Клинико-лабораторная оценка исследования активности каталазы и перекисного окисления липидов у больных эритематозной рожей [Электронный ресурс] Абдель Джалиль Абдель Муним Хафез Мохаммед

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Абдель Джалиль Абдель Муним Хафез Мохаммед. Клинико-лабораторная оценка исследования активности каталазы и перекисного окисления липидов у больных эритематозной рожей [Электронный ресурс] : Диссертация ... кандидата медицинских наук : 14.00.46

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Современные данные о распространенности, патогенезе и лечении больных рожей 7

1.1. Перекисное окисление липидов у больных с рожей 21

1.2. Генерация свободных радикалов 23

1.3. Механизм окисления липидов 28

1.4. Биологическое значение АФК 30

1.5. Антиоксидантная защита 34

Глава 2. Клиническая характеристика больных. Методы исследования 43

2.1. Клиническая характеристика больных 43

2.2. Материалы и методы исследования 47

2.3. Методы статистической обработки 50

Глава 3. Исследование активности перекисного окисления липидов у больных рожей 66

Глава 4. Клинико-лабораторное исследование основных биохимических показателей у больных рожей в динамике 106

Заключение 116

Выводы 124

Практические рекомендации 125

Литература 126

Генерация свободных радикалов
Клиническая характеристика больных
Исследование активности перекисного окисления липидов у больных рожей
Клинико-лабораторное исследование основных биохимических показателей у больных рожей в динамике

Введение к работе

Актуальность проблемы. Актуальность исследования такого заболевания как рожа, имеет большое практическое значение для различных специальностей, так как ее диагностикой и лечением занимаются врачи дерматовенерологи, инфекционисты, хирурги и микробиологи. В последнее десятилетие отмечается более частое возникновение рожи, а ее склонность к частым рецидивам и осложнениям диктует необходимость'глубокого изучения вопросов этиологии, патогенеза и профилактики этого заболевания.

Отмечено значительное увеличение числа первичных обращений в амбулаторно-поликлиническую службу по поводу различных гнойных заболеваний кожи, среди которых от 10% до 16% занимают больные рожей. (Поташов Л.В., с соавт.,1997; Дедов А.В., 1998; Черкасов В.Л., Еровиченков А.А., 1999; Ширшов О.Н, 1999;. Цомая В.М. ,1999; Толстой О.А., 2000; Степанкина Е.С., 2005; Davis L., 2001;Bonnetblanc J.M., Bedane С. , 2003).

Кроме того, клиницисты стали более часто наблюдать возникновение осложненных буллезно-геморрагических форм рожи, рецидивирование, длительный период нетрудоспособности и стабильно высокую летальность (Фролов В.М., Рычнев В.Е., 1986, 1987; Черкасов В. Л., 1986, 1998,1999; Амбалов Ю.М. с соавт., 1991; Кузнецов Р.В. с соавт., 1986, Минаева Н.К., Бегишев О.Б., 1993; Фазылов В.Х, 1995, Спесивцев ТО.А., Коваленко А.Н., 1996; Дедов А.В., 1998; Черкасов В.Л., Еровиченков АА. 1999; Степанкина Е.С., 2005; Elliott D.C., et al.,1996; Fischer M. et al.,2004).

Благодаря переоценке значения лимфатической системы в патогенезе рожи и широкому использованию методов эндолимфатической терапии удалось улучшить результаты в лечении не осложненных форм заболевания (Ермолов А.С. с соавт., 1988; Бала МА. с соавт., 1990; Лебедева Т.П., 1991, Левина Л.Д. с соавт., 1996, Бубнова Н.А., с соавт., 1995; BrimnerU., Knusell.,3 978).

В то лее время, до сих пор не изучена клинико-лаб оратор пая диагностика активности каталазы и перекисного окисления липидов начальных форм рожи и некоторых заболеваний кожи (Храмцов М.М. с соавт., 1998).

Исходя из вышеизложенного, дальнейшее усовершенствование оказания специализированной помощи больным рожей определяет актуальность исследования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является улучшение диагностики и оказания специализированной помощи больным с эритематозной и эритематозно-буллезной формами рожи на основе изучения патологии клеточных мембран и внедрения патогенетической терапии.

