Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Использование низкоинтенсивной фототерапии при лучевом лечении онкологических больных (обзор литературы)
1.1. Экспериментальное обоснование безопасности использования фототерапии при лечении постлучевых осложнений у онкологических больных 14
1.2. Использование фототерапии для профилактики и лечения лучевых реакций и повреждений у онкологических больных 19
1.2.1. Профилактика и лечение лучевых повреждений у больных раком предстательной железы с помощью низкоинтенсивной фототерапии 25
1.3. Изучение механизмов фототерапии 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы (клинические исследования)
2.1. Исследование влияния фототерапии на частоту и тяжесть поздних лучевых повреждений мочевого пузыря и прямой кишки у больных раком предстательной железы 37
2.1.1. Дистанционная лучевая терапия 37
2.1.2. Источник света и процедура фототерапии 39
2.2. Исследование влияния фототерапии на выживаемость больных раком предстательной железы после лучевого лечения 40
2.3. Статистическая обработка полученных результатов
ГЛАВА 3. Материалы и методы (экспериментальное обоснование использования фототерапии) 42
3.1. Микроциркуляция на системном и локальном уровне при действии фототерапии 42
3.1.1. Исследуемая группа здоровых добровольцев и метод определения микроциркуляции 43
3.1.2. Процедура фототерапии 44
3.2. Исследование в условиях in vitro пролиферации опухолевых и нормальных клеток при их культивировании в присутствии сыворотки онкологических больных после курса фототерапии 45
3.2.1. Исследуемая группа больных 46
3.2.2. Источник света и процедура фототерапии 48
3.2.3. Культивирование опухолевых и нормальных клеток человека 49
3.2.4. Оценка пролиферации опухолевых и нормальных клеток человека 51
3.3. Определение иммунологических показателей у онкологических больных после курса фототерапии 52
3.3.1. Группа больных и исследуемые параметры 52
3.3.2. Источник света и процедура фототерапии 54
ГЛАВА 4. Результаты и обсуждение (клинические исследования)
4.1. Влияние фототерапии на частоту и тяжесть поздних лучевых повреждений мочевого пузыря и прямой кишки у больных раком предстательной железы 55
4.2. Выживаемость больных раком предстательной железы после фототерапии 63
ГЛАВА 5. Результаты и обсуждение (экспериментальное обоснование использования фототерапии)
5.1. Микроциркуляция на системном и локальном уровне при действии фототерапии 68
5.2. Пролиферация опухолевых и нормальных клеток в условиях in vitro при их культивировании в присутствии сыворотки онкологических больных после фототерапии 71
5.3. Определение иммунологических показателей у онкологических больных после фототерапии 84
Выводы 102
Практические рекомендации 104
Список литературы 105
- Использование фототерапии для профилактики и лечения лучевых реакций и повреждений у онкологических больных
- Исследование влияния фототерапии на выживаемость больных раком предстательной железы после лучевого лечения
- Культивирование опухолевых и нормальных клеток человека
- Влияние фототерапии на частоту и тяжесть поздних лучевых повреждений мочевого пузыря и прямой кишки у больных раком предстательной железы
Введение к работе
Актуальность проблемы
Низкоинтенсивная фототерапия видимым (385-750 нм) и ближним инфракрасным (БИК, 750-1500 нм) светом широко используется в медицине с конца 60-х годов, когда было обнаружено биостимулирующее действие низкоинтенсивного лазерного излучения (Mester E. et al., 1966; Корытный Д.Л., 1969; Чекуров П.Р., 1970; Ракчеев А.П., 1971).
Видимое и БИК излучение не вызывает неопластической трансформации тканей (Tuner J., Hode L., 1999), однако отношение к его использованию для лечения и профилактики лучевых осложнений у онкологических больных остается настороженным. Это связано с публикациями о возможности повышения пролиферации опухолевых клеток после их прямого облучения in vitro видимым и БИК светом (Karu T., Pyatibrat L., 1987; Pinheiro A. et al., 2002; Renno A. et al., 2007; Frigo L. et al., 2009).
Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин: в мировой структуре онкологической заболеваемости это заболевание занимает шестое место (Трапезников Н.Н., Кушлинский Н.Е., 2001; Матвеев Б.П. и др., 2003; Имянитов Е.Н., 2008). Дистанционная лучевая терапия (ДЛТ) может использоваться практически на всех этапах развития РПЖ (Аль-Шукри С.Х., Ткачук В.Н., 2000; Mazhar D., Waxman J., 2002; Тюляндин С.А., Моисеенко В.М., 2004). У многих больных РПЖ проведение ДЛТ сопровождается лучевыми повреждениями, что связано с необходимостью подведения к опухоли высоких суммарных доз. Частота поздних лучевых повреждений у больных РПЖ достигает 8-12% (Голдобенко Г.В. и др., 1999).
Для уменьшения частоты и выраженности ранних постлучевых осложнений некоторыми авторами использовалось низкоинтенсивное видимое и БИК излучение (Зырянов Б.Н. и др., 1997; Жаринов Г.М. и др., 2004, 2005; Гостева С.Н. и др., 2005, 2006). Однако большая часть данных литературы посвящена эффективности фототерапии для предупреждения ранних лучевых реакций кожи и слизистых. Отсутствуют клинико-экспериментальные работы, которые бы оценивали безопасность и эффективность использования фототерапии для профилактики поздних лучевых повреждений. Также в литературе не имеется сведений о выживаемости онкологических больных при сочетанном применении лучевой терапии и фототерапии.
Таким образом, низкоинтенсивная фототерапия используется для профилактики ранних постлучевых осложнений, однако механизмы действия видимого и БИК излучений изучены не достаточно. Возникновение поздних лучевых осложнений связано с повреждением сосудистого эндотелия и нарушением микроциркуляции в зоне облучения (Rezvani M. et al., 1995; Lyubimova N., Hopewell J.W., 2004; Wang J. et al., 2007), поэтому детальное изучение состояния регионального кровотока при действии фототерапии представляется весьма актуальным.
Для обоснования безопасности фототерапии и исследования ее влияния на процессы регенерации важным представляется изучение действия видимого и БИК излучения на пролиферацию опухолевых клеток и нормальных клеток, участвующих в регенерации. В экспериментальной части данной работы изучали влияние сывороток больных раком молочной железы, получавших курс фототерапии, на пролиферацию опухолевых клеток, а также фибробластов и кератиноцитов. У этих больных также определяли некоторые показатели иммунной системы.
Цель исследования:
Повышение эффективности лучевого лечения больных раком предстательной железы путем применения низкоинтенсивной фототерапии и изучение механизмов действия ближнего инфракрасного и видимого излучения.
Задачи исследования:
1. Определить частоту и степень тяжести поздних лучевых повреждений мочевого пузыря и прямой кишки у больных раком предстательной железы, получавших и не получавших курс фототерапии.
2. Оценить длительную выживаемость больных раком предстательной железы, получавших и не получавших фототерапию в процессе лучевого лечения.
3. Изучить механизмы локального и системного влияния ближнего инфракрасного и видимого излучения на кровоток в коже здоровых людей.
4. В условиях in vitro оценить влияние светового воздействия на пролиферативную активность клеток, участвующих в процессах регенерации.
5. Исследовать in vitro влияние фототерапии на пролиферацию культур опухолевых клеток различного тканевого происхождения.
6. Изучить влияние курса фототерапии на состояние иммунной системы у больных раком молочной железы в послеоперационном периоде.
7. Обосновать использование фототерапии при лучевом лечении больных раком предстательной железы.
Научная новизна:
1. Впервые показана эффективность низкоинтенсивной фототерапии для профилактики поздних лучевых повреждений мочевого пузыря и прямой кишки у больных РПЖ.
2. Отмечено достоверное повышение выживаемости после лучевого лечения больных местно-распространенным РПЖ при использовании сопровождающего курса фототерапии.
3. Исследованы механизмы лечебного действия низкоинтенсивной фототерапии: усиление микроциркуляции на локальном и системном уровне за счет активации синтеза оксида азота; иммуномодулирующее действие видимого и БИК света.
