Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Митохондриальная днк как объект молекулярно-генетической идентификации личности ...17
1.1. Маркеры ДНК, используемые при молекулярно-генетической идентификации личности человека 17
1.2. Структурная организация митохондриальной ДНК 29
1.3. Феномен гетероплазмии 50
1.4. Мутации структурных генов мтДНК при различных патологиях 61
1.5. МтДНК - как объект судебно-медицинских исследований 65
Глава 2. Материалы и методы исследования 74
2.1. Сбор образцов биологических тканей 74
2.2. Антропологические методы исследования .79
2.3. Молекулярно-биологические методы исследования 81
2.4. Статистическая обработка результатов исследования 91
Глава 3. Оценка дискриминирующей способности некодирующей области митохондриальной ДНК 92
3.1. Использование центрального региона (CR) D-петли мтДНК в качестве дополнительного маркера для молекулярно-генетической идентификации личности 92
3.2. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей гипервариабельных сегментов 1 -го и 2-го типов 101
3.3. Анализ закономерностей появления точечных замен в гипервариабельных участках контрольного региона митохондриальной ДНК 112
Глава 4. Увеличение идентификационной значимости мтДНК-типирования при дополнительном анализе структурных генов митохондриального генома 132
Глава 5. Непрямая мтДНК-идентификация в случаях неполных родственных групп 159
5.1. Комплексный анализ ядерных и митохондриальных ДНК-маркеров при непрямой идентификации личности 159
5.2. Оптимизация баз данных митотипов для решения задач ДНК-идентификации личности 167
Глава 6. Разработка критериев надежности при интерпретации результатов мтДНК-идентификации 180
Глава 7. Непрямая днк-идентификация неопознанных останков военнослужащих, погибших в ходе боевых операций на Северном Кавказе 204
7.1 Непрямая ДНК-идентификация при массовом поступлении неопознанных тел 204
7.2 Единая информационная программная система, как основа автоматизации процесса ДНК-типирования личности и сопутствующего документооборота 224
7.3 Разработка автоматизированной системы мтДНК-анализа для решения задач непрямой молекулярно-генетической идентификации неопознанных тел в условиях массового поступления останков 230
Заключение 243
Выводы 252
Список литературы 254
- Структурная организация митохондриальной ДНК
- Молекулярно-биологические методы исследования
- Полиморфизм нуклеотидных последовательностей гипервариабельных сегментов 1 -го и 2-го типов
- Увеличение идентификационной значимости мтДНК-типирования при дополнительном анализе структурных генов митохондриального генома
Введение к работе
Проведение боевых операций в Северо-Кавказском регионе в 1994-1996 гг. повлекло за собой поступление значительного числа тел погибших военнослужащих (ТПВ), не подлежащих визуальному опознанию. Уже в начале 1995 года в связи с массовыми поступлениями неопознанных погибших российских военнослужащих перед руководством министерства обороны Российской Федерации (МО РФ) встала острая социально-политическая задача идентификации личности погибших. Данная задача осложнялась тем, что ни в МО РФ, ни в других ведомствах РФ не имелось структур, обладающих достаточным потенциалом сил и средств для решения такой широкомасштабной проблемы в кратчайшие сроки [Колкутин и соавт., 2003].
Кроме того, было очевидно, что только традиционными судебно-медицинскими методами идентификации справиться с этой задачей практически невозможно. Классические методы идентификации личности, основанные на сравнительном анализе морфологических признаков, изучении минерального состава костей скелета и других специальных технологиях, имеют предел идентификационных возможностей [Абрамов и соавт., 2000]. Отсутствовала и нормативно-правовая база для организации подобной работы, так как официально на момент первой чеченской кампании в МО РФ не существовало каких-либо руководящих документов, регламентирующих стратегию и тактику командования и медицинской службы военного ведомства в подобных ситуациях. В том числе и по этой причине внезапно возникшая необходимость идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел стимулировала использование современных молекулярно-генетических методов в судебно-криминалистической практике.
