Введение к работе
Актуальность проблемы. Действие на организм низких температур является одним из важнейших неантропогенных факторов, в значительной степени определяющим зоны проживания и характер жизнедеятельности людей в средних и высоких широтах. Даже кратковременное воздействие низких температур небезразлично для человека, длительное пребывание в условиях холода может привести к серьезным нарушениям функций организма (Gyilerap S. et al., 1993).
История изучения механизмов адаптации к холоду насчитывает много десятилетий, однако с углублением знаний в этой области и усилением методической базы науки перед исследователями встают все новые вопросы к появляются новые возможности их решения.
Исследования воздействии холода на организм человека всегда связаны с трудностями организационного и этического характера. Кроме того, на определяемые показатели неизбежно оказывают влияние факторы, отличающиеся между собой по механизму воздействия, такие, как физические нагрузки, характер питания, изменения светопериодики и другие (Reed H.L. et al. 1990). Это приводит к значительному сужению круга решаемых задач, и работ, в которых представлены результаты комплексных исследований, немного (Панин Л.Е., 1978,1983;Тигранян Р.А., 1990; Куликов В.Ю., 1994).
Проведенные сотрудниками НИИ биохимии СО РАМН обследования зимовщиков Антарктиды и дрейфующих станций, участников высокоширотных экспедиций и жителей Крайнего Севера выявили значительные отличия всех видов обмена веществ от "среднестатистического стандарта". В результате этих исследований был выделен и описан "полярный метаболический тип", который характеризуется в первую очередь усилением липидного и снижением углеводного обмена (Панин Л.Е., 1978, 1983).
Активация липидного обмена сопровождается значительными эндокринно-метаболическими изменениями, в том числе и содержания различных фракций сывороточных липопротеинов. Роль этих высокомолекулярных частиц в адаптивных процессах остается малоизученной, но исследования последних лет обнаружили способность белковых компонентов липопротеинов - апопро-теинов - оказывать влияние на регуляторные процессы в клетке (Панин Л.Е. и др., 1991,1995).
В биохимических исследованиях, проводимых у человека, для изучения доступны лишь жидкие среды организма. Биопсия. органов, проводимая у'больных по строгим показаниям (Trijbels J.M.F.
et al., 1988), является не правилом, а исключением при обследовании здоровых людей (Rusko Н. et al., 1980). За пределами допустимых экспериментов на людях-добровольцах на помощь приходят математические модели (Holmer I., 1995) и эксперименты на животных.
В настоящее время изучение механизмов адаптации к холоду в эксперименте проводится на двух основных моделях: Харта - при постоянном длительном содержании животных при +5С (Hart J.S., Jansky L., 1963) и Леблана - многократных, но коротких воздействиях холода (-20С) (LeBlanc J., 1967). Одновременно существует большое количество вариантов этих моделей. Сложность интерпретации полученных в различных лабораториях данных состоит в том, что механизмы развития устойчивости к холоду в этих моделях отличаются между собой (LeBlanc J., 1992). Кроме того, исследования проводятся на разных видах животных и при различных сроках холодового воздействия (Banet М., 1988). Однако достаточно редко встречаются работы, в которых прослеживаются изменения организма в динамике процесса адаптации. Зачастую отличается и физиологическое состояние животных на момент взятия материала для исследований (Панов А.В., 1984). Поэтому возникает необходимость проследить в стандартных условиях на животных одной линии процесс становления устойчивости организма к холоду.
Одна из центральных ролей в обеспечении энергетических потребностей организма при действии на него низких температур принадлежит печени, ее вклад в термогенез может достигать 25% дополнительной теплопродукции (Jansky L., 1971). Но данные о влиянии низких температур на энергетическое состояние печени неоднозначны и противоречивы, что может быть следствием методических особенностей проводимых экспериментов. Кроме того, обычно авторы ограничиваются в своих исследованиях митохондриаль-ным уровнем, не давая оценки эффективности адаптивных перестроек энергетических процессов на уровне организма.
Соотношением специфических и терморегуляторной функций органов в значительной степени определяется цена, которой организм расплачивается за развитие устойчивости к холоду (Панин Л.Е., 1978). Но вопрос о состоянии метаболических функций печени, в частности, способности к биотрансформации эндо- и ксенобиотиков на разных этапах адаптации к холоду, остается открытым. Имеющиеся экспериментальные данные о монооксигеназной системе печени, участвующей в I фазе метаболизма многих физиологически активных соединений, получены при различных
сроках и режимах низкотемпературного воздействия и поэтому достаточно противоречивы и не отражают динамики процесса холодовой адаптации (Семенюк А.В. и др., 1983; Matsuyama К. et al., 1983). Работ, посвященных изучению II фазы метаболизма в условиях холодового воздействия на организм, в литературе мы не встретили.
До сих пор остается спорным вопрос, в какой мере эффекты холодового воздействия, обнаруживаемые на изолированных органел-лах, отражают состояние энергетических процессов в целом организме. Параллельные исследования на субклеточных структурах и интактных клетках могут существенно помочь в отделении артефактов от подлинных процессов, протекающих in vivo.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение состояния энергетического обмена организма и участия печени в развитии метаболической адаптации к холоду, а также исследование связи между явлениями, регистрируемыми in vitro, с процессами, происходящими на уровне целого организма.
В ходе исследований предстояло решить следующие задачи:
-
Оценить состояние эндокринно-метаболических процессов у человека при длительном воздействии холода и у экспериментальных животных на модели Харта в различные сроки адаптации.
-
Оценить функциональное состояние митохондрий печени крыс в динамике холодовой адаптации.
-
Изучить роль переносчика адениннуклеотидов в регуляции ионного транспорта и энергозависимых функций митохондрий печени при воздействии холода на крыс.
-
Оценить состояние основных кислородпотребляющих процессов в печени в различные сроки холодового воздействия.
-
Изучить влияние длительного холодового воздействия на мо-нооксигеназную систему печени, на I и II фазы биотрансформации ксенобиотиков.
-
Исследовать связь между явлениями, регистрируемыми in vitro, с процессами, происходящими на уровне целого организма, сопоставив изменения электрического трансмембранного потенциала митохондрий (АЧР) и физико-химического состояния мембран митохондрий печени с ДО и состоянием мембран тимоцитов и трансмембранным электрическим потенциалом клеток периферической крови (лейкоцитов) в динамике адаптации к холоду.
Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы по теме: "Изучить роль адениннуклеотид-
транслоказы и сывороточных липопротеинов в регуляции энергетического обмена в печени при адаптации к холоду". Номер государственной регистрации 01.9.10 049382.
Научная новизна. Впервые на различных этапах арктического лыжного перехода проведены комплексные биохимические исследования с использованием нагрузочных проб, что позволило выявить изменения характера реагирования эндокринно-метаболических систем на охлаждение и физические нагрузки в течение похода, обнаружить уменьшение специфичности ответных реакций и расширение числа компонентов, включающихся в эти реакции.
Впервые в эксперименте проведены комплексные биохимические исследования динамики процесса холодовой адаптации с акцентом на энергетику печени и сопоставление полученных данных с показателями состояния других систем организма. Выделены и прослежены фазы адаптивного процесса: начальная (1-8 сутки), критический период (9-15 сутки), фаза неустойчивой адаптации (3-4 недели), фаза устойчивой адаптации (5-7 недели), отличающиеся соотношением катаболических и анаболических процессов.
Впервые показано, что в различные фазы адаптации к холоду имеются характерные изменения активностей кислородпогреб-ляющих систем печени. Установлено, что наибольший вклад в усиление использования кислорода в течение всего адаптационного процесса вносит митохондриальное окисление, в критический период возрастает НАДФ Н-оксидазная активность эндоплазмагиче-ского ретикулума, не было обнаружено заметного усиления пере-кисных процессов, за исключением повышения ПОЛ в митохондриях в начальную фазу.