4. В эксперименте in vitro показано, что пролиферация клеток, участвующих в процессах регенерации (фибробластов и кератиноцитов), увеличивалась при их культивировании в среде с сывороткой онкологических больных, подвергнутых фототерапии. Пролиферация опухолевых клеток (Hs578T, HBL-100, BT-474, A431) в этих условиях снижалась.
Практическая значимость работы:
1. Обоснован способ профилактики поздних лучевых повреждений мочевого пузыря и прямой кишки у больных раком предстательной железы с помощью фототерапии ближним инфракрасным излучением.
2. Показано, что фототерапия улучшает 5-летнюю выживаемость больных с местно-распространенным раком предстательной железы после лучевого лечения.
3. Экспериментальные исследования показали ключевую роль усиления микроциркуляции на системном уровне за счет активации синтеза оксида азота, и иммуномодулирующее действие фототерапии в развитии клинических эффектов видимого и ближнего инфракрасного излучений.
Положения, выносимые на защиту:
1. Низкоинтенсивная фототерапия снижает частоту и степень тяжести поздних лучевых повреждений мочевого пузыря и прямой кишки у больных РПЖ.
2. Фототерапия не влияет на выживаемость больных локализованным и генерализованным РПЖ и повышает выживаемость больных местно-распространенным РПЖ.
3. Световое воздействие усиливает микроциркуляцию на локальном и системном уровне за счет активации синтеза оксида азота. Фототерапия обладает иммуномодулирующим действием.
4. Сыворотка крови онкологических больных, подвергнутых фототерапии, усиливает в условиях in vitro пролиферацию клеток, участвующих в регенерации (фибробластов и кератиноцитов) и снижает пролиферацию опухолевых клеток (Hs578T, HBL-100, BT-474, А431).
Внедрение:
Результаты диссертационного исследования используются на отделении новых технологий лучевой терапии ФГУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Минздравсоцразвития России».
Диссертационная работа была поддержана грантом Президента Российской Федерации (№МК-2141.2007.4), грантом администрации г. Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов вузов и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга 2009 и 2010 года (№4/04.05/033, №4/04-06/023), а также грантами Российского фонда фундаментальных исследований (№08-04-09353-моб_з, №09-04-09638-моб_з).
Апробация работы:
Материалы работы обсуждались на 18 Конгрессах и Конференциях, в том числе: Конференции, посвященной 120-летию кафедры физиотерапии МАПО (Санкт-Петербург, 2007); VII Конгрессе Всемирной ассоциации по лазерной медицине WALT (Сан Сити, Южная Африка, 2008), 13-15-м Международных Конгрессах Европейской медицинской лазерной ассоциации EMLA (Хельсинки, Финляндия, 2008, 2010; Прага, Чехия, 2009); 22-25-м Конгрессах Международной Академии по лазерной медицине (Флоренция, Италия, 2007-2010); XXXII и XXXIII научно-практической Конференции с международным участием «Применение лазеров в медицине и биологии» (Харьков, Украина, 2008; Гурзуф, Украина, 2009); Конференции с международным участием «Применение лазеров и светодиодов в медицине и биологии» (Санкт-Петербург, 2009); XVIII Конгрессе международного общества по лазерной хирургии и медицине (Токио, Япония, 2009); Конференции победителей конкурса грантов для студентов, аспирантов вузов и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2009); Конференции европейской лазерной ассоциации ELA (Таррагона, Испания, 2010); VI Конференции «Фундаментальная онкология – Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2010); IV Всероссийском национальном конгрессе лучевых диагностов и терапевтов «Радиология-2010» (Москва, 2010), VI Съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Душанбе, Таджикистан, 2010).
Диссертационная работа апробирована на совместном научном семинаре лаборатории радиационной цитологии и лаборатории цитологии опухолевого роста Института Цитологии РАН 21 июня 2010 года, а также на заседании Проблемной комиссии по клинической радиологии и медицинской радиационной физике РНЦРХТ 13 июля 2010 года.
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 5 статей в реферируемых журналах, из них две – в ведущих зарубежных изданиях; 25 докладов в сборниках научных конференций, из которых 15 – в зарубежных.