Первые судебно-генетические экспертизы по установлению личности военнослужащих, погибших на территории Чеченской Республики, были проведены в 1995-1996 годах. Однако отсутствие на тот момент времени базы сравнительного биологического материала с одной стороны и опыта работы
8 такого масштаба с другой, не позволяло проводить сколь-нибудь эффективное аналитическое сравнение генотипов погибших со всем массивом кровных родственников.
В 1998 году при непосредственном участии Комиссии при Президенте Российской Федерации по интернированным, военнопленным и пропавшим без вести началось формирование базы данных сравнительного материала, для чего было проведено массовое взятие крови родственников военнослужащих, погибших и пропавших без вести на территории Чеченской Республики. В том же году на базе 124 судебно-медицинской лаборатории Северо-Кавказского военного округа была создана лаборатория молекулярно-генетических исследований, основной задачей которой явилась идентификация личности тел неопознанных российских военнослужащих, погибших на территории Чеченской Республики, с помощью методов молекулярной генетики. Эти исследования являлись частью мероприятий, осуществляемых Правительством РФ в рамках программы по идентификации военнослужащих, погибших во время вооруженного конфликта 1994-96 гг. в районе Чеченской Республики: в постановлении № 1052 от 20 августа 1997 года Правительства РФ были определены требования по отношению к идентификационным исследованиям останков погибших в ходе чеченской войны, и, в частности, в качестве обязательного элемента предусмотрен анализ на уровне ДНК.
Применительно к специфике поставленной задачи, ввиду отсутствия референтной базы молекулярно-генетических данных на ТПВ, использовались методы так называемой непрямой идентификации или идентификации на основании установления фактов кровного родства [Гаврилей Ю.К. и соавт., 2002]. Около 40% ТПВ поступали на идентификационные исследования в состоянии сильной деградации или сравнительный материал на них был представлен только родственниками по материнской линии. В связи с этим основным методом молекулярно-генетической идентификации в таких случаях становился анализ полиморфизма митохондриальной ДНК (мтДНК).
9 Типирование локусов митохондриальной ДНК (мтДНК) в целях молекулярно-генетической идентификации личности незаменимо в случаях ограниченного количества исследуемого материала или сильной деградации биологических образцов. В настоящее время идентификационная значимость мтДНК-типирования определяется полиморфной природой двух гипервариабельных регионов D-петли (HV1 (16024-16365) и HV2 (73-340) [Wilson M.R. et al., 1993; Miller K.W.P. et al., 1996]. Однако невысокий потенциал дискриминации традиционно используемых митохондриальных маркеров не позволяет эффективно применять этот метод в случаях больших или открытых групп потенциальных источников данного образца [Holland М.М. et al., 1993; Inman К., Rudin N., 1997; Holland M.M., Parsons T.J., 1999]. Так как нуклеотидные последовательности мтДНК практически идентичны у всех матроклинных родственников, в методе мтДНК-типирования заложена не идентификация личности как таковой, а выяснение принадлежности испытуемой пробы к определенному митотипу или матрилинейному ряду [Parsons T.J., Coble M.D., 2001].
Эффективность использования генетических маркеров мтДНК в целях идентификации личности может быть существенно повышена при условии оценок дискриминирующего потенциала настоящего метода. Однако это может произойти только при наличии Баз Данных полиморфизма мтДНК для данной этнической группы. С использованием методов расшифровки первичных нуклеотидных последовательностей к настоящему времени накоплены многочисленные данные о полиморфизме гипервариабельных сегментов контрольного региона мтДНК в различных этнических группах [Lutz S. et al., 1998; Parson W. et al., 1998; Rousselet F., Mangin P., 1998; Crespillo M. et al., 2000; Dimo-Simonin N. et al., 2000; Pereira L. et al., 2000; Gabriel M.N. et al., 2001; Tagliabracci A. et al., 2001; Monson K.L. et al., 2002; Malyarchuk B.A. et al., 2003]. В общем случае, отсутствие частот митотипов для данной этнической группы приводит только к качественной оценке мтДНК-идентификации
10 кровного родства: "родство исключается полностью" и "родство не исключается" [Гаврилей Ю.К. и соавт., 2002].
