли с использованием коммерческих наборов реагентов производства ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии»" Роспотребнадзора; Россия: «АмплиСенс ЯСУ-Монитор-FL" и "АмплиСенс HCV-reHOTHn-FL".
При необходимости уточнения диагноза, проведения дифференциальной диагностики с другими видами поражения гепатобилиарной системы и определения степени фиброза проводились дополнительные методы исследования: УЗИ брюшной полости, фиброэластография печени на аппарате «Фиброскан» и др. в соответствии с конкретными диагностическими задачами.
Для определения количества и функции плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК) в периферической крови у детей и взрослых, больных хроническим вирусным гепатитом С, а также у здоровых лиц, использовались специальные методы исследования. Исследование проводилось на базе иммунологической лаборатории СНИ и ОЭП СПИД (заведующий - академик РАМН, профессор Покровский В.В, зав. иммунологическим подразделением - к.м.н. Серебров-ская Л.В.).
Образцы крови для подсчета относительного и абсолютного количества плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК) отбирались утром, натощак, путем венепункции. Кровь собиралась в вакуумную пробирку VACUTANER с антикоагулянтом К3ЭДТА.
Для определения основных гематологических показателей (общего количества лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и др.) образцы исследовались на гематологическом анализаторе ACT Diff, Beckman Coulter.
Относительное и абсолютное количество ПДК определяли методом проточной цитометрии, на цитофлуориметре EPICS XL (Beckman Coulter) с добавлением моноклональных антител (МаТ):
CD303 антитела (BDCA-2), человеческие, конъюгированные с флюорес-цин-изоцианатом (FITC) - в периферической крови антиген строго экспрессиру-ется на плазмоцитоидных дендритных клетках и позволяет напрямую дифференцировать ПДК;
CD 123 антитела (интерлейкинЗ - рецептор а цепи), мышиные, конъюгированные с фикоэретрином (РЕ) (производства фирмы Miltenyi Biotec) - антиген строго экспрессируется на плазмацитоидных дендритных клетках;
К 100 мкл цельной крови, предварительно аккуратно перемешанной, добавляли 10 мкл CD303 и 20 мкл CD 123. Кровь тщательно перемешивали с МаТ и инкубировали в течение 20 минут в темноте, при комнатной температуре. Затем к образцу добавляли 500 мкл лизирующего раствора Optilyze (Beckman Coulter), перемешивали и через 20-30 минут инкубации в темноте, при комнатной температуре, добавляли 500 мкл PBS, перемешивали и инкубировали еще 20 минут при тех же условиях. Перед анализом на проточном цитофлуориметре добавляли 100 мкл частиц FlowCount и тщательно перемешивали. Гейтирование осуществляли по двум каналам светорассеивания (forward scatter, side scatter). Сбор данных прекращали при 100 000 лимфоцитов в каждом образце (рисунок 3.2.4.1).
Определение функционального состояния ПДК (выработка интерферона) проводилось в два этапа:
На первом этапе проводилась стимуляция плазмоцитоидных дендритных клеток для последующего определения выработки ими интерферона. Стимуляция образцов периферической крови больных ХГС и здоровых лиц проводилась в инкубаторе при 37С и 5% С02 с использованием специфических стимуляторов, таких как:
ODN2216 - синтетический олигонуклеотид, содержащий CpG ODN в определённых последовательностях, специфичен для распознавания TLR 9 и приводит к сильному иммуностимулирующему эффекту -активации выработки интерферона в ПДК (InvivoGen, USA)
Интерлейкин 3 (IL3) - полипептидный цитокин, относящийся к группе гранулоцитарно-макрофагальных колониестимулирующих факторов, применяется для стимуляции и дифференцировки клеточного роста наиболее ранних предшественников кроветворных клеток. Получение клеточных супернатантов дляопределения выработки ИФН в ПДК. Стимуляция клеток периферической крови больных ХГС и здоровых лиц проводилась в течение 24 часов в инкубаторе при 37С и 5% С02 с использованием специфических стимуляторов. Для этого заранее готовились 2 раствора: Раствор А состоял из ODN2216, RPMI1640. Готовый раствор однократно замораживали по 200 мкл и хранили при - 20С. Раствор В включал: 20% BSA, гепарин, IL3 и RPMI1640. Он так же однократно замораживался по 200 мкл и хранился при - 20С.
Связь функционального состояния ПДК с клинико лабораторными параметрами у детей, больных ХГС
У взрослых функциональное состояние ПДК при ХГС проанализировано по той же схеме, что и у детей. Так, нами обнаружена связь функционального состояния ПДК и уровня вирусной репликации. Показано, что высокие уровни выработки ИФН (422,8±191,5) характерны для низких уровней репликации вируса и наоборот. В то же время у больных с отсутствием репликации вируса (52,9±30,3) выработка ИФН в ПДК не отличается от таковой у здоровых (таблица 5.3.1 и рисунок 5.3.1).
Соотношение выработки_ИФН в ПДК и цитолиза у взрослых пациентов Важным, на наш взгляд, является установленная чёткая взаимосвязь уровня выработки ИФН с фиброзом (таблица 5.3.3 и рисунок 5.3.3). У больных с продвинутым фиброзом( Р4,циррозом печени) уровни вырабатываемого в ПДК интерферона в 17 раз выше - 291,3±195,9, чем в группе с отсутствием фиброза -16,7±9,2 (р 0,0001).
Нами выявлена также достоверная связь (р 0,05) между выработкой ИФН в ПДК и генотипом вируса ГС. Оказалось, что у взрослых больных, страдающих ХГС с генотипом вируса 1В,уровни вырабатываемого ИФН достоверно выше, чем у больных с генотипом - ЗА (таблица 5.3.4 и рисунок 5.3.4).
Возраст пациентов и уровень выработки ИФН также взаимосвязаны между собой. В группе до 40лет уровень выработки ИФН почти в 5 раз выше, чем после 40 лет, что возможно связано с процессами старения в организме (таблица 5.3.5 и рисунок 5.3.5). Полученные нами данные подтверждают тот факт, что возраст является одним из существенных факторов для прогноза течения заболевания и эффективности терапии у больных ХГС.
Анализируя связь функционального состояния ПДК с полом пациентов, мы, как и у детей, показали, что у мужчин, больных ХГС, выработка ИФН в ПДК в 2 раза ниже, чем у женщин: 194,1±94,7 против 393,9±216 (таблица 5.3.6, рисунок 5.3.6), что согласуется с известным фактом лучшего течения ХГС у женщин по сравнению с мужчинами.
Сравнительный анализ функционального состояния ПДК у детей и взрослых, больных ХГС По данным нашей работы, выработка ИФН в ПДК взаимосвязана с уровнем вирусной репликации, оставаясь как у детей, так и у взрослых выше нормы. Однако продукция ИФН в 2раза ниже у детей, чем у взрослых (таблица 5.4.1).
Дети Взросл Дети Взросл Дети Взросл ые ые ые Выраб 45,42 52,9± 197,6 422,8± 75,7± 147,1± р25=0,0001 р1"4=0,8831 отка ±39 30,32 ±49,73 191,54 20,75 59,86 р3 6 0,0001 ИФН пг\мл Интересно, что зависимость функционального состояния ПДК и цитолиза у детей и взрослых носит разнонаправленный характер (таблица 5.4.2 и рисунок 5.4.2). Возможно, связь с цитолизом опосредована виремией, степень которой у детей чаще, чем у взрослых не соответствует уровню трансаминаз.
Столь же сложны взаимоотношения со степенью фиброза печени, анализ которых у наших пациентов оказался возможен лишь при F0 и Fl(y обследован -98 ных детей фиброз 2-46. не выявлен) При отсутствии фиброза у детей выработка ИФН оказалась достоверно выше, чем у взрослых: 93,45±37,2 и 16,7±9,2; р1" 2 0,0001 соответственно, однако при формировании начального фиброза отмечено повышение количества продуцируемого ИФН у взрослых (таблица 5.4.3). Так как разграничение фиброза 0 б. и 16. по данным эластометрии печени достаточно условно, изучение связей между функциональным состоянием ПДК и фиброзом подлежит в дальнейшем более детальному изучению.
Дети Взрослые Дети Взрослые Вьфаботка ИФНпг\мл 93,45±37,2 16,7±9,2" 112,1±32,7 132,8±71,064 р12 0,0001 р3_4 0,0001 Влияние генотипа вируса ГС у детей и взрослых однонаправленно: выработка ИФН в случаях с 1В генотипом достоверно выше, чем при генотипе ЗА. Однако, показатели выработки ИФН в детском возрасте у больных с генотипом 1В в 2 раза ниже, чем у взрослых (таблица 5.4.4 и рисунок 5.4.4).
Таким образом, функциональное состояние ПДК достоверно связано с основными факторами, характеризующими течение и исходы ХГС: вирусной нагрузкой, цитолизом, фиброзом и генотипом вируса, а также с полом и возрастом больных. Выработка ИФН в ПДК у здоровых лиц не определяется и вероятно блокирована пока неизвестными ингибиторами, тогда как у всех больных ХГС достоверно выше нормы. ИФН-образование в ПДК у детей менее интенсивно, чем у взрослых, больных ХГС. Последнее может быть предположительно объяснено необходимостью роста и развития, являющихся сверхзадачей детского возраста.
Важной частью исследования является анализ влияния ПВТ на количественные показатели и функциональное состояние ПДК у обследованных пациентов.
В работе проанализировано изменение количественных показателей ПДК в зависимости от проведения противовирусной терапии (ПВТ) у детей с ХГС (табл. 6.1.1.). Показано, что в группе больных, обследованных во время проведения противовирусной терапии, абсолютное количество клеток снижено по сравнению с группой больных, в которой терапия не проводилась (7,1 ±1,15 и 15,4±1,2 соответственно р 0,0001).У прошедших лечение пациентов абсолютное количество ПДК зависело от её исхода: у больных, не ответивших на ПВТ количество клеток не отличается от такового у больных без терапии и гораздо выше - 11,6±1,6, чем в группе лиц, достигших устойчивой вирологической ремиссии - 7,1 ±1,15 (р=0,044 соответственно).
Отмечено, что процентный состав клеток также изменяется в зависимости от наличия или отсутствия и результата проведения ПВТ. Так, в группе больных, не получавших ПВТ, показатель процентного состава клеток 0,3±0,02 достоверно более высокий по сравнению с группой, обследованной во время её проведения -0,19±0,03 (р=0,01).Также, как и в абсолютном исчислении, процент ПДК у больных, не ответивших на ПВТ, не отличался от соответствующих параметров у пациентов, не получавших лечения (0,3±0,02 и 0,3±0,04 соответственно р=0,6), и не отличались от нормальных. В то же время у ответивших на ПВТ процентное содержание ПДК было существенно снижено по сравнению с нормой , 18±0,05 против 0,27±0,045; р=0,004) (таблица 6.1.1, рисунок 6.1.1).
Похожие диссертации на Патогенетическое и клиническое значение плазмоцитоидных дендритных клеток при вирусном гепатите С у детей и взрослых