Объем и структура диссертации:
Использование фототерапии для профилактики и лечения лучевых реакций и повреждений у онкологических больных
Основным направлением применения фототерапии в онкологии является профилактика и лечение осложнений, развивающихся после проведения химио- и радиотерапии. Основанием к применению методов фототерапии для лечения постлучевых повреждений является способность света индуцировать в организме комплекс положительных функциональных сдвигов: улучшение и нормализацию показателей иммунитета, снижение интенсивности воспаления и уровня интоксикации, усиление регенераторных процессов, улучшение реологических свойств крови и микроциркуляции, нормализацию показателей гемостаза, уменьшение болевого симптома (Виноградов А.Б., Чемурзиева Н.В., 1993; Ryden et al., 1996; Johansen et al., 1998; Москвин С.В., Буйлин В.А., 2000).
В настоящее время главной проблемой остается боязнь стимуляции опухолевого роста при использовании излучений видимого и БИК диапазона, что препятствует широкому внедрению низкоинтенсивной фототерапии в схемы лечения онкологических больных. Еще одним сдерживающим фактором является недостаточная изученность механизмов лазерного воздействия. Известно только, что фототерапия обладает местным и системным эффектом. Локальное воздействие обладает анальгезирующим, сосудорасширяющим и противовоспалительным, иммунокоррегирующим, регенирирующим действием. Системное действие (лазерное облучение крови, воздействие на зоны костномозгового кроветворения и т.п.) также приводит к ряду положительных результатов, однако конкретные механизмы такого действия еще не известны.
Работы, посвященные профилактике и лечению вызванных лучевой терапией повреждений слизистой ротовой полости (мукозитов) касаются в основном злокачественных новобразований головы и шеи, так как при такой локализации опухолей происходит непосредственное радиационное повреждение слизистых, попадающих в зону облучения. К непрямым факторам, способствующим появлению мукозитов, относятся: угнетение кроветворения, иммуносупрессия, уменьшение содержания IgA, наличие бактериальной, вирусной и грибковой инфекции. Имеет значение наличие протезов, заболеваний полости рта и неполноценное питание (Bensadoun R.J. et al., 2001). Возникновение мукозитов сопровождается болевым симптомом, который может потребовать применения наркотических анальгетиков и парентерального питания, а также повышением риска вторичных инфекций. Во многих случаях это приводит к смене схем лучевой терапии, что в целом может повлечь за собой прогрессирование опухолевого процесса и снижение выживаемости пациентов.
Согласно данным R.J. Bensadoun (2001), развитие мукозита начинается с появления неглубокой язвы, что связано с уменьшением эпителиального базального слоя клеток вплоть до полного исчезновения слизистой. Процесс ее регенерации сопровождается скоплением клеток воспаления, интерстициальной экссудацией, образованием фибрина и клеточного детрита, и формированием похожей на струп псевдомембраны. По мере увеличения язвы, она сливается с соседними язвами, образуя большую по размерам псевдомембрану. Регенерация базального слоя клеток эпителия приводит к реэпителизации и исчезновению язвы. В рандомизированном мультицентровом исследовании R.J. Bensadoun (1999) отражен опыт использования излучения He-Ne лазера (632.8 нм) в качестве монометода после применения лучевой терапии. Наряду с уменьшением выраженности мукозита значительно снижался и болевой синдром. Эти данные были подтверждены в исследованиях индийских авторов (Arun Maiya G. et al., 2006; Arora H. et al., 2008). Фототерапия и фотопрофилактика мукозитов проводились в основном у взрослых пациентов, хотя описано их успешное использование в педиатрии у детей с онкологическими заболеваниями (Дурнов Л.А. и др., 2000; Иванов А.В. и др., 1995): отмечалось стихание болевого синдрома, уменьшение отека, исчезновение признаков инфекционного процесса, улучшение самочувствия. По данным Б.Н. Зырянова и др. (1998), при облучении лазером на парах меди (510.6 нм, 578.2 нм) раны и участков кожи, находившихся в зоне действия радиации при проведении лучевой терапии, снижалась выраженность местных лучевых реакций. Благодаря этому сокращался перерыв при проведении лучевой терапии, повышалась толерантность к действию ионизирующего излучения. Кроме того, было обнаружено, что при комбинации лучевой терапии с низкоинтенсивным лазерным излучением, в отличие от проведения только радиотерапии, отмечались признаки выраженного репаративного процесса, в частности, увеличивалось количество новообразованных сосудов. Следует отметить, что одной из причин возникновения послеоперационных осложнений является проведение лучевой терапии перед операцией. Исследования влияния внутривенного лазерного облучения крови (ВЛОК) показали изменение морфологических показателей в мазках-отпечатках и биопсиях из края раны, анализ которых выявил в группе с лазеротерапией уменьшение числа нейтрофилов, отсутствие отека и инфильтрации (Зырянов Б.Н. и др., 1998). По данным И.А. Михалкина (1991), при проведении ВЛОК с помощью He-Ne лазера в группе ЛОР-онкологических больных, получавших лучевую терапию в сочетании с гипертермией, происходило снижение частоты лучевых реакций, развивались позитивные изменения показателей иммунитета и параметров крови (повышение количества лейкоцитов, общей доли лимфоцитов, прежде всего Т-лимфоцитов, увеличение содержания эритроцитов, снижение СОЭ).