До недавнего времени анализ первичной структуры мтДНК предоставлял возможность надежной идентификации лишь в пределах относительно небольшой замкнутой группы потенциальных претендентов. Однако в ряде случаев возникает необходимость идентификации двух и более индивидуумов с одинаковыми нуклеотидными последовательностями гипервариабельных регионов (HV1 и HV2). То есть одна из основных проблем мтДНК-идентификации заключается в наличии абсолютно идентичных митотипов у двух и более исследуемых проб, что является следствием низкого потенциала дискриминации традиционно используемых митохондриальных маркеров (HV1 и HV2). И если два и более индивидуумов имеют идентичные митотипы по локусам HV1 и HV2, их дальнейшая дифференцировка в пределах данного подхода невозможна. Для повышения эффективности мтДНК-идентификации необходимо исследование дополнительных полиморфных генетических маркеров мтДНК.
Полиморфизм нуклеотидных последовательностей за пределами гипервариабельных локусов контрольного региона (HV1 и HV2) не используется в рутинной практике судебно-медицинской идентификации личности и установления кровного родства. Имеются данные литературы, свидетельствующие о наличии полиморфных позиций за пределами локусов HV1 и HV2 [Johnson К.Р., Sorenson M.D., 1998; Балмышева Н.П., Соловенчук Л.Л., 1999; Ingman М. et al., 2000; Lee S.D. et al., 2002; Brandstatter A. et al., 2003; Lutz-Bonengel S. et al., 2003; Mishmar D. et al., 2003]. Поэтому исследование полиморфных позиций за пределами контрольного региона позволит получить ценную информацию, которая могла бы увеличить потенциал индивидуализации ДНК-идентификации личности.
Несмотря на наличие принципиальной возможности решения экспертной задачи, непрямая мтДНК-идентификация неопознанных тел в условиях их
массового поступления - например, в ходе боевых действий, — является чрезвычайно трудоемкой задачей при использовании методов и средств, рассчитанных на применение в стандартных судебно-медицинских идентификационных экспертизах. Эти методы не приспособлены для решения аналитических задач, возникающих в условиях идентификационной работы, характеризующейся большим объемом и поточным поступлением объектов.
В условиях массового поступления неопознанных тел проблема идентификации останков связана в первую очередь с применением новых автоматизированных медико-криминалистических систем, основное назначение которых заключается в автоматической обработке огромных массивов первичной информации с целью предоставления точных данных об исключенных объектах идентификации и набора рекомендательных списков с вероятностными оценками возможного кровного родства с объектами сравнения.
Целью настоящей работы явилась разработка комплекса новых молекулярно-генетических маркеров митохондриальной ДНК для определения наиболее эффективной стратегии непрямой молекулярно-генетической идентификации личности в условиях поточного исследования биологических объектов при массовом поступлении неопознанных тел.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: Провести сравнительный анализ полиморфизма различных областей
некодирующей области мтДНК и исследовать зависимость частоты точечных
замен в контрольном регионе от расположения функциональных элементов
митохондриального генома.
Исследовать полиморфизм нуклеотидных последовательностей в
области структурных генов митохондриального генома и сравнить их
12 дискриминирующую способность в качестве дополнительных генетических маркеров для непрямой мтДНК-идентификации личности.
Разработать критерии повышения надежности при интерпретации результатов непрямой мтДНК-идентификации с учетом механизма и частоты возникновения точечных нуклеотидных замен в мтДНК.
Провести анализ степени надежности непрямой мтДНК-идентификации при комплексном анализе генетических маркеров ядерной и митохондриальной ДНК в зависимости от размера рабочей базы данных митотипов.
С учетом опыта ДНК-идентификации военнослужащих, погибших в ходе боевых операций на Северном Кавказе разработать стратегию непрямой молекулярно-генетической идентификации личности в условиях поточного исследования биологических объектов при массовом поступлении неопознанных тел.
