Введение к работе
Актуальность темы.
Создание новых методов формирования и изучения свойств высокоорганизованных органических и биоорганических тонкопленочных систем представляет собой одно из важнейших направлений научных разработок в области нанотехнологий. Это объясняется, прежде всего, возможностью модифицировать физические и химических характеристики таких систем в широких пределах, что позволяет получать тонкопленочные покрытия нанометрового диапазона с заранее заданными и самыми разнообразными свойствами. Важнейшей сферой практического применения молекулярных пленок является микроэлектроника. В этом случае главным достоинством молекулярных пленок является возможность создавать тонкие, однородные диэлектрические, проводящие и полупроводниковые слоистые структуры с резкими границами между слоями. Упорядоченные биоорганические пленки приобретают все большее значение для различных биотехнологических применений, к числу которых относится использование белковых пленок в качестве активных элементов биосенсоров, разработка биокатализаторов для биотехнологических процессов, создание синтетических нанобиоструктурных материалов для биомедицинских приложений и т.д.
Особый интерес к исследованию упорядоченных белково-липидных пленок связан с тем, что по своему составу и морфологии эти системы представляют собой адекватную модель биологических мембран. Такие исследования позволяют получать информацию о структурно-функциональном состоянии белково-липидных моделей клеточных мембран на молекулярном уровне и могут быть эффективно использованы для решения широкого круга задач, связанных с биомедицинской диагностикой и биофизическими исследованиями. Новые перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии и медицины открывает изучение белково-липидных пленок на поверхности жидкой субфазы, когда не нарушается нативная конформация белковых молекул, а, следовательно, сохраняются их биологические функции. Это дает принципиальную возможность моделировать
различные биофизические и биохимические процессы, протекающие в функционирующих мембранах.
Дальнейшее расширение границ применения органических и биоорганических слоистых наноструктур тесно связано с развитием новых физических методик для характеризации объектов, имеющих наноразмерную организацию. К числу наиболее перспективных современных методов диагностики тонкопленочных систем относятся рентгеновские методики, дающие спектрально-селективную структурную информацию, такие как метод стоячих рентгеновских волн (СРВ). Исследования тонкопленочных биоорганических систем с помощью метода СРВ основаны на одновременной регистрации рентгеновского отражения и выхода вторичного излучения (например, характеристической флуоресценции), возникающего при неупругом рассеянии рентгеновских лучей в условиях полного внешнего отражения. Главным преимуществом метода СРВ по сравнению с классическими рентгеновскими методиками является возможность напрямую определять местоположение атомов определенного сорта в слоистой системе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от этих атомов.
Важным шагом в развитии метода СРВ явилось применение этого метода для исследования белково-липидных слоев на жидкой субфазе, что потребовало решения целого ряда аппаратурно-методических задач, связанных с реализацией рентгенофлуоресцентных измерений при неподвижном положении образца. Несмотря на огромный потенциал метода СРВ, исследования органических слоев на жидкости с помощью рентгенофлуоресцентных измерений носят единичный характер. К началу настоящей работы существовали лишь две публикации американских и французских ученых по изучению процессов сегрегации ионов металлов из водной субфазы на мономолекулярный слой, нанесенный на поверхность водной субфазы.
Целью настоящей работы являлось развитие метода стоячих рентгеновских волн в области полного внешнего отражения для нанодиагностики
органических и биоорганических пленок на твердых подложках и на поверхности жидкой субфазы. Работа включала в себя решение следующих задач:
Разработка методики рентгенофлуоресцентных измерений в области полного внешнего отражения для изучения элементного состава и структурной организации молекулярных пленок, сформированных на поверхности жидкой субфазы;
Проведение исследований органических и биоорганических наносистем на жидкости в условиях, когда молекулы находятся в подвижном состоянии и обладают большой свободой движения;
Теоретический анализ особенностей рассеяния рентгеновского излучения в биоорганических наносистемах в условиях полного внешнего отражения;
Создание математических подходов для анализа экспериментальных данных по исследованию методом стоячих рентгеновских волн мономолекулярных слоев на жидкости.
Научная новизна. В ходе работы впервые:
Метод СРВ экспериментально реализован для исследования элементного состава и структурной организации мономолекулярных слоев, сформированных на поверхности жидкой субфазы. Преимущества развиваемого метода связаны с возможностью получать спектрально-селективную структурную информацию о динамичных двумерных системах, формирующихся в результате самопроизвольной организации молекул на межфазной границе жидкость/воздух.
Исследованы процессы самоорганизации, протекающие в белково-липидных пленках на поверхности жидкой субфазы, в условиях, когда липидные и белковые молекулы обладают высокой молекулярной
подвижностью. Продемонстрированы принципиально новые возможности, которые открывает применение метода СРВ для изучения белково-липидных моделей биологических мембран в условиях максимально приближенных к условиям их функционирования в живой клетке.