Исходя из этого, в процессе работы были поставлены следующие задачи:

Разработать кинетический метод определения активности каталазы плазмы крови у больных эритематозной и эритематозно-буллезной формами рожи.
Определить скорость и константу Михаэлиса каталазиой реакции плазмы крови у больных эритематозной и эритематозно-буллезной формами рожи.
Изучить интенсивность системы перекисного окисления липидов у больных с начальными формами рожи по содержанию диеновых конъюгатов и малонового диальдсгида.
Оценить состояние антиоксидантной системы по активности каталазы и концентрациям малонового альдегида и диеновых конъюгатов в крови у больных с осложнениями эритематозной и эритематозно-буллезной форм рожи.
Оценить эффективность лечения больных эритематозной и эритематозно-буллезной формами рожи с включением антиоксидантных препаратов.

Научная новизна.

Разработан кинетический метод определения каталазы плазмы крови у больных эритематозной и эритематозно-буллезной формами рожи. Изучена не только активность фермента, но и скорость протекающей каталазиой реакции. Впервые исследованы скорости каталазных реакций плазмы крови при различных формах рожи по предложенному методу.

Разработан лабораторно-диагностический алгоритм, который позволит оценивать состояние больных и контролировать эффективность, проводимых лечебных мероприятий.

Практическая ценность.

Разработан алгоритм клинико-лабораторной диагностической оценки и прогноза течения рожи.

Результаты исследования позволяют получить более обоснованный

прогноз течения заболевания и обосновать пути совершенствования лечебной тактики. На достаточном количестве клинических наблюдений показана особенность течения рожи у пациентов с различными осложнениями. Использование антиоксидантов б лечении рожи сопровождается выраженным положительным клиническим эффектом.

Апробация работы. Основные положения диссертации рассмотрены и обсуждены на научно-практической конференции хирургов Пензенской области (г. Пенза, 2002), на итоговых научных конференциях молодых ученых Саратовского медицинского университета, на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2003 г.).

Материалы диссертации обсуждены и одобрены на заседаниях кафедры биохимии Саратовского государственного медицинского университета.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в клинике ММУ "Городская клиническая больница №2", на кафедре биохимии ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет».

Основные положения, которые выносятся на зашиту:

Предложена новая методика определения каталазы и изучено состояние антиоксидантной системы при роже.
Получены новые данные о процессах перекисного окисления липидов у больных эритематозной рожей.
Обнаружено изменение активности каталазы, а также концентраций малонового диальдегида и диеновых конъюгатов у больных эритематозной и эритематозно-буллезной формами рожи и осложнениях рожи.
Полученные результаты позволяют более точно оценивать состояние больных рожей и предложить новые программы лечения с использованием антиоксидантных препаратов.

Публикации. По теме диссертации в печати опубликовано 7 научных работ, в которых отражены основные положения диссертации.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и практических рекомендаций, иллюстрирована 13 таблицами и 29 рисунками. Список использованной литературы содержит 180 отечественных и 107 иностранных источников.

Генерация свободных радикалов

Кроме полного четырёхэлектропного восстановления молекулы Ог до воды в дыхательной цепи митохондрий в аэробных клетках всегда происходит и неполное - одно-трёхэлектронное восстановление с последовательным образованием различных АФК (Владимиров Ю.А. с соавт.,1991). В организме реакции свободнорадикального окисления инициируются главным образом под действием: - синглетных форм кислорода (02;) - супероксидных радикалов (О;""), - перекиси водорода (Н202), - гидроксилытых (свободных) радикалов (ОН, 1-І 02"), - пероксииитрита (ONOO) (Осипов А.Н. с соавт.,1990).

Основные механизмы появления АФК в организме связаны обычно с нарушениями функционирования электронно-транспортных цепей митохондрий или микросом, а также при изменении свойств дегидрогеназ. Особняком стоит нормальный процесс формирования АФК фагоцитами в ходе стимуляции неспецифической защиты организма.

