Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор 14
Глава 2 Материал и методы исследований 73
2.1. Объекты исследований 73
2.2. Методы исследований 75
2.3. Способ прижизненной клинической оценки состояния осетровых рыб 79
Глава 3. Характеристика микробного фона комбикормов для рыб и экспресс-метод его контроля 88
3.1, Структура микробного фона комбикормов для рыб и характеристика доминирующих групп 89
3.2, Изменения бактериальной обсеменеяности комбикормов при различных условиях хранения 93
3.3, Тест-система для микробиологической характеристики рыбных комбикормов 97
Глава 4. Особенности воздействия преобладающих форм микроорганизмов комбикормов на молодь осетровых рыб 107
4.1. Влияние заражения комбикормов энтеробактериями (сем. Enterobacteriaceae) нарост, физиологическое состояние и обмен веществ молоди осетровых: 110
4.1.1 Влияние заражения комбикормов кишечной папочкой (Escherichia coli) на молодь стерляди и сибирского осетра 112
4.1.2. Заражение комбикормов протеем (Pr. vulgaris) и его влияние на рост, физиологическое состояние и обмен веществ молоди стерляди 140
4.13. Влияние различной степени заражения комбикормов цитробактером (Citrobacter sp.) на молодь стерляди 159
4.2. Поражение комбикормов стафилококками (St. epidermidis) и его влияние на молодь стерляди 175
43. Влияние на молодь стерляди заражения комбикормов бактериями рода Bacillus 189
4.4, Характеристика воздействия комбикормов, зараженных дрожжеподобными и плесневыми грибами, на молодь стерляди...202
4.4.1 Дрожжеподобные грибы (Candidaalbicans) 202
4.4.2. Плесневые грибы {Penicillium sp.) 220
Глава 5. Применение пробиотических препаратов, как биологический метод повышения резистентности и лечения осетровых рыб в индустриальных условиях 231
5.1. Использование пробиотиков в качестве способа повышения резистентности и лечения бестера старших возрастных групп при выращивании в установках с замкнутым циклом водообеспечия...241
5.2. Оценка воздействия пробиотических препаратов на Микробиоценоз кишечников и продуктивность молоди осетровых рыб 251
5.3. Применение пробиотических препаратов для формирования микробиоценоза кишечника личинок сибирского осетра и повышения их резистентности 261
Заключение 272
Выводы 277
Список использованных источников 281
- Способ прижизненной клинической оценки состояния осетровых рыб
- Изменения бактериальной обсеменеяности комбикормов при различных условиях хранения
- Поражение комбикормов стафилококками (St. epidermidis) и его влияние на молодь стерляди
- Оценка воздействия пробиотических препаратов на Микробиоценоз кишечников и продуктивность молоди осетровых рыб
Введение к работе
Анализ современных тенденций и прогноз развития производства продукции водных биологических ресурсов свидетельствуют, что статус и место любой страны в этой области во многом тлті^ят от состояния аквакультуры. Сегодня на ее долю приходится около половины мировой продукции гидро-бионтов (FAO Fisheries Circular, 1988-1997; 2003). Актуальные задачи науки в этой области значительно меньше, чем ранее, связаны с созданием технологий культивирования, которые, в основном, имеются. На первый план выходит выявление узких мест, изучение механизмов, сдерживающих реализацию продуктивного потенциала объектов и разработка биологически оправданных предложений по решению имеющихся проблем (Карпевич, 1985, 1998; Душкина, 1998).
Для нашей страны в этом аспекте актуален вопрос об аквакультуре осетровых рыб. Уникальный опыт заводского воспроизводства этих ценных видов, обязанный во многом воплощению результатов эколого-физиологических исследований Н.Л. Гербильского (1949, 1953, 1962, 1966), В.В. Мильштейна (1940, 1962), Г.С. Карзиыюгаа (1942, 1952), И.Ф. Вельтищевой (1951, 1955), Б.Н. Казанского (1957, 1963); Ю.Ю. Марти (1972, 1979) и других ученых явился, в свое время, основой сохранения промысла осетровых рыб. Это происходило в условиях мощного антропогенного воздействия, практически полностью исключившего естественный путь пополнения популяций. Нынешняя, не менее сложная ситуация, диктует необходимость интенсификации осетроводства. На современном этапе их культивирование в управляемых условиях становится основной возможностью получения молоди, предназначенной для выпуска в естественные водоемы и производства востребованной пищевой продукции (Строганов; 1968, Николюкин, Бурцев, 1969; Бурцев, Николаев, 2004).