Получена новая информация о молекулярных механизмах повреждающего действия токсических агентов (тяжелые металлы и мочевина) на белково-липидные модели биомембран, сформированные на поверхности жидкой субфазы и на твердых подложках.
Экспериментально и теоретически изучено явление резонансного усиления волнового поля в биоорганических наноструктурах, сформированных на поверхности жидкой субфазы.
Теоретически проанализированы особенности волновых полей, формирующихся в слаборассеивающих органических пленках в условиях полного внешнего отражения. Получено аналитическое выражение для интенсивности выхода флуоресценции от мономолекулярного слоя в приближении линейного затухания эвансцентной волны.
Экспериментально обнаружено самопроизвольное присоединение ионов металлов из воды высокой степени очистки к белковым макромолекулам в результате конформационных перестроек, вызванных действием различных ксенобиотиков (токсические агенты и лекарственные препараты).
Метод СРВ применен для изучения молекулярных механизмов действия лекарственных соединений. Предложен новый подход для исследования эффективности и безопасности действия лекарственных соединений с использованием белково-липидных наноструктур в качестве изолированных моделей клеточных мембран.
Практическая значимость. Результаты работы представляют собой научно-методическую основу для спектрально-селективной структурной диагностики органических и биоорганических наносистем на жидкости и на твердых подложках.
Развито новое направление в применении метода СРВ - изучение элементного состава и молекулярной организации органических и биоорганических пленок, сформированных на поверхности жидкой субфазы. Научный задел по нанодиагностике белковых пленок на жидкости с применением спектрально-селективных рентгеновских измерений позволит существенно расширить возможности биофизических исследований по изучению структуры белково-липидных моделей клеточных мембран, а также выявлению механизмов повреждения клеточных мембран при патологическом воздействии на клетку.
Разработана методика измерения угловой зависимости выхода флуоресценции от молекулярных пленок в условиях полного внешнего отражения, позволяющая избежать искажений сигнала, связанных с изменением положения области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы.
На примерах исследований белково-липидных пленок на жидкой субфазе показаны новые возможности метода СРВ для изучения молекулярной организации, а также механизмов функционирования биологических мембран в физиологических условиях и при патологических воздействиях на клетку.
Предложен метод контроля эффективности и безопасности действия лекарственных препаратов, позволяющий получать дифференциальные данные о механизмах действия лекарственного соединения, в отличие от интегральной информации, получаемой на живом организме.
Получена сравнительная оценка действия лекарственных препаратов (ЭДТА, сукцимер и ксидифон), применяемых для лечения острых и хронических интоксикаций тяжелыми металлами.
Разработаны аналитические подходы для математической обработки и интерпретации результатов эксперимента по изучению структуры и композиционного состава органических и биоорганических тонкопленочных наноструктур на жидкости с помощью метода СРВ.
Положения, выносимые на защиту:
Метод нанодиагностики органических и биоорганических пленок на жидкой субфазе с применением рентгенофлуоресцентных измерений в области полного внешнего отражения. Главным преимуществом предложенного метода является возможность получать спектрально-селективную структурную информацию о динамичных двумерных системах, формирующихся в результате самопроизвольной организации молекул на межфазной границе жидкость/воздух.
Методика проведения рентгенофлуоресцентных измерений молекулярных пленок на поверхности жидкой субфазы для экспериментальных станций синхротронного излучения, на которых отклонение падающего рентгеновского пучка от горизонтали осуществляется с помощью кристалла-дефлектора.
Теоретические исследования общих закономерностей выхода флуоресценции от слаборассеивающих пленок в угловой области полного внешнего отражения. Метод, позволяющий однозначно определять местоположение атомов в мономолекулярном слое на жидкой субфазе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции в области полного внешнего отражения.
Исследования процессов формирования органических и биоорганических наносистем на жидкости. В том числе: изучение молекулярной упаковки в органических слоях на жидкости;
исследование процессов самоорганизации в белково-липидных пленках в условиях, когда белковые и липидные молекулы обладают высокой молекулярной подвижностью; исследования нарушений белково-липидных взаимодействий в биоорганических пленках под влиянием различных токсических агентов (тяжелые металлы и мочевина).
Комплексное исследование белково-липидных пленок на твердых подложках, позволившие разработать новый метод изучения молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов с использованием белково-липидных наноструктур в качестве изолированных моделей клеточных мембран. Полученные методом СРВ данные об эффективности комплексообразующих лекарственных препаратов, применяемых при острых и хронических интоксикациях тяжелыми металлами.
Обнаружено явление адсорбции ионов металлов на белковых молекулах, подвергнутых действию различных ксенобиотиков. Полученные результаты раскрывают один из возможных механизмов нарушения микроэлементного баланса в организме под действием экотоксикантов, а также при патологических изменениях в организме.