В присутствии металлов переменной валентности эти продукты запускают цепные реакции окислительной деградации биомолекул. Главным защитным механизмом такого процесса является бета- каротин, переводящий синглетный кислород в триплетный, однако, обычная вода и токоферол также способны вызывать такой процесс инактивации синглетного кислорода (Шинкаренко Н.В., Алексовский В.Б., 1982; Хулинский В.И., 1999; Мс Murray W.,MagelW. ,1972).

Предполагается участие синглетного кислорода в процессах формирования некоторых генетических заболеваний (порфирий) и при ультрафиолетовом облучении кожи (эритема) в случае приёма фотосенсибилизаторов(8сагра М. et al., 1984).

Во всех аэробных клетках в процессе присоединения одного электрона к молекуле кислорода образуются супероксидный анион-радикал и его протонированная форма- гидроперекисный радикал, еще" более эффективный в отношении стимуляции ПОЛ, чем собственно супероксидный анион-радикал (Marklund S.L. ,1990; Halliwell В., Gutteridge J.M.C., 1995). Оба они порождают ряд других активных форм кислорода. Образование этих АФК наиболее существенно вблизи цепей переноса электронов - дыхательной цепи, микросом и в растительных клетках - хлоропластов (Каган В.Е. с соавт.,1984,1986,1987; Егоров С.Н. с соавт., 1992; Dix Т.A., Aikens 1,1993). Эти АФК играют также важную роль в не специфических иммунных механизмах организма: они выделяются в ходе активации при инфекционных, и иных воспалительных процессах фагоцитирующих клеток (нейтрофилы, макрофаги, моноциты, эозинофилы) (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983).

Супероксидный радикал может прямо инактивировать адреналин, аскорбиновую кислоту, а более активный гидроперекисный радикал реагирует с линолевой, линоленовой, арахидоновой кислотами, окисляя их до гидроперекисей (Clemens M.R. Waller Н. ,1987; Cross A.R., Jones O.T.G.,1991).

Образованию гидроперекисного радикала способствует закисление среды, он также свободно проникает через биомембраны, так как не несёт заряда. Главным механизмом защиты организма от данных форм АФК является фермент супероксиддисмутаза, активность её обычно достаточна, чтобы инактивировать их в месте: образования, не допуская диффузии в среде макромолекул ткани.

Для определения концентрации супероксидных анион-радикалов используют методы элсктропарамагнитного резонанса (ЭПР-резонанс) и реакции окисления интенсивно поглощающих соединений; цитохрома С, нитросинего тетразолия, адреналина и др. (Cohen M.S. et al, 1988; Beyer R.E. 1992). Для доказательства специфичности этих реакций используют их подавление супероксиддиемутазой (Гусев В.А., Паиченко Л.Ф., 1982; Кошкин В.В.,1983; Дубинина Е.Е.,1995; Дубинина Е.Е. с соавт.,1995; Кольтовер В.К.,1996.

Дисмутация супероксидных анион-радикалов под действием СОД в биологических тканях ведёт к образованию перекиси водорода, способной легко проникать через мембрану клеток. Реакционноспособность и, соответственно, прямая токсичность перекиси водорода весьма невысока, что связано в первую очередь с отсутствием в молекуле Н 2О2 не спаренных электронов. Сама по себе Н 2О2 обладает весьма слабой способностью инициировать ПОЛ (HalliweJI В., Gutteridge J.M.C., 1990,1995).

Клиническая характеристика больных

Среди пациентов основной исследуемой группы было 52 (44,1%) женщины и 66 (55,9%) мужчин в возрасте от 15 до 83 лет. Средний возраст пациентов составил 63,7 лет. У 98 пациентов (83,1%), отмечена первичная форма заболевания. Рецидивирующая рожа зарегистрирована у 9 (7,6%) больных, повторная у 11(9,3%) пациентов.

Как видно из полученных данных, в подавляющем большинстве случаев (63,6%) патологический процесс локализовался на нижних конечностях.

Клиническое обследование при поступлении больных проводили по общепринятой схеме, предусматривающей выяснение жалоб на момент поступления, сбор анамнеза заболевания, общий осмотр пациента с определением распространенности и глубины местных воспалительных изменений, проведение лабораторных и специальных методов исследования.

Объективизация тяжести общего состояния больного проводилась на основании анализа результатов объективного осмотра, оцешш биохимических и интегральных показателей функционирования системы гомеостаза.

Важное значение при оценке тяжести состояния больного, и прогноза течения рожи имеют сопутствующие заболевания.

При поступлении в стационар и в процессе лечения у больных в динамике изучались лабораторные показатели периферической крови, проводилось инструментальные исследования. Забор крови у больных производился утром, натощак для определения каталазы, МДА и ДК. Кровь брали из вены в количестве 3 мл, самотеком, без жгута, иглой с широким отверстием, в неё добавляли в соотношении 1:9 5% раствор цитрата натрия, предотвращающего свёртывание. Далее кровь центрифугировали при 900g в течение 5 минут, эритроцитарную массу отбрасывали.

Общий анализ крови и мочи проводился на аппарате "Datacel-1 б"(Франция); биохимическое исследование крови производилось на аппаратах "Ciba-Corning Express-550". Лабораторное исследование включало: биохимический анализ крови (определение активности аминотрансфераз, щелочной фосфотазы, ЛДГ, ГГ Г, КФК, амилазы, общего белка, альбумина, содержание крсатинина и мочевины, глюкозы, холестерина).

Кроме общего клинического обследования у больных изучались степень выраженности общих и местных проявлений воспалительных явлений, состояние регенеративных и репаративных процессов.

С целью выявления бактериальной микрофлоры и уточнения этиологии развития осложнений у 118 пациентов проводились микробиологические исследования. Субстратом для исследования являлись: иитерстициалыгая жидкость, полученная пункционным способом содержимого булл; гнойное отделяемое из раны и участки некротически измененных тканей. Забор исследуемого материала проводили в соответствии с методическими рекомендациями (Методические рекомендации для врачей стажеров: Москва, 1985). Выделение и идентификацию возбудителей выполняли в соответствии с приказом МЗ СССР №535 от 22.04.95.

В 3 мл фосфатного буфера добавляли 10 мкл перекиси водорода (4%) и 5 мкл молибдата аммония (4%). Через 20 минут измеряли оптическую плотность при 316 нм против контрольной пробы - буферного раствора. Далее в опытную и контрольную пробу вносили одинаковое количество плазмы крови (10 мкл). Затем пробы ставили в термостат при температуре 37 С. Оптическую плотность измеряли через каждую минуту.

Принцип метода: при 100 С в кислой среде малоновый диальдегид реагирует с 2-тиобарбитуроБОЙ кислотой, образуя окрашенный триметиновый комплекс, с максимумом поглощения при 532 им. Молярный коэффициент экстипкции этого комплекса -є - 1,56.10 см .М"1. Реактивы: 0,025 М трис-HCL буфер (рН=7,4),содержащий 0Д75М хлорида калия; 17% раствор трихлоруксусной кислоты; 0,8% раствор 2-тиобарбитуровой кислоты.

Исследование активности перекисного окисления липидов у больных рожей

Настоящее исследование основано на клиническом материале, обобщающем опыт лечения и анализ историй болезни 118 пациентов с эритематозной и эритем атозно-буллезной формами рожи, которые находились на лечении в дневном стационаре ММУ №2 в период с 2001 по 2003 г.г. Среди пациентов основной исследуемой группы было 52 (44,1%) женщины и 66 (55,9%) мужчин в возрасте от 15 до 83 лет. Средний возраст пациентов составил 63,7 лет. У 98 пациентов (83,1%), отмечена первичная форма заболевания. Рецидивирующая рожа зарегистрирована у 9 (7,6%) больных, повторная у 11(9,3%) пациентов. Следует отметить, что 47,5% пациентов поступили в дневной стационар после безуспепюого амбулаторного лечения составляющего более 4-х суток. Время обращения за медицинской помощью от начала заболевания представлено в таблице 3. Как видно из полученных данных, в подавляющем большинстве случаев (63,6%) патологический процесс локализовался на нижних конечностях. Клиническое обследование при поступлении больных проводили по общепринятой схеме, предусматривающей выяснение жалоб на момент поступления, сбор анамнеза заболевания, общий осмотр пациента с определением распространенности и глубины местных воспалительных изменений, проведение лабораторных и специальных методов исследования. Объективизация тяжести общего состояния больного проводилась на основании анализа результатов объективного осмотра, оцешш биохимических и интегральных показателей функционирования системы гомеостаза. Важное значение при оценке тяжести состояния больного, и прогноза течения рожи имеют сопутствующие заболевания. Следует отметить, что у 65,0% больных отмечено одновременное сочетание двух и более сопутствующих заболеваний. При поступлении в стационар и в процессе лечения у больных в динамике изучались лабораторные показатели периферической крови, проводилось инструментальные исследования. Забор крови у больных производился утром, натощак для определения каталазы, МДА и ДК. Кровь брали из вены в количестве 3 мл, самотеком, без жгута, иглой с широким отверстием, в неё добавляли в соотношении 1:9 5% раствор цитрата натрия, предотвращающего свёртывание. Далее кровь центрифугировали при 900g в течение 5 минут, эритроцитарную массу отбрасывали.

Клинико-лабораторное исследование основных биохимических показателей у больных рожей в динамике

Настоящее исследование основано на клиническом материале, обобщающем опыт лечения и анализ историй болезни 118 пациентов с различными формами рожи, которые находились на лечении в гнойном отделении клиники общей хирургии им. В.И.Разумовского СГМУ в период с 2001 по 2003 гг.

Необходимо отмстить, что тяжесть патологического процесса отражалась следующими биохимическими показателями: концентрацией альбумина, уровнем глюкозы, активностью щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы и аминотрансфераз. Эти величины, в основном, отражают функциональное состояние клеток печени. Положительная динамика заболевания отражалась в изменении биохимических показателей в сторону их нормализации.

Фермент каталаза поступает в кровь из гепатоцитов, Увеличение активности этого энзима в плазме крови при положительной динамике течения основного заболевания, а также тенденция нормализации основных биохимических показателей печени, отражающих ее функциональное состояние, будет являться дополнительным диагностичесішм маркером на эффективность проводимого лечения, а также индикатором, отражающим тяжесть патологического процесса. Тенденция к нормализации основных биохимических показателей печени просматривалась во всех группах больных (табл. 11 итабл 12).

В биохимических исследованиях изучается только активность ферментов (по конечной точке), поскольку определение концентрации фермента представляет достаточно сложную задачу, связанную с выделением и идентификацией фермента. В то же время, предлагаемый нами подход имеет несколько преимуществ перед традиционными методами. Во-первых, происходит определение активности фермента (определение каталазной активности) не поп конечной точке, а кинетическим методом; во-вторых, исследование Кт позволяет определить скорость биохимической реакции; в-третьих, на основании скорости биохимической реакции и активности фермента можно определить концентрацию энзима как относительную величину в сравнении с другими группами больных или с контролем.

Активность антиоксидантного фермента каталазы также находилась в прямой зависимости от степени тяжести процесса. Отмечается тенденция к снижению каталазной активности в разгар заболевания у больных с осложненными формами рожи, что указывает на истощение антиоксидантной активности плазмы крови. При положительной динамике течения заболевания обнаруживается увеличение каталазной активности плазмы крови. Так у больного К., с осложненной формой эритематозной рожи в начале заболевания активность катал азы составляла 2,3 х 10_і нмоль/мин. мг, а после прохождения курса лечения эта активность стала равной 3,42x10" нмоль/мин. мг. У больного М. с осложненной формой эритематозно-буллезной рожи в начале лечения выявлена активность каталазы равная 1,60x10" нмоль/мин. мг; в процессе лечения эта величина увеличилась до 2,3 10 нмоль/мин. мг. У данных больных отмечалась также и нормализация показателей печени.

Необходимо отметить, что активность каталазы плазмы крови является надежным критерием, отражающим динамику тяжести течения патологического процесса, может служить критерием отражающим активность антиоксидантной системы.