Впервые получены данные, показывающие изменения энергетического состояния печени крыс в динамике адаптации к холоду. Установлено, что на 10 сутки воздействия холода печень находится в низкоэнергетическом состоянии с низким содержанием АТФ и суммы адениннуклеотидов. В митохондриях снижаются дыхательный контроль и трансмембранный электрический потенциал, повышается ионная проводимость внутренних мембран, вследствие чего возрастает теплопродукция. Митохондрии печени адаптированных к холоду животных поддерживают содержание АТФ и пула адениннуклеотидов на уровне контроля, однако по ряду свойств они отличаются от митохондрий контрольных животных.
Впервые в эксперименте показана возможность участия аденин-нуклеотидтранслоказы (АНТ) в терморегуляторном ответе мито-
хондрий печени крыс, адаптируемых к холоду. Получены данные об участии длинноцепочечных ацил-КоА в увеличении катионной проницаемости митохондриальных мембран в результате взаимодействия с АНТ.
Впервые проведенные измерения и сопоставление трансмембранных потенциалов митохондрий печени, тимоцитов и лейкоцитов крови обнаружили однонаправленность изменений этих показателей в динамике холодовой адаптации, что является вкладом в решение методологической проблемы соотношения исследований in vitro и in vivo.
В проведенных впервые комплексных исследованиях активности ферментов I и II фаз метаболизма ксенобиотиков в различные сроки холодового воздействия выявлено усиление элиминации тест-препаратов в начальной фазе и в критический период адаптивного процесса.
В динамике адаптации показано увеличение содержания цито-хромов Р450 и Ъ5 в микросомах печени. Впервые при отсутствии экзогенных индукторов получены свидетельства изменения активности отдельных изоформ цитохрома Р450 в результате действия холода.
Впервые показано, что в различные фазы адаптации к холоду при одинаковой флотационной способности липопротеины отличаются величиной заряда, вязкостью липидов, белок-липидными взаимодействиями. Обнаруженные закономерные, обусловленные холодовым воздействием физико-химические перестройки плазменных липопротеинов объясняют изменения рецепторного захвата ли-попротеиновых частиц, и их регуляторного эффекта на метаболизм и ультраструктуры клетки, наблюдающиеся в условиях функционального напряжения организма.
Научно-практическая значимость. Исследования носят, в основном, фундаментальный характер. Проведение комплексных исследований в различные фазы адаптивного процесса дает возможность сопоставить результаты различных исследователей в области адаптации к холоду и объяснить некоторые имеющиеся противоречия.
Результаты исследований, показавших совпадение характера изменений трансмембранных потенциалов митохондрий печени и лейкоцитов, позволяют рекомендовать метод оценки трансмембранного потенциала лейкоцитов для апробации в клинике при диагностике заболеваний, связанных с нарушением митохондриальных функций, в частности, миопатий.
Обнаружение изменений физико-химических свойств сывороточных липопротеинов в условиях физиологических воздействий холода открывают новый подход к изучению региональных особенностей развития атеросклероза.
Данные об изменении скорости элиминации ксенобиотиков в условиях холодового воздействия необходимы для проведения рациональной фармакотерапии у лиц с различными сроками пребывания на Севере.
Обнаружение повышения в условиях холодового воздействия активности изоформ семейства цитохрома Р450ІА, ответственных за канцерогенез, ставит вопрос о продолжении исследований для выяснения биологической значимости феномена.
Результаты исследований, касающиеся механизмов реагирования человека на продолжительное действие холода и физические нагрузки, могут быть полезными при планировании, подготовке и проведении высокоширотных экспедиций, выборе оптимальных режимов работы в условиях среды с пониженной температурой. Положення, выносимые на защиту
-
Продолжительное воздействие холода и интенсивных физических нагрузок на человека вызывает закономерные изменения показателей базального метаболизма, которые проявляются повышением содержания катехоламинов и усилением липидного обмена. Регуляторные системы организма становятся более лабильными, а метаболические реакции генерализованными, что направлено на лучшее приспособление организма к высоким энергозатратам в условиях действия холода и физических нагрузок.
-
Процесс адаптации к длительному воздействию умеренно низких температур (модель Харта) носит фазовый характер и включает фазу острой адаптации, критический период, фазы неустойчивой и устойчивой адаптации. Фазы определяются соотношением катаболических и анаболических процессов. Механизмы, восполняющие энергозатраты организма, находятся под контролем адаптивных гормонов (катехоламины и тирео-идные гормоны) и в разные периоды отличаются между собой.
-
Увеличение потребления кислорода в печени в различные фазы адаптивного процесса, в основном, обусловлено возросшей активностью митохондриального окисления. Дополнительный вклад в повышение использования кислорода вносят в фазу острой адаптации перекисные процессы в митохондриях, в критический период и в фазу неустойчивой адаптации - активация НАДФН-зависимого окисления в системе эндоплазматического ретикулума.
-
В критический период митохондрии печени крыс претерпевают изменения, повышающие их вклад в термогенез. Адаптация к холоду переводит печень в стабильное энергетическое состояние, которое на фоне возросших энергозатрат обеспечивается повышением окислительной способности митохондрий и увеличением их трансмембранного потенциала. Митохондрии печени адаптированных крыс, имея сходные показатели скоростей дыхания с митохондриями контрольных животных, отличаются более высокой энерги-зацией.
-
В критический период адаптации адениннуклеотидтранслоказа участвует в формировании неспецифической катионной поры, повышающей проницаемость внутренней мембраны митохондрий и увеличивающей диссипацию энергии.
-
Интенсификация обменных процессов, направленных на повышение энергопродукции в условиях воздействия холода на организм, вызывает закономерные изменения способности печени к биотрансформации биологически активных веществ; в критический период активность ферментов, метаболизирующих эндо- и ксенобиотики, возрастает.
-
Усиление использования липидов при адаптации организма к низким температурам сопровождается стойким увеличением содержания в крови ЛПОНП и ЛПНП. Липопротеины сыворотки крови адаптируемых к холоду крыс, имея с липопротеинами контрольных животных одинаковые флотационые характеристики, отличаются от них величинами зарядов, вязкостью липидов, характером белок-липидных взаимодействий.
-
Направленность изменений трансмембранного электрического потенциала (A*F) интактных клеток периферической крови и ти-моцигов при адаптации экспериментальных животных совпадает в._.- -целом с динамикой ДЧ* митохондрий печени, отражая общее состояние биоэнергетических процессов в организме.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на II Всесоюзной конференции "Важнейшие теоретические и практические вопросы терморегуляции", Минск, 1986; XI Всесоюзном симпозиуме "Биологические проблемы Севера", Якутск, 1986; IV Всесоюзной научной конференции "Адаптация человека к климато-географическим условиям и первичная профилактика", Новосибирск, 1986; Республиканском симпозиуме "Особенности липид-ного обмена в условиях Сибири и Дальнего Востока", Чита, 1987; Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987; IV Всесоюзном Съезде патофизиологов "Нарушение механизмов ре-
гуляции и их коррекция", Кишинев, 1989; Всесоюзной конференции памяти А.Д.Слонима "Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды", Новосибирск, 1990; VIII Международном конгрессе по приполярной медицине, Канада, 1990; Организационном Международном конгрессе по патологической физиологии, Москва, 1991; ХХШ сессии Общего собрания СО РАМН, Новосибирск, 1992; Республиканском симпозиуме "Монооксигеназная система. Теоретические и прикладные аспекты", Ташкент, 1992; IX международном симпозиуме "Microsomes and Drug Oxidation", Израиль, 1992; IV конференции "Биоантиоксидант", Москва, 1993; V Европейской конференции ISSX, Франция, 1993; VII Всероссийском симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации", Москва, 1994; II Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1995; X Международном конгрессе по приполярной медицине, США, 1996.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 39 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 364 страницах машинописного текста. Состоит из введения и 4-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов и выводов. Список литературы включает 217 отечественных и 295 зарубежных работ. Диссертация иллюстрирована 30 таблицами и 35 рисунками.