Исследование влияния фототерапии на выживаемость больных раком предстательной железы после лучевого лечения
Низкоинтенсивная фототерапия используется для лечения и профилактики ранних лучевых повреждений у онкологических больных. Однако остаются не известными механизмы такого действия излучения видимого и БИК диапазона. В данном разделе экспериментальной части работы было сделано предположение о том, что оксид азота (NO) является ключевым фактором в системном ранозаживляющем действии фототерапии (за счет усиления микроциркуляции на системном и локальном уровне), и, следовательно, влиянием этого вещества может объясняться снижение частоты и тяжести лучевых повреждений у больных РПЖ.
Исследуемая группа здоровых добровольцев и метод определения микроцикруляции В исследовании приняли участие 23 практически здоровых добровольца, средний возраст которых - 54±5 лет. У каждого участника проводили измерение микроциркуляции в коже тыльной поверхности обеих рук. Проводили облучение светом правой руки и измеряли изменения объемной скорости кровотока (ОСК) в течение 90 мин в области облучения (локальный эффект) и в необлученной левой руке (системный эффект). Все добровольцы были разделены на три группы. В 1-й группе (n=7) облучали только центральную часть тыльной стороны правой руки. Во 2-й группе (n=6) за 1 мин до облучения центральной области правой руки с помощью ионофореза вводили ингибитор NO-синтазы. Эффект действия ингибитора оценивали как в области облучения (в правой руке), так и в необлученной левой руке. В 3-й группе (n=10) ингибитор NO-синтазы вводили в необлученную левую руку с целью оценки роли оксида азота (NO) в активации системной микроциркуляции при облучении правой руки. Исследование микроциркуляции проводили с помощью высокочастотной ультразвуковой (УЗ) допплерографии — прибор «Мини-Макс-Допплер-K» (Санкт-Петербург, Россия), генерирующий колебания с частотой 25 МГц и позволяющий измерять объемную скорость кровотока (Qas) в исследуемой области на глубине до 5 мм в мл/с/см3 (Гирина А.М., Петрищев Н.Н., 2006). В отличие от прозвучивания магистральных сосудов, когда регистрируются параметры кровотока в единичной артерии или вене, в случае прозвучивания микроциркуляторного участка ткани, фиксируются его интегральные гемодинамические показатели. Проводили внутрикожное введение 0.1% водного раствора N-монометил- L-аргинина (L-NMMA, Sigma, St. Louis, MO), который является ингибитором конститутивной и индуцибельной NO-синтазы, в течение одной мин в центральную область тыльной стороны руки, а также через одну мин после облучения. Предварительные эксперименты показали, что действие ингибитора распространяется только на зону действия электродов (т.е. область площадью 24 см2), тогда как в интактной коже объемная скорость кровотока не подавлялась при введении ингибитора. В качестве источника света использовали фототерапевтический аппарат «Q-light» (Biotechnology & Photomedicine AG, Rorschacherberg, Швейцария), излучение которого характеризуется 95% степенью поляризации и одинаковой плотностью мощности (40 мВт/см2). Терапевтическая доза 12 Дж/см2 достигается за 5 мин облучения (рис. 3). Низкоинтенсивная фототерапия используется для лечения и профилактики постлучевых осложнений у больных РПЖ и раком шейки матки (Гостева С.Н. и др., 2005; Жаринов Г.М. и др., 2000). При этом возникает вопрос о влиянии курса фототерапии на пролиферацию опухолевых клеток у онкологических больных, которые подвергаются лучевой терапии.