Таким образом, проведенные исследования показали, что наибольшей диагностической информативностью обладают биохимические показатели функционального состояния печеночной ткани: альбумины, ЛлАТ, АсАТ, ЩФ, ЛДГ, метаболиты, отражающие общие пути метаболизма (глюкоза), а также конечный метаболит перекислого окисления липидов - малоновый диальдегид.

В результате повреждения клеточных мембран нарушается транспорт молекулярного кислорода в цитозолс клеток и он становится доступным для восстановленных эквивалентов типа НАД-Н2 и ФАД Н2, которые могут восстанавливать молекулярный кислород до супероксиданиона СЬ или до перекиси водорода (Ы2О2) с последующим вовлечением 0{ и HjCb в процессы окисления липидов клеточных мембран, что замыкает своеобразный порочный круг: интоксикация — воспаление повреждение мембран клеток — гипоксия — ПОЛ — увеличение процесса распада мембран — усиление воспалительных реакций.

В последние годы расширены показания к назначению препаратов, обладающих не только антиоксидантным, но и мембраностабилизирующим эффектом. Подобными свойствами обладают эссенциале, дицинон, добезилат кальция. Так, применение эссенциале показано при всех заболеваниях, сопровождающихся токсемией, гипоксией, а также при нарушении других обменных процессов, в регуляции которых существенная роль принадлежит клеточным мембранам.

Использование антиоксидантной терапии является перспективным в лечении многих заболеваний, выделенных в группу так называемых «свободно-радикальных», или «мембранных» патологий, объединяющих на сегодняшний день около 100 нозологических единиц, таких как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, нейродегенеративпые заболевания, сахарный диабет и его осложнения, катаракта, аутоиммунные и воспалительные заболевания наследственная патология, заболевания печени, нефропатология, ожоговая болезнь и другие.

Наибольший интерес представляет возможность выявления антиоксидантных средств, специфически действующих на конкретные звенья процессов СРО, а кроме того, препятствующих избыточному образованию продуктов ОМБ и устраняющих токсические эффекты последних. Важным при этом представляется отбор для дальнейших испытаний таких веществ, которые при внедрении в клиническую практику, наряду с высокой эффективностью АО действия, проявляли бы минимум побочных эффектов.

Представленные выше литературные данные показывают, что наиболее широко используемые в медицине группы антиоксидантов прямого действия (доноры протонов (токоферол, пробукол, аскорбиновая кислота) и полиены (ретинол, каротиноиды)) более эффективны для снижения процессов ПОЛ и слабее защищают от окислительного повреждения белки и нуклеиновые кислоты. Комплсксообразоватсли могут защищать организм только от металло-зависимых процессов СРО. Наибольшие перспективы клинического применения имеют представители групп катализаторов и ловушек радикалов: в первую очередь за счет наиболее универсального ингибирующего действия на СРО (эти антиоксиданты способны элиминировать избыток АФК, являющийся первичным инициатором реакций ОС).

Проведенные нами биохимические исследования позволили выяснить, что одним из механизмов, способствующих прогрессированию некротических изменений в коже больных, является нарушение структуры и функции клеточных мембран в процессе свободнорадикального окисления мембранных липидов. Сдерживает указанные процессы в организме многокомпонентная система антиоксидантной защиты, включающая в себя различные неферментные био антиоксиданты (токоферол, каратипоиды, ретинол, убихиноны и др.), а также ряд специфических ферментов (супероксид-дисмутаза, каталаза, пероксидаза, глютатионредуктаза и др.).

С целью стабилизации структуры и функции биомембран в лечении больных рожей нами начато применение препаратов с антиоксидантным эффектом: токоферола (витамин Е), каротина, ретинола, унитиола, натрия-тиосульфата, аскорбиновой и никотиновой кислот.

Нами расширены показания к назначению препаратов, обладающих не только антиоксидантным, но и мембрапостабилизирующим эффектом, таким как эссенциале и дицинон. Так, по нашему мнению, применение эссенциале показано при всех заболеваниях, сопровождающихся токсемией, гипоксией, а также нарушениями других обменных процессов, особенно тех, в регуляции которых существенная роль принадлежит клеточным мембранам.