Разработать алгоритмы для решения задач непрямой мтДНК-идентификации личности при массовом поступлении неопознанных тел с учетом специфики перекрестной обработки массивов данных, получаемых для родственных групп и для неопознанных тел.
Научная новизна и теоретическое значение работы
По сравнению с HV1 и HV2 центральный регион (CR) D-петли обладает наименьшим полиморфизмом. Тем не менее, дискриминирующая способность этого региона достаточна для использования локуса CR в качестве дополнительного генетического маркера при мтДНК-идентификации.
Показана неоднородность распределения полиморфных сайтов в контрольном регионе митохондриального генома, что связано с наличием функционально-значимых областей. Будучи лишенными функциональной нагрузки и потенциально нейтральными для генетического отбора, некоторые участки контрольного региона мтДНК обладают значительным полиморфизмом. Функционально-значимые участки некодирующей области мтДНК имеют наименьшее число "горячих" точек.
Впервые описана расширенная терминационно-ассоциированная нуклеотидная последовательность 3-го типа (ETAS3) в области типервариабельного сегмента HV1 D-петли митохондриального генома человека. В районе гипервариабельного сегмента 2-го типа, HV2, описан блок консервативных нуклеотидных последовательностей (аналогичный CSB).
Показан взаимосвязанный характер точечных нуклеотидных замен в консервативных участках расширенных терминационных областей ETAS1 и ETAS2. На примере терминационных последовательностей (TAS, ETAS1 и ETAS2) показано, что дублирование функционально значимых участков D-петли мтДНК связано с наличием полиморфных позиций внутри этих областей.
С учетом механизмов возникновения нуклеотидных замен в мтДНК разработаны критерии повышения надежности при интерпретации результатов непрямой мтДНК-идентификации.
Введено понятие «Динамической» (постоянно пополняемой) Базы Данных первичных нуклеотидных последовательностей гипервариабельных регионов мтДНК для оценки идентификационной значимости непрямой мтДНК-идентификации.
Выделено 6 структурных генов ND2, ND3, ND5, ND6, CytB и АТР6, наиболее подходящих на роль дополнительных генетических маркеров митохондриального генома. Два из них (ND3 и ND6), вследствие небольших размеров, могут с успехом применяться для типирования высоко деградированных биологических образцов. Четыре маркера (ND2, АТР6, ND5 и CytB) имеют наиболее высокий дискриминирующий потенциал.
Практическое значение работы
Разработана концепция динамической базы данных митотипов. Использование объединенной базы данных европеоидных митотипов позволяет повысить идентификационную значимость ДНК-типирования более чем в 10 раз в случае уникальных типов мтДНК.
Показано, что вследствие высокого полиморфизма участок центрального региона D-петли и структурные гены мтДНК, такие как АТР6, CytB, ND2, ND3, ND5 и ND6, могут быть использованы в качестве дополнительных генетических маркеров при мтДНК-идентификации личности. Показано, что дискриминирующая способность отдельно взятых структурных генов мтДНК ниже, чем гипервариабельных сегментов контрольного региона. Однако комплексный анализ этих генетических маркеров существенно повышает надежность мтДНК-идентификации личности.
Разработаны экспертные схемы для анализа совпадающих HV1/HV2-профилей, которые должны предусматривать получение дополнительных данных секвенс-анализа о нуклеотидных последовательностях, лежащих за пределами участков 16024-16365 и 73-340.
Впервые в практике российской судебно-медицинской генетики проведена широкомасштабная непрямая молекулярно-генетическая идентификация военнослужащих, погибших в ходе боевых операций на Северном Кавказе в период за 1994-2002 годы. Разработаны принципы и стратегии ДНК-идентификации личности в условиях массового поступления неопознанных тел. Показано, что типирование биологических образцов, подвергшихся сильным гнилостным и термическим повреждениям наиболее эффективно по локусам ДНК, размер которых не превышает 200 оснований.
Разработана новая автоматизированная медико-криминалистическая система, использующая результаты мтДНК-анализа для решения задач непрямой идентификации личности на основе данных полиморфизма нуклеотидных последовательностей мтДНК в условиях поточной обработки информации при массовом поступления неопознанных тел.