Для проведения экспериментальной части данной работы была выбрана группа больных раком молочной железы (РМЖ), что диктовалось доступностью сразу нескольких клеточных линий РМЖ человека в банке клеточных культур института Цитологии РАН. Целью данного исследования явилось определение влияния сывороток больных РМЖ, которым проводили курс фототерапии, на пролиферацию опухолевых клеток рака молочной железы трех линий (BT-474, HBL-100, Hs578T), клеток эпидермойдной карциномы (A431) и нормальных клеток (фибробластов, ФБ и кератиноцитов, КЦ) в условиях in vitro. Таким образом, определяли опосредованное влияние фототерапии через сыворотку крови на пролиферативную активность исследуемых клеточных культур.
Среди неопухолевых (нормальных) клеток были выбраны первичные культуры ФБ и КЦ, которые играют ключевую роль в процессах регенерации и ранозаживления. Изучение их пролиферативного ответа при культивировании с сыворотками онкологических больных позволит сделать вывод о возможности фототерапии оказывать системное ранозаживляющее действие. Вместе с тем, влияние сыворотки крови онкологических больных после курса фототерапии на пролиферацию опухолевых клеток способствует обоснованию безопасности использования этого физиотерапевтического метода для лечения и профилактики лучевых повреждений.
Культивирование опухолевых и нормальных клеток человека
Семидневный курс ежедневного облучения пояснично-крестцовой области больных РМЖ видимым и БИК светом производили с использованием швейцарского фототерапевтического аппарата Bioptron-2 (рис. 4). Параметры излучения: 40 мВт/см2, 480—3400 нм, доза 12 Дж/cм2, время облучения 10 мин. Облучали участок пояснично-крестцовой области диаметром 15 см, курс фототерпаии –7 сут. Фототерапевтический курс начинали на следующий день после мастэктомии.
Использовали три линии клеток РМЖ человека (BT-474, HBL-100, Hs578T) и клетки эпидермоидной карциномы А431. Все клетки получены из коллекции Банка клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Две линии клеток РМЖ (BT-474 и HBL-100) культивировали в питательной среде RPMI 1640 (Биолот, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, Биолот, Россия), 80 мкг/мл гентамицина (Sigma, США) и, для клеток BT-474 10 мкг/мл бычьего инсулина (Sigma, США). Для экспериментов клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 12.5103 клеток на лунку и культивировали в атмосфере с 5% СO2 при 37оС. Через два часа после прикрепления клеток к пластику проводили смену питательной среды, добавляя 2.5% сыворотки больных РМЖ (вместо 10% ЭТС).
Опухолевые клетки двух других линий (Hs578T и А431) культивировали в питательной среде DMEM (Биолот, Россия), содержащей 10% ЭТС и 80 мкг/мл гентамицина и дополнительно 10 мкг/мл бычьего инсулина для клеток Hs578T. Культивирование клеток проводили в 96-луночных планшетах с плотностью 1104 клеток на лунку в атмосфере 5% СO2 при 37оС. Смена питательной среды с добавлением сыворотки больных РМЖ проводили таким же образом, как и в предыдущем случае.
В работе использованы нормальные (нетрансформированные) клеточные линии, участвующие в процессах регенерации постлучевых осложнений – фибробласты (ФБ) и кератиноциты (КЦ). Постнатальные ФБ крайней плоти человека (human foreskin) были полученные из коллекции Банка клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки культивировали в питательной среде Iscoves MDM (StemCell Technologies, США) с добавлением 10% ЭТС. Для экспериментов клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1104 клеток на лунку и культивировали в атмосфере 5% СO2 при 37оС. Через два часа после прикрепления клеток к пластику питательную среду меняли, добавляя сыворотку больных РМЖ (2.5%).