Одной из важнейших основ интенсификации производства продукции при культивировании любых видов животных является рациональное кормле-
ниє, основанное на применении высокоэффективных комбикормов. Благодаря успехам науки о питании рыб разработаны биологически обоснованные комбикорма, состав которых, на основе имеющихся современных научных данных, в основном соответствует пищевым потребностям рыб и задачам культивирования (Щербина. 1973; Щербина, Гамыгин. 1987; Гамьтгпн, Пономарев и др.. 1990; Остроумова, 2001; Гамыгин и др., 2004; Щербина, Гамыгин, 2006), Ассортимент комбикормов постоянно расширяется за счет разработки новых ре-цептур, более соответствующих потребностям рыб, введения новых компонентов и совершенствования способов изготовления, позволяющих на основе ресурсосберегающих технологий выпускать продукцию все более высокого качества,
Для осетровых рыб, на основе изучения их пищевых потребностей в основных питательных веществах, аминокислотах и жирных кислотах, витаминах, разработаны стартовые и продукционные комбикорма (Абросимова и др. 1984; Абросимова, 1997; Бондаренко, 1984; Пономарев и др., 1997; Судакова, 1998). В то же время реальная практика осетроводства свидетельствует, что проблема кормления осетровых рыб решена далеко не полностью.
Современные тенденции рационального и эффективного кормления требуют весьма значимого смещения акцентов в сторону надежного обеспечения безопасности кормов, используемых для выращивания животных и рыб, в аспекте накопления в пищевых цепях негативных для человека факторов (Codex alimentarius, 1963). Известно, что большинство компонентов комбикормов нередко содержат контаминаиты - комплекс чужеродных веществ, способных оказывать отрицательное влияние на общее состояние здоровья и продуктивность объектов выращивания (Тутельян, 1985; Чернышов, Панин; 2000). Поэтому в животноводстве присутствие контаминантов в кормах регламентируется показателями безопасности, которые устанавливаются в соответствии с особенностями влияния этих веществ на организм. В связи со сравнительно недавней историей индустриального культивирования рыб, многие показатели безопасности комбикормов, в силу своей недостаточной изученности, приняты по
аналогии с теплокровными животными, без учета биологических особенностей рыб и специфики их выращивания (ГОСТ Р 51899-2002). В то же время активность естественного иммунитета рыб, в частности осетровых, намного ниже, чем у теплокровных животных (Лукашенко, 197 К 1989; Кондратьева, Киташо-ва,2002).
Серьезную опасность представляют контаминанты, присутствие которых в комбикормах для рыб обусловлено особенностями их пищевых потребностей - высоким содержанием белка и липидов, К ним относятся продукты перекис-ного окисления жиров и жизнедеятельности микроорганизмов - грибов и бактерий. Вопросы воздействия на рыб продуктов окисления липидов и продуцируемых грибами микотоксинов, изучались достаточно подробно (Абрамова и др., 1981; Шаталина и др., 1974, 1986; Галаш, 1988, 1990; Остроумова, 2001; Головина, 2003). В то же время бактериальное заражение кормов для рыб остается в ряду наименее изученных. При этом имеются сведения, что микробная контаминация кормов вызывает изменения в их химическом составе, снижает пищевую ценность, приводит к накоплению токсичных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов и нарушает нормальную микрофлору пищеварительного тракта (Марченко, 1987; Чернышов, Панин, 2000),
С позиций современной теории питания (Уголев, 1985, 1991; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005) нормальная микрофлора пищеварительного тракта, являясь симбионтом, участвует не только в процессах расщепления питательных веществ корма, синтезе жизненно важных соединений, но и выполняет защитную функцию. У человека и теплокровных животных негативные изменения в составе микробиоценоза кишечника приводят к нарушениям переваривания и усвоения пищи и целостности его защитных барьеров. Это способствует снижению резистентности организма и сопровождается проникновением бактерий из пищеварительного тракта во внутренние органы, сокращением их функциональной активности и ухудшению деятельности иммунной системы. В литературе приводятся отдельные сведения об аналогичных явлениях, обнаруженных у рыб под действием микроорганизмов кормов (Жезмер и др., 1988,
7 1991). Однако, особенности комплексного влияния на рыб наиболее значимых групп микроорганизмов, поражающих комбикорма, знание которых необходимо для понимания их специфического воздействия на состояние здоровья и реализацию продуктивного потен и нала рыб, не были изучены.
Контаминация комбикормов является од мим из негативных факторов, по-стоянно действующих в условиях интенсивного культивирования. К ним также относятся высокие плотности посадки, повышенное содержание в воде токсичных продуктов метаболизма рыб и органическое загрязнение, сопровождаемые бурным развитием микрофлоры (Ведемейер, 1981). Влияние этих факторов усугубляется весьма значимой зависимостью рыб от качества среды обитания. Отрицательное воздействие вынуждает организм рыб направлять часть своих сил на адаптацию к подобным условиям, что приводит к усилению напряженности иммунитета, ухудшению здоровья, снижению темпа роста и выживаемости.
Селекция осетровых рыб в направлении устойчивости к воздействиям условий индустриального культивирования только начинается. Поэтому особую актуальность приобретает поиск способов повышения их резистентности, позволяющих уже на современном этапе добиться более полной реализации продуктивного потенциала и обеспечить выпуск в естественные водоемы жизнеспособной молоди.