Показано, что интеграция методов анализа некодирующей области мтДНК и области структурных генов в рамках единой схемы мтДНК-идентификации позволяет существенным образом повысить надежность непрямой идентификации с учетом статистических оценок.
15 Настоящее исследование является частью мероприятий, осуществляемых
Правительством РФ (постановление № 1052 от 20.08.1997) в рамках программы
по идентификации военнослужащих, погибших во время вооруженного
конфликта 1994-96 гг. в районе Чеченской Республики.
Результаты настоящего исследования используются в образовательном
процессе Ростовского государственного университета при подготовке
специалистов биологического профиля.
Основные положения, выносимые на защиту:
Научно-методические принципы и подходы к решению задач непрямой молекулярно-генетической идентификации личности при массовом поступлении неопознанных тел наиболее эффективно реализуются при интеграции рутинных и компьютерных методов в идентификационных исследованиях, позволяющих производить сравнительный анализ ДНК-маркеров в условиях поточной обработки информации при массовом поступлении неопознанных тел.
Комплексный анализ структурных генов и всей некодирующей области мтДНК позволит повысить индивидуализирующую способность мтДНК-идентификации по традиционным генетическим маркерам (HV1 и HV2) за счет увеличения количества уникальных митотипов.
Типирование маркеров ядерной и митохондриальной ДНК в рамках единой схемы идентификации личности на 2-3 порядка повышает надежность непрямой ДНК-идентификации личности в случае неполных родственных групп
Разработанная модель динамической базы данных нуклеотидных последовательностей типов мтДНК существенно повышает идентификационную значимость мтДНК-типирования.
Критерии надежности интерпретации результатов мтДНК-идентификации включают в себя сведения о скорости химических
*
реакций, лежащих в основе точечных нуклеотидных замен, и генетическую локализацию нуклеотиднои замены.
Структурная организация митохондриальной ДНК
Митохондриальный кольцевой геном содержит 16 569 п.н., которые кодируют 37 плотно упакованных генов. Двадцать два митохондриальных гена кодируют молекулы транспортной РНК (тРНК), 2 кодируют рибосомные РНК (12S и 16S рРНК) и 13 кодируют ферментные белки, вовлеченные в электронную транспортную цепь окислительного фосфорилирования и производства АТФ (располагается во внутренней митохондриальной мембране) [Wallace D.C., 1992]. Все 13 кодируемых мтДНК белков, как предполагается, являются необходимыми потому, что они используются в митохондриях для окислительного фосфорилирования и, следовательно, для производства клеточной АТФ. Все остальные митохондриальные компоненты кодируются ядерными генами и доставляются к органелле определенными системами импорта [PfannerN., 1998; Schatz G., 1998]. Митохондриальная ДНК человека обладает весьма интересным свойством — она, за ислючением некоторых патологий, не метилирована [Wilson J.D. et al., 1994; Сингер М., Берг П., 1998].
Митохондриальный геном позвоночных чрезвычайно компактен. Промежутки между генами, как правило, не превышают 25 п.н. и в большинстве случаев составляют менее 3 п.н. Иногда (например, в случае генов тРНК изолейцина и тРНК глутамина, а также генов АТРазных субъединиц 6 и 8) гены перекрываются [Anderson S. et al., 1981].
Каждый ген белка и рРНК непосредственно фланкированы, по крайней мере, одним тРНК-геном. Таким образом, экспрессия митохондриальной геномной информации требует тРНК вырезания (сплайсинга) в качестве главного механизма РНК-процессинга. Этот процесс происходит с участием митохондриальной РНКазы Р (именно она способна распознавать структуры-шпильки, ограничивающие участки генов мтДНК) [Doersen C.J. et al., 1985; Shadel G.S., Clayton D.A., 1997]. С несколькими известными исключениями, полное генетическое содержание и порядок генов в мтДНК высоко консервативны у всех видов позвоночных; однако, нуклеотидные последовательности и организация регуