Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время туберкулёз занимает ведущее место среди распространённых инфекционных заболеваний. Несмотря на то, что показатель заболеваемости населения в России в 2008 г. в среднем снизился на 9,2%, а показатель смертности по сравнению с 2000 г. – в 1,5 раза, в целом заболеваемость туберкулёзом продолжает удерживаться на высоком уровне [Перельман М.И., 2007; Мишин В.Ю., 2008]. В Томской области она составляет, по данным 2008 г., 101,3 случаев на 100 000 населения. При этом большая ее доля приходится на туберкулёз органов дыхания.
Основное место в лечении больных туберкулёзом заняла химиотерапия, требующая длительного применения противотуберкулёзных препаратов, которые могут вызывать напряжение ферментативных систем, нарушение обменных процессов и расстройство функционального состояния некоторых органов, что обусловливает развитие побочных реакций [Мишин В.Ю. и соавт., 2004]. Такие побочные эффекты как гепатит, диспепсия, экзантема и артральгия отмечаются у 23% туберкулёзных больных в течение интенсивной фазы лечения [Awofesoa N., 2008]. При этом иммунная система не является исключением, поскольку, выполняя основную функцию защиты, она является мишенью для действия повреждающих экзогенных и эндогенных факторов [Визель А.А., 2000; Фисенко В.А., 2006; Мишин В.Ю., 2007]. Развитие негативных лекарственно-индуцированных реакций повышает риск прекращения лечения, возникновения рецидива туберкулёзной инфекции и определяет увеличение продолжительности антимикобактериальной терапии [Schaberg T. et al., 1996; Yee D. et al., 2003; Лысов А.В. и соавт., 2006; Филинюк О.В. и соавт., 2008].
В последние годы становится очевидным, что антибиотики в дополнение к антибактериальной активности способны модулировать продукцию цитокинов и воспалительных медиаторов, в связи с чем могут оказывать значительное влияние на реакции иммунитета и развитие воспаления [Pasquale T. R., Tan J. S., 2005; Yuhas Y. et al., 2006].
Состояние факторов иммунологической защиты во многом определяет возможность заражения, а при развитии туберкулёзной инфекции – течение и исход заболевания. Важную роль в борьбе с болезнетворными бактериями играют альвеолярные макрофаги и различные субпопуляции Т-лимфоцитов, которые, как известно, осуществляют регуляцию фагоцитоза и лизиса микобактерий макрофагами, формирование специфического противотуберкулёзного иммунитета [Хонина Н.А. и соавт., 2000; Urdahl K.B. et al., 2003; Новицкий В.В. и соавт., 2006].
Однако, предполагая иммуносупрессорное действие химиопрепаратов в условиях характерного для туберкулёзного процесса вторичного иммунодефицита, без наличия соответствующих экспериментальных исследований нельзя с уверенностью судить об их вкладе в развитие данного состояния, так как практически нет работ, посвященных изучению иммунотропной активности препаратов химиотерапии туберкулёза лёгких. Необходимость использования для лечения одновременно нескольких противотуберкулёзных препаратов приводит к ситуации, в которой трудно определить, какой из используемых препаратов индуцирует нежелательный эффект. В то же время эксперименты in vitro позволяют оценить влияние конкретного препарата на отдельные параметры жизнедеятельности клеток.
В связи с вышеизложенным, важным аспектом современных исследований является изучение особенностей и механизмов влияния противотуберкулёзных препаратов на клетки иммунной системы, поскольку именно от их структурно-функционального состояния зависит иммунологическая реактивность организма, направленная на распознавание возбудителя, формирование иммунного ответа и элиминацию инфектогена.
Цель исследования: выявить особенности и механизмы иммунотропного действия противотуберкулёзных препаратов основного (первого) ряда у больных туберкулёзом лёгких in vitro.
Задачи исследования:
1. Определить уровень секреции про- и противовоспалительных цитокинов мононуклеарными лейкоцитами in vitro при действии противотуберкулёзных препаратов первого ряда (изониазида, рифампицина, этамбутола) у здоровых доноров и больных с лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным туберкулёзом лёгких.
2. Изучить прямое действие основных противотуберкулёзных препаратов на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких с лекарственной чувствительностью и устойчивостью возбудителя.
3. Оценить воздействие основных противотуберкулёзных препаратов на активность ферментов энергетического обмена (сукцинатдегидрогеназы, -глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы) в лимфоцитах периферической крови у здоровых доноров и больных с лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым инфильтративным туберкулёзом лёгких.
4. Провести сравнительную оценку влияния изониазида, рифампицина и этамбутола на мононуклеарные лейкоциты периферической крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких в зависимости от лекарственной чувствительности/резистентности возбудителя.
Научная новизна. Проведено комплексное изучение иммунотропных свойств препаратов базовой противотуберкулёзной терапии у больных с впервые выявленным инфильтративным туберкулёзом лёгких (до начала проведения им специфической терапии) и у здоровых доноров. Впервые показано, что противотуберкулёзные препараты способны in vitro оказывать стимулирующее и, напротив, подавляющее действие на функцию иммунокомпетентных клеток крови, выражающееся как активацией продукции мононуклеарными лейкоцитами про- и противовоспалительных цитокинов (IL-2 при действии рифампицина, IL-12 и IL-10 при действии изониазида), так и угнетением их секреции (IL-2 при действии изониазида, IL-12, IL-10, TGF- под действием рифампицина и IFN- под влиянием рифампицина и этамбутола) в сочетании с подавлением пролиферативной активности лимфоцитов (под влиянием этамбутола). Продемонстрировано, что у больных с лекарственно-резистентным туберкулёзом лёгких интенсивность базальной продукции IL-2 и IFN- ниже, а уровень спонтанной секреции IL-12, а также индуцированное белковым микобактериальным антигеном образование IL-12, IL-10 (в присутствии изониазида) и TGF- (в присутствии изониазида и рифампицина) выше, чем при лекарственно-чувствительной форме заболевания. Установлено, что противотуберкулёзные препараты основного ряда у здоровых доноров и больных туберкулёзом лёгких in vitro индуцируют апоптоз лимфоцитов крови и вызывают дисбаланс в активности внутриклеточных ферментов энергетического обмена. В частности обнаружено, что антимикобактериальные препараты первого ряда подавляют активность сукцинатдегидрогеназы на фоне компенсаторной активации -глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в лимфоцитарных клетках. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что у больных туберкулёзом лёгких рифампицин оказывает более выраженное иммунодепрессивное действие по сравнению с изониазидом и этамбутолом, что проявляется более высокой степенью угнетения им продукции провоспалительных моно- и лимфокинов (IL-12, IFN-) и активации апоптотической гибели лимфоцитарных клеток крови in vitro.
Практическое и теоретическое значение работы. Получены новые данные фундаментального характера о механизмах прямого супрессорного действия противотуберкулёзных препаратов основного ряда на мононуклеарные лейкоциты (лимфоциты и моноциты) крови у больных лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких. Результаты исследования теоретически обосновывают необходимость включения в стандартную программу лечения больных туберкулёзом лёгких иммуномодулирующих препаратов для профилактики и коррекции иммунодефицитных состояний, обусловленных влиянием не только возбудителя, но и противотуберкулёзной химиотерапии. Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе в Сибирском государственном медицинском университете на кафедре патофизиологии в тематических разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета» и кафедре фармакологии в лекционных и практических разделах по теме «Побочное действие антимикробных средств».
Положения, выносимые на защиту:
-
Противотуберкулёзные препараты основного ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол) in vitro оказывают сходное влияние на ферментативную, пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких. При этом их иммуносупрессорный эффект проявляется в большей степени на фоне туберкулёзной инфекции.
2. Иммунотропное действие препаратов базовой противотуберкулёзной терапии у больных туберкулёзом лёгких реализуется за счет индукции апоптоза лимфоцитов, подавления лимфопролиферации и секреции мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro провоспалительных (IL-2, IL-12, IFN-) и противовоспалительных (IL-10, TGF-) цитокинов.
3. Цитохимический дисбаланс в лимфоцитах периферической крови при действии основных противотуберкулёзных препаратов у больных туберкулёзом лёгких характеризуется дефицитом активности фермента цикла трикарбоновых кислот (сукцинатдегидрогеназы) в сочетании с компенсаторной активацией ферментов глицерофосфатного шунта (митохондриальной -глицерофосфатдегидрогеназы) и гликолиза (лактатдегидрогеназы).
4. У больных инфильтративным лекарственно-чувствительным туберкулёзом лёгких секреторная дисфункция мононуклеарных лейкоцитов, индуцированная противотуберкулёзными препаратами, более выражена, чем у больных с лекарственно-резистентным вариантом инфекции. При этом из противотуберкулёзных препаратов первого ряда наибольший отрицательный иммунотропный эффект оказывает рифампицин.
Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007), VIII, IX, X конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2008, 2009), Российско-германской конференции Форума Коха-Мечникова «Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007), XV Российско-японском Симпозиуме медицинского обмена «Москва-2007» «Медицинская наука и здравоохранение России и Японии в начале XXI века. Пути развития и перспективы» (Благовещенск, 2007), XI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (г. Новосибирск, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии» (Томск, 2009), VIII международной Российско-германской конференции «Нозокомиальные инфекции. Управление здравоохранением» (Новосибирск, 2009), а также на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2009).
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК №02.412.11.2040; ГК №02.512.11.2112; ГК №02.512.11.0013) и Совета по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ (НШ-4153.2006.7; НШ-2334.2008.7).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, 7 из которых (5 статей и 2 тезисов) в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 16 таблицами. Библиографический указатель включает 275 источников, из которых 141 отечественных и 134 зарубежных авторов.