В связи с вышеизложенным, цель настоящей работы была сформулирована следующим образом: определить роль микробной контаминации комбикормов как фактора, лимитирующего реализацию продуктивного потенциала и жизнеспособность осетровых рыб и разработать способ повышения их резистентности в аквакультуре. Для достижения цели были поставлены следующие задачи;
1. Изучить степень опасности для рыб микроорганизмов, преобладающих в рыбных комбикормах:
выявить преобладающие формы;
оценить динамику бактериальной обсемененности комбикормов при хранении;
8 оптимизировать способы контроля качественных и количественных характеристик микробной обсемененности комбикормов,
2. Выявить биологические особенности воздействия преобладающих в
комбикормах форм микроорганизмов на молодь осетровых рыб, включая:
рост и жизнеспособность,
клинико-морфологическое состояние и степень обсемененности внутренних органов, наиболее подверженных поражению микроорганизмами,
влияние на метаболизм.
Дать предложения к требованиям безопасности комбикормов для осетровых рыб по микробиологическим показателям.
3. Теоретически обосновать целесообразность и применить пробиоти-
ческие препараты для обеспечения резистентности осетровых рыб в аквакуль-
туре, включая:
выбор и испытания препаратов;
исследование особенностей воздействия пробиотиков на нормализацию микробиоценоза кишечника, состояние здоровья и продуктивность осетровых рыб;
разработку способа применения пробиотиков на ранних этапах жизненного цикла осетровых рыб;
- создание специализированного препарата.
Основные положения, выносимые на защиту.
Контаминация комбикормов наиболее типичными для них микроорганизмами является одним из негативных факторов индустриальной аквакульту-ры, который приводит к снижению резистентности системным и функциональным нарушениям в осуществлении процессов жизнедеятельности молоди осетровых рыб и их пониженной жизнеспособности.
Существующие нормативы безопасности не соответствуют реальной степени отрицательного воздействия микробной обсемененности комбикормов на состояние здоровья и реализацию ростового потенциала молоди осетровых рыб.
9 Сходство влияний симбионтной микрофлоры на эффективность осуществления защитной функции пищеварительного тракта у пойкилотермных и гомойотермных животных позволяет посредством использования ветеринарных и видоспецифичных пробиотических препаратов повысить резистентность и продуктивность осетровых рыб в условиях интенсивного культивирования.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые получена комплексная характеристика реакции молоди осетровых рыб на микробное заражение комбикормов на различных функциональных уровнях. Показано, что длительное время (1,5-2 мес) она может иметь скрытую форму. При сохранении выживаемости рыб в пределах технологических нормативов и незначительном торможении их роста происходят, как правило, необратимые структурные и функциональные изменения иммуннокомпетентных органов, которые ответственны за детоксикацию и удаление из организма микрофлоры и продуктов ее жизнедеятельности (печень, почки, кишечник). На метаболическом уровне хроническая интоксикация, вызываемая микробным заражением кормов, приводит к разнонаправленным нарушениям водного и липидного обмена, угнетению синтеза белка и повышенному расходу энергии на нейтрализацию токсического действия; а в поддерживающем обмене - к нарушениям соотношения в утилизации белков и липидов, резкому снижению жизнеспособности рыб, особенно в неблагоприятных условиях.
Впервые примененный комплекс клинико-морфологических, микробиологических и физиолого-биохимических исследований при питании рыб и последующем голодании позволил выявить и описать индивидуальный характер воздействия на состояние здоровья, обмен веществ, рост, выживаемость и жизнеспособность молоди осетровых рыб следующих основных микроорганизмов, контаминирующих комбикорма: кишечной палочки (Escherichia coli), протея (Proteus vulgaris), цитробактера (Citrobacter sp.), стафилококка (Saphylococcus epidermidis)l картофельной палочки (Bacillus mesentericus), дрожжеподобных (Candida albicans) и плесневых (Penicillium sp.) грибов.
10 Впервые экспериментально обоснованы предельно переносимые молодью осетровых рыб уровни контаминации комбикормов изученными микроорганизмами.
Теоретически обоснована и экспериментально доказана целесообразность использования пробиотических препаратов для повышения резистентности, профилактики и лечения заболеваний осетровых рыб, связанных с микробным заражением комбикормов, а также повышения их продуктивности при индустриальном культивировании; показана перспективность направленного формирования микробиоценоза кишечника на ранних стадиях развития осетровых рыб, наиболее важных для дальнейшей реализации потенциала роста.
Впервые на основе видоспецнфнчных штаммов лактобактерий создан пробиотический препарат для осетровых рыб «Аквалакт» (совместно с ІіПЦ «ЦМВЭИ»).
Практическое значение работы. Научно обоснована и экспериментально доказана опасность кормления осетровых рыб комбикормами, контаминиро-ванными наиболее распространенными микроорганизмами. Показана необходимость пересмотра и ужесточения требований к безопасности комбикормов для осетровых рыб по микробиологическим показателям. Обоснована возможность повышения нормативных показателей выживаемости молоди осетровых рыб, за счет ужесточения требований к безопасности комбикормов по микробиологическим показателям.
Определены предельно-переносимые молодью осетровых уровни контаминации комбикормов следующими микроорганизмами: кишечная п&точка (, coli) - 1х103, протей (Pr. vulgaris) - 1x104, цитробактер {Citrohactcr sp.) - 5xI05T стафилококк эпидермальный (Si, epidermidis) - 5x10 t картофельная палочка (Вас. mesenterial) -5х105? дрожжеподобные грибы (Candida albicans) -lxlO4, плесени (Penicillium sp.) -lxlO4.
Разработаны модификация экспресс-системы Petrifilm ЗМ и руководство по ее использованию для характеристики микробной обсеменеиности рыбных комбикормов.
Предложен способ прижизненной первичной рыбоводной оценки клинического состояния осетровых рыб при выращивании в индустриальных условиях.
Научно обоснована и экспериментально доказана эффективность применения пробиотических препаратов для повышения резистентности и оздоровления осетровых рыб в условиях интенсивной аквакультуры.
Подобраны и испытаны новые эффективные ветеринарные пробиотиче-ские препараты «Биокорм-Пионер» и «Интеетевит». Показана целесообразность их курсового применения с интерв&чом 10 суток.
Создан специализированный комплексный пробиотический препарат для осетровых рыб «Аквалакт» на основе видоспецифичных штаммов лактобакте-рий.
Разработан способ направленного формирования микрофлоры личинок осетровых рыб на ранних этапах постэмбрионального развития (до перехода на активное питание).
Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курса лекций «Аквакультура», «Кормление рыб», «Болезни рыб» для студентов биологических и рыбохозяйственных факультетов ВУЗов.
Апробация, Материалы диссертации представлены на международных конференциях:
«World Aquaculture» (Бразилия, 2003; Индонезия 2005; Италия 2006); «Aquaculture Europe» (Испания, 2004; Норвегия 2005); 5th International Symposium on Sturgeon (Иран, 2005); научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития аквакультуры в России (Краснодар, 2001); международной научно-практической конференции «Аквакультура начала XXI века (Москва, 2002); международном симпозиуме «Холодноводная аквакультура: старт в XXI век» (Санкт-Петербург, 2003); III и IV международных научно-практических конференциях «Аквакультура осетровых рыб: достижения и перспективы развития» (Астрахань, 2004, 2006); конференции "Развитие рыбохо-зяйственного комплекса России" (Санкт-Петербург, 2004); научно-
12
практической конференции "О приоритетных задачах рыбохозяйственной нау
ки в развитии рыбной отрасли до 2020 года" (Москва, 2004); международной
# научно-практической конференции "Повышение эффективности использования
водных биологических ресурсов Мирового океана" (Москва, 2005).
Публика ни и. По теме диссертации опубликовано 38 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 319 стр. текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Включает 52 таблицы, иллюстрирована 37 рисунками, В списке литературы - 418 наименований, в том числе 145 работ на иностранных языках. Схема и основные направления исследований приведены на рис. 1,
Благодарности. Автор выражает свою искреннюю признательность и
F благодарность всем, чьи знания, умение, опыт, ценные советы и поддержка
оказали огромную помощь в выполнении этой работы; директору ВНИРО к.г.н.
і Б.Н, Котеневу, зав. сектором Ж,Т. Дергалевой, д.б.н., профессору МА. Щерби-
не, к.блї. А.И. Николаеву, д.бл., профессору Е.В. Микодиной, с.н.с- ІСБ. Авети-сову, к. вет. н, Е.В. Малику, к.б. н. Л,Н. Юхименко, к.б.н. Л.И. Бычковой, к.б.н. КВ. Воиновой, зав. сект. И.В. Яхонтовой, к.б. н, Н.В. Судаковой, вед. инженеру К.В. Дудину, редактору В.В. Донской, вед. инженеру АЛ. Васильевой, сотрудникам лаборатории сохранения биоразнообразия ценных гидробионтов ВНИРО.
Изучение структуры микробного фона комбикормов
Энтеро-бактерии
Стафилококки
Бациллы
Грибы и дрожжи
Оценка реакций осетровых рыб на заражение комбикормов микроорганиз-
7^
Рыбоводно-биологические показатели
Физиолого-
биохими ческа е исследования
Выбор способа повышения резистентности осетровых рыб в условиях аквакультуры
Клиническиеj пато-
м орфологические и
м и кроб ио л огиче ские
исследования
Применение про биотических препаратов
Создание специализированного препарата
печень
Поиск и подбор ветеринарных препаратов
питание
і
кишечник
Выделение автохтонных микроорганизмов
голодание
ZI2>2^
почки
мышцы
химический статус
Разработка и изготовление препарата дли осетровых рыб
Оценка эффективности применении иробиоти-кон для осетровых рыб в индустриальных условиях
Предложения к нормированию показателе безопасности микрофлоры комбикормов
Разработка способа направленного формирования микробиоценоза личинок
Испытания па молоди русского осетра и стерляди
Испытания на старших возрастных группах бестера
Разработка экспресс-метода контроля микрофлоры
КОРМОВ
Разработка прижизненного способа клинической оценки состояния осетровых рыб
Предложения по использованию пробиотических препаратов в условиях ипдуетрпальпои аква-
Рис L Схема и основные направления исследований
Способ прижизненной клинической оценки состояния осетровых рыб
Для характеристики клинического состояния рыб существует немало методических приемов, но в большинстве своем они основаны на анализах показателей крови или данных о биохимическом составе органов и тканей рыб (Головина, 1996). Эти исследования достаточно трудоемки и их проведение возможно только в лабораторных условиях. Кроме того, в большинстве случаев они не могут быть осуществлены прижизненно.
К прижизненным показателям, регистрируемым в обычной рыбоводной и ихтиопатологической практике, как правило, относят изменения в поведении рыб, снижение у них аппетита и дальнейшее прекращение питания, сверхнормативный отход. Скрытое отрицательное воздействие патологических агентов можно установить только при вскрытии погибших рыб и обнаружении изменений во внутренних органах.
Однако к объективным показателям, отражающим благополучие условий культивирования, можно отнести и характеристику состояния рыб по внешним признакам. С этой целью нами был разработан способ прижизненной клинической оценки состояния осетровых рыб (Бурлаченко, Бычкова, 2005), который в течение нескольких лет апробирован при проведении практических работ в условиях опытно-промышленной установки ВНИРО с замкнутым циклом водо-обеспечения.
Известно, что осетровые рыбы, несмотря на эволюционную устойчивость и способность кратковременно переносить высокие концентрации загрязняющих веществ различной природы, обнаруживают заметную чувствительность к длительному воздействию факторов, связанных с недостаточной очисткой воды. По литературным данным и собственным наблюдениям, наиболее сильное воздействие оказывают высокий уровень нитритов (более 0,5 мг/л), понижение содержания растворенного в воде кислорода до 4 мг/лэ повышенный бактериальный фон (общее микробное число (ОМЧ) более 3000 колонии образующих единиц (КОЕ)/мл), характеризующийся преобладанием агрессивных бактерий кишечной группы.
Перечисленные факторы приводят к снижению общей резистентности, способствуют заражению рыб эктопаразитами с его последующим нарастанием. Внешние проявления реакции организма рыб на подобные воздействия достаточно характерны и хорошо видны даже на начальной стадии, когда внутренние патологии в большинстве случаев еще не имеют необратимого характера. Своевременное лечение или проведение комплекса соответствующих мероприятий дают возможность предотвратить потери большого количества рыб.
По ігашіш наблюдениям, при повышенном уровне ершдаесшт и вызываемого им бактериального шряшен м, вшіболее хюквзателвньши внешними пртнжшчш мршгъртуттът неблагоприятное состояние осетровых являются покраснения и шзжвлешл внешних скелетных образований - жучек Развитие поражения жучек имеет достаточно четкую иоеяедователшоеть. Km нрввшю е начале поражаются ешшше жучки. При этом шшетят у рыб существенно снижается, что приводит ic увеличению жстрйкишш из корма органических БЄЩЄ01Н, вымыванию несведённого корма ю бассейнов, дальнейшему усилению органического и бакгериалшого загрязнения воды ш нарастанию патологий- Вслед за ты у осетров развиваются повреждения брюшных жучек я покраснение кождах покровов брюха (рис. 3). Рнбві почти яолпостыо прекращают цмтэтшт
Поражение бежедых и явдетовш; жучек, их кровоточи весть повреждение мягких тканей хвосшвого стебля (при отеугствии немедленных лтФмых мероприятий) предшествуют началу массовой гибели рыб- Помимо поражений жучек ошеч&етея юешжние от уса, что тпжлт характерным признаком витерита.
Изменения бактериальной обсеменеяности комбикормов при различных условиях хранения
В таких компонентах комбикормов, как рыбная мука, в процессе хранения уровень бактериальной обсемененности претерпевает значительные изменения (Сафронова, Шендерюк, 2001). В растительных компонентах его динамика выражена значительно меньше (Чернышов, Панин, 2000).
В связи с вышесказанным, представлялось целесообразным оценить особенности динамики бактериальной обсемененности комбикормов в стабильных условиях хранения и при повышении влажности, что, как правило, имеет место в рыбоводных хозяйствах. Для получения более полного представления о динамике микробной обсемененности комбикормов для рыб были также проведены наблюдения за ее изменениями в кормах одного состава, но имеющих различный уровень заражения микроорганизмами.
В исследованиях использовали стартовый комбикорм для осетровых (влага - 8,3%, сырой протеин - 42%», жир - 7,8%, энергия 3560 ккал/кг). Его общая бактериальная обсемененность составила 2,1хЮ4КОЕ/г, при этом значительная доля (более 76%) приходилась на бактерии p. Staphylococcus (по биохимическим свойствам - St. saprophyticus). При моделировании изменений условий хранения часть корма была подвергнута кратковременному увлажнению (повышение влажности корма на 10% в течение 12 часов). Для наблюдений за динамикой различных уровней бактериальной обсемененности провели экспериментальное заражение исследуемого корма в трех концентрациях, В качестве заражающего агента был использован эталонный штамм Staphyolococcus epidermidis АТСС 14990.
Заражающий агент и предполагаемая степень обсеменения были выбраны, исходя из обобщенных данных о частоте встречаемости микроорганизмов в кормах, уровнях их обсемененности и уже имеющихся результатов собственных исследований (Бурлаченко и др., 2001, 2002}. Заражение кормов и контроль в шх микробиологических показателей проводился и лаборатории мию ра&тж тц Ростовского центра по сертификация «Донтее п .
Ре:зультш иевдедомнмй кштрояьшго образца позволили установить что общая (штщттнит оСкжытснвоеть шрэда составила 1 8-2ЛхЮ КОЕ/г, при тгом значительна доля (более 76%) приходилась на бактерии p. Staphylococcus (по бтшшчоскш евойств&м - St saprophyiwm),
В коде трсзшадзчішк наблюдший чз бактериальным фоном этого корма, принятого а контроль было отмучено невдтороо еннжшне общего уровня об-ССИІЇКШНОУШЯ и мдасе значимое - для стафилококков. Следует отметить» что корм %,ртмжя в тпбипьиык условиях температуры и илажностм (количество влш и в в но прешщ&но 8,3%)- В то же дреш, даже незначительное увлажнена отдельной партии норма (повышение содержания влага до 9,6%) нрядашш К рижому и Йыетроуу (ш іечение 4 чщів) &щраст$нщі обидой бактериальной обадададенности бвіїес чем в 6 р&ч (рыс. 5), шторм сменилась стабилизацией ори снижении содержании в .шш до первоначального ур щщ Полученные дш ные шляются убедиіедьнїш иллюстрацией необходимости сойлюдіївш условий крщения ішр&тн к чжл нести, шх защиты отуз-шщясн щ
Наблюдения в течение 3-х месяцев за экспериментальными партиями корма, зараженными культурой St, epidermidis, позволили выявить общую тенденцию изменений степени бактериальной обсемененности (табл. 6), Максимальный уровень зараженности после внесения в корм бактериальной культуры был отмечен на третьи сутки. При этом степень обсемененности корма заражающим агентом (St. epldermidis) составляла от 80 до 100%, К концу первого месяца хранения во всех вариантах, независимо от степени заражения, произошло снижение показателя общей микробной обсемененности. Причем в варианте наиболее сильного заражения падение численности микро-организмов было максимальным-от 2,6x10 КОЕ/г до 2,7x10 КОЕ/г.
В последующие два месяца хранения бактериальная обсемененность кормов во всех вариантах изменялась незначительно, однако, тенденция к ее снижению, хотя и в значительно меньшей степени, сохранилась.
Наблюдаемые изменения связаны с активным накоплением в корме экзотоксинов, вырабатываемых бактериями, и токсичных продуктов деградации белков и липидов. Токсины, аккумулируясь, подавляют рост и самих микроорганизмов. Подтверждением этого факта является отмеченный в ходе наблюдений переход бактерий St. epidermidis из активной S-формы (в начале эксперимента) в ослабленную R-форму (в конце эксперимента), что свидетельствует об отрицательном влиянии накопления токсичных веществ.
Аналогичные изменения происходят и в процессе хранения рыбной муки (Сафронова, Шендерюк, 2001), Накопление в корме с высокой бактериальной обсемененностью токсических веществ подтверждают также и результаты наших опытов, показавшие отрицательное воздействие таких кормов на физиологическое состояние и обмен веществ питавшейся ими молоди стерляди и ленского осетра (Бурлаченко и др., 2001, 2002 а, б). В этой связи необходимо отметить, что при традиционном бактериологическом контроле кормов, проводимые определения характеризуют состояние обсемененности в конкретный момент времени. Поэтому, особенно если речь идет о кормах, хранившихся более месяца, получаемые показатели, не превышающие нормативных значений, не могут служить гарантией отсутствия в корме токсичных веществ, которые МОГЛИ образоваться ранее в результате жизнедеятельности бактерий.
В заключении следует сказать, что результаты исследований явились еще одним подтверждением необходимости соблюдения условий хранения комбикормов (в частности, недопущения повышения влажности), а также целесообразности использования интегральных методов оценки их безопасности
Поражение комбикормов стафилококками (St. epidermidis) и его влияние на молодь стерляди
Стафилококки являются второй по значимости группой микроорганизмов, доминирующей в комбикормах, частота их встречаемости достигает 20%.
Из группы стафилококков для исследований был избран эпидермальный (или белый) стафилококк (St. epidermidis). По своей способности к токсинооб-разованию и вирулентности он сходен с золотистым стафилококком, но эти свойства у него выражены значительно слабее, т.е. в основном он менее агрессивен (Фробишер, 1965).Как и все стафилококки, он не требователен к питательным средам и биохимически активен, продуцирует такие ферменты пато-генности как коагулазу (сворачивает плазму крови), гиалуронидазу (фактор распространения), лицитиназу (растворяет лецитин клеточных оболочек), фиб-ринолизин (лизирует фибрин), ДНКазу (деполимеризует ДІЖ), фосфатазу и др., устойчив к антибиотикам (Черкес и др., 1987).
Помимо факторов патогенносте он характеризуется способностью к активному гидролизу белков и жиров, устойчив к охлаждению, а также к высоким концентрациям соли (до 10% и более), хорошо переносит высушивание. Термическая обработка продуктов вызывает гибель стафилококков при условии достаточной интенсивности и продолжительности - при температуре 75-80 С они погибают лишь через 20-30 минут.
Весьма существенна для рыбоводства их способность восстанавливать нитраты до более ядовитых нитритов, что очень важно при выращивании рыб в системах с замкнутым циклом водообеспечения. Целью данного раздела явилось изучение воздействия эпидермального стафилококка (St. epidermidis), наиболее часто обнаруживаемого в комбикормах, на рост, обмен веществ, физиологическое состояние и выживаемость молоди стерляди.
Предварительно было проведено экспериментальное заражение трех партий стартового комбикорма для осетровых производства «Гипрорыбфлот-Экос», имевших следующий состав (%): влага - 8,3 сырой протеин - 51, жир -11Д энергия 3560 ккал/кг. В качестве заражающего агента был использован эталонный штамм St. epidermidis АТСС 14990. Фактический уровень обсемененности комбикорма St epidermidis составил 2x104, 1,3x10й, 1,2x108 КОЕ/г корма.
Опыты на молоди стерляди (начальной массой - 27-29 г) проводили в проточных аквариумах. Средняя температура за период экспериментов составила 23С (колебания от 19 до 25С). Продолжительность опыта - 55 суток. Контролем служил вариант, где молодь получала тот же корм без бактериальной культуры St. epidermidis. По окончании кормления видимой разницы в скорости роста рыб, питавшихся контрольным и зараженными кормами, не обнаружено. Средняя масса молоди составляла 47-49 г без каких-либо значимых различий между вариантами. Выживаемость молоди была близка к нормативной.
Клинико-морфологический анализ состояния внутренних органов молоди стерляди позволил обнаружить изменения, связанные с присутствием в комбикормах различных количеств стафилококка (табл. 29). Согласно приведенным в таблице данным, можно говорить, что в начале этой серии опытов состояние внутренних органов молоди стерляди было благополучным. После питания рыб как зараженными, так и незараженными комбикормами, следует отметить негативное действие контрольного комбикорма, который оказал повреждающее влияние на все обследованные внутренние органы - и в максимальной степени - на печень. Это дает основание говорить, что изначально, еще до заражения стафилококками, комбикорм содержал контами-нанты неизвестного происхождения с достаточно сильно выраженным токсическим действием. Более наглядно изменения внутренних органов, обнаруженные у молоди стерляди, питавшейся комбикормами с различной степенью заражения стафилококками, приведены на рис 15 и 16.
Заражение корма бактериями, в начальной и увеличивающихся концентрациях (от 2х104 до 1,2x10е КОЕ/г корма), и накопление продуктов их метаболизма на протяжении опытного периода, в отдельных случаях усилило отрицательные эффекты, которые мы могли визуально регистрировать на внутренних органах. С повышением степени обсемененности корма стафилококками наиболее четко удалось уловить снижение активности функции слизеотделения в кишечнике, которое отмечалось наряду с истончением его стенок.
Как уже было показано ранее в опытах с заражением кормов энотеробак-териями, уменьшение толщины слизистой оболочки кишечника, так же как и нарушение отделения слизи, являются серьезными проявлениями патологических процессов, результатом которых становится ухудшение эффективности переваривания и всасывания пищи.
Данные о неблагополучном состоянии внутренних органов были дополнены их микробиологической характеристикой. Согласно ей после питания комбикормами, зараженными St epidermidis в минимальной степени (104), увеличилось не только количество рыб, характеризующихся присутствием микроорганизмов во внутренних органах, но и значительно возрос уровень их обсемененности. Подобное бактериальное поражение внутренних органов рассматривается как следствие различных нарушений процесса их нормального функционирования, особенно, если речь идет о присутствии бактерий, являющихся индикаторами высокого органического загрязнения (Moraxella, Aeromonas hy-drophila и др-J при их обнаружении в печени и почках. Следует также отметить присутствие стафилококков в печени и почках молоди стерляди из варианта 1,3х106.