Выделение и культивирование КЦ проводили из фрагментов кожи лица практически здоровых женщин, полученных при косметических операциях. Изолированные из базального слоя эпидермиса клетки суспендировали в смеси питательных сред DMEM и F12 (3:1) с добавлением 10% ЭТС, высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 4104 клеток на лунку и культивировали в атмосфере 5% СO2 при 37С. Через двое сут проводили смену питательной среды с добавлением эпидермального фактора роста (ЭФР, 10 мг/мл), инсулина, гидрокортизона, холерного токсина, трансферрина, аденина, лиотиронина, однако вместо 10% ЭТС вносили 2.5% сыворотки крови необлученных или облученных низкоинтенсивным видимым и ближним инфракрасным светом больных РМЖ, которую получали за одни сут до мастэктомии, а также через одни и 7 сут после операции.
Продолжительность культивирования клеток каждой линии составляла для клеток РМЖ (BT-474, Hs578T и HBL-100) 72 часа, для ФБ, КЦ и A431 – 60 часов. Для оценки исходного уровня пролиферации клеток всех изучаемых линий в присутствии 2.5% сывороток больных их параллельно культивировали на стандартной питательной среде, т.е. в присутствии 10% ЭТС. Клетки каждой линии культивировали с сыворотками крови 8 больных, получавших стандартный курс послеоперационной реабилитации, и с сыворотками крови 11 больных, которым назначали фототерапевтический курс видимым и ближним инфракрасным светом. Тестирование сывороток больных проводили на трех сроках (до операции, через 1 и 7 сут после операции) в трех параллелях. Опыт повторяли три раза.
Число клеток определяли косвенно по изменению оптической плотности окрашенных ядер в 96-луночных планшетах, используя краситель кристалл виолет. Авторами этого метода (Mosman T., 1983; Kueng W. et al., 1989) было установлено, что между оптической плотностью экстрагированного из ядер клеток кристалл виолета и числом клеток существует линейная зависимость. Перед фиксированием клеток в 70%-ном этиловом спирте (5 мин) проводили двукратную отмывку клеток в лунках раствором PBS (фосфатный буфер). После фиксации клеток вносили краситель кристалл виолет (0.1% на 10 мин), затем отмывали лунки с клетками дистиллированной водой. Далее краситель экстрагировали 10%-ной уксусной кислотой в течение 20 мин на шейкере при скорости вращения 150 об/мин. Измерение оптической плотности экстрагированного красителя при 570 нм проводили на планшетном спектрофотометре STATFAX 2100 (Awareness Technology, США).
Влияние фототерапии на частоту и тяжесть поздних лучевых повреждений мочевого пузыря и прямой кишки у больных раком предстательной железы
Обсуждая возможные механизмы таких изменений пролиферации клеток, необходимо обратиться к данным, полученным нами в предыдущих исследованиях. Согласно одному из них, уже через 30 мин после облучения видимым и БИК светом добровольцев или образцов их крови in vitro в плазме снижается содержание провоспалительных цитокинов (TNF-, IL-6, IL-12) и возрастает уровень ростовых факторов PDGF и TGF-1 (Жеваго Н.А. и др., 2005). Причем у добровольцев с невысоким исходным уровнем PDGF его содержание в плазме крови увеличивается на 20%, а через 24 ч – на 24%; в эти же сроки при исходно низком содержании возрастает и уровень TGF- 1 соответственно на 43% и 38%. Эти изменения коррелировали по времени с повышением пролиферативной активности ФБ.
Хотя PDGF и эпидермальный фактор роста (ЭФР), концентрация которых в крови после светового воздействия повышается прежде всего в связи с выходом из тромбоцитов (Kiaru J. et al., 1991), стимулируют пролиферативные процессы, однако в отношении опухолевых клеток эти цитокины могут оказывать противоположный эффект и индуцировать апоптоз (Armstrong D.K. et al., 1994). В частности, ЭФР запускает процесс гибели клеток РМЖ, которые экспрессируют повышенное количество рецептора к этому цитокину. Вероятно, именно этим можно объяснить обнаруженное в данном исследовании снижение пролиферации клеток A431, так как на поверхности этих клеток также располагается огромное количество рецепторов к ЭФР. Особенностью влияния видимого и ближнего инфракрасного света на цитокиновую сеть является почти 6-кратное увеличение содержания в плазме интерферона гамма (IFN-) и в среднем 5-кратное возрастание уровня противовоспалительного цитокина IL-10 (Жеваго Н.А. и др., 2005). Повышение содержания IFN- при воздействии видимого лазерного света отмечается также в другом исследовании (Леонова Г.Н. и др., 1994). Поскольку ФБ человека имеют рецепторы и к IFN- , и к IL-10 (Anderson P., Nagler C., 1984; Ritchlin C., Haas-Smith S.A., 2001), следует обсудить возможные последствия их влияния на функциональное состояние клеток соединительной ткани. Антипролиферативные свойства IFN- хорошо известны, и в процессах ранозаживления этому цитокину отводится роль ингибитора пролиферации и миграции ФБ (Eisenbeiss W. et al., 1998). Однако имеются данные о том, что IFN- подавляет пролиферацию только быстро размножающихся ФБ, а покоящиеся клетки он стимулирует (Elias J.A. et al., 1987). У культивируемых ФБ конъюнктивы человека IFN- подавляет продукцию экстрацеллюлярного матрикса и миграцию клеток, но не влияет на их пролиферацию (Yamanaka O. et al., 2003). С другой стороны, этот цитокин стимулирует в дозозависимой манере пролиферацию ФБ зубной пульпы человека (Melin M. et al., 1989). В литературе также приводятся данные о влиянии IL-10 на пролиферацию ФБ и заживление ран. По данным некоторых авторов (Dosanjh A. et al., 2001), кондиционированная среда, полученная от эпителиальных клеток бронхов здорового человека, содержит большое количество IL-10 и стимулирует рост легочных ФБ. Таким же свойством обладает обычная питательная среда, к которой добавлен IL-10 в концентрациях 100, 200 и 500 пг/мл. С другой стороны, в дермальных ранах эмбрионов мышей, благодаря высокому содержанию IL-10, снижается содержание провоспалительных цитокинов и степень самого воспалительного процесса, что сдерживает гиперпродукцию клеток соединительной ткани (Liechty K.W. et al., 2000). На этом основании авторы полагают, что IL-10 необходим для безрубцовой регенерации ран. Механизм повышения пролиферативной активности КЦ у больных РМЖ может быть связан с действием света не только на кровь, но и на компоненты поверхностных отделов кожи. Значительный вклад, по-видимому, вносят сами КЦ. Эти клетки продуцируют конститутивно или под действием индукторов различные цитокины (IL 1, 1, 6, 7, 8, 10, 12, 18, 20, TNF-, IFN , , ), некоторые из которых стимулируют пролиферацию КЦ (IL-4, IL-6), индуцируют их хемотаксис (IL-1, IL-8, TNF-, IFN-) и дифферецировку (IFN-) (Grne A., 2002). КЦ секретируют также ростовые факторы, необходимые для процессов регенерации кожи. Среди них лиганды для рецепторов EGF – EGF, TGF, гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор (HB-EGF) и амфирегулин. Они синтезируются КЦ в мембранно-связанной форме и могут десорбироватся с поверхности под действием различных факторов (Massague J., Pandiella A., 1993). Можно предположить, что при воздействии на кожу оптического излучения эти ростовые факторы десорбируюся с поверхности КЦ и, поступая в плазму крови, способствуют возрастанию пролиферации этих клеток. Не исключено также, что в условиях in vivo свет потенцирует дермально-эпидермальные взаимодействия, и ростовой фактор КЦ секретируется ФБ. Показано, например, что при раздражении и повреждении кожи эпидермальные клетки секретируют IL-1, что стимулирует секрецию фибробластами фактора роста кератиноцитов (Maas-Szabowski N. et al., 2000).
Повышение митогенной активности плазмы для ФБ при фотомодификации крови может быть также связано с воздействием света на тромбоциты и выходом их них веществ белковой природы (Самойлова К.А. и др., 2003; Богачева О.Н. и др., 2004). Показано, что при активации кровяных пластинок в процессе свертывания крови ЭФР освобождается в виде нескольких фракций разной молекулярной массы (Kiaru J. et al., 1991; Hwang D.L. et al., 1992).