Появление в вариантах заражения корма стафилококком 1,3x10 и 1,2x10 КОЕ/г большого количества (40%) рыб с мышцами, сильно пораженными плесневыми грибами, также свидетельствует о резком снижении их резистентности. В кишечниках стерляди, питавшейся зараженными кормами, отмечены и изменения бактериального сообщества. Они выразились в замене обычного состава микрофлоры (БПШ, Aeromonas sp. Citrobacter) на более агрессивную и менее специфичную для молоди осетровых микрофлору {Aeromonas sp. 5, Е.соїі с пониженной ферментативной активностью, различные плесени). Следствием изменений явилось ухудшение процессов переваривания и усвоения пищи, что привело к низкому темпу роста рыб (CW-0,9%). Наряду с этим, высокая степень обсеменения паренхиматозных органов микроорганизмами свидетельствовала о нарушении целостности слизистой кишечника, и, как следствие, снижении ее защитных свойств и уровня общей резистентности молоди.
Присутствие в кормах стафилококков сопровождалось достаточно четко выраженными изменениями в химическом статусе рыб (табл. 30). Была выявлена обратная связь между степенью заражения корма и относительным содержанием в теле рыб белков и липидов. В опытных вариантах, по сравнению с контролем, можно отметить уменьшение относительного содержания сухого вещества на 7-8%, что означает обводнение организма, а также снижение уровня сырого протеина до 7%, Различия в содержании минеральных веществ составляли от 3 до 13%, Однако, в вариантах с зараженными кормами, содержание минеральных элементов было выше, чем в контроле, причем, разница по этому показателю последовательно увеличивалась по мере увеличения степени заражения корма. Но наиболее значимыми были отличия в содержании липидов, и по мере увеличения зараженности корма отмечено их последовательное снижение. По сравнению с контролем, в варианте с минимальной степенью заражения их содержание было ниже на 26%, в двух следующих - на 36%». Этими различиями обусловлена и меньшая (до 14%) обеспеченность рыб энергией.
Оценка воздействия пробиотических препаратов на Микробиоценоз кишечников и продуктивность молоди осетровых рыб
Как указывалось в аналитическом обзоре, одним из значимых элементов неспецифической защиты живого организма от неблагоприятных воздействий окружающей среды является его пищеварительная система и, в частности, сим-бионтная микрофлора, населяющая кишечник (Кузьмина, 1995). Свойственная каждому организму микрофлора появляется в кишечнике вскоре после рождения животного и сосуществует с ним всю жизнь. Изменения естественной среды обитания приводят к соответствующим качественным и количественным изменениям в составе и численности микрофлоры. В условиях индустриального культивирования возможность формирования и поддержания микрофлоры, специфичной для объектов выращивания, весьма ограничена, что связано с особенностями их содержания и кормления (Шивокене, 1989; Малик Н,, Панин, Малик Е., 2000)- Именно поэтому одним из важных условий повышения резистентности живых организмов в условиях культивирования может служить нормализация микробного биоценоза в кишечнике путем введения в корм пробиотических препаратов.
В этой связи целью раздела явилось изучение воздействия на микробиоценоз кишечника молоди осетровых пробиотических препаратов, как фактора повышения обшей резистентности рыб к условиям индустриального культивирования и увеличения продуктивности рыб. Изучали влияние пробиотиков на продуктивные показатели (продукцию и затраты корма), а также на ускорение нормализации общего состояния молоди осетровых рыб после голодания. Работа выполнялась совместно с Н.В. Судаковой, Е.И. Балакиревым, Д.А. Мордов-цевым, Для экспериментов были избраны ветеринарные пробиотические препараты «Биокорм-Пионер» и «Интестевит», различающиеся принципом действия и набором микроорганизмов.
Первый - «Биокорм-Пионер», представляет собой комбинацию лиофили-зированных культур двух генетически модифицированных штаммов Вас. subtillis. Находящиеся и размножающиеся в просвете кишечника бактерии этого вида образуют метаболиты, которые подавляют рост патогенной и условно-патогенной микрофлоры. В частности, стафилококков, протея, шигелл, эшери-хий, псевдомонад, грибов рода кандида и других организмов. Препарат предупреждает развитие дисбактериозов, способствует стимуляции клеточных и гуморальных факторов иммунитета. Бактерии Вас. subtillis не способны колонизировать кишечник, и после прекращения применения препарата они постепенно выводятся из организма. Одним из важных преимуществ препарата является использование спорообразующих микроорганизмов. Это обеспечивает его высокую технологичность при введении в корма, так как споры способны выдерживать достаточно жесткие условия обработки при гранулировании и экстру-дировании в процессе изготовления корма. Кроме того, подобные препараты сохраняют свою жизнеспособность при длительных сроках хранения комбикормов.
Второй препарат - «Интестевит», в отличие от первого содержит комплекс лиофильно высушенных культур бифидобактерий Bifidobacieriumum globsum, стрептококков Enterococcus faecium и Вас. subtillis. Две первые группы бактерий, входящие в этот препарат и являющиеся представителями нормальной микрофлоры теплокровных животных, способны к активной колонизации слизистой оболочки кишечника и образованию на ней биопленки. Более подробно свойства этого препарата описаны в разделе 5.1. Эти препараты используются в ветеринарии для теплокровных животных и птиц.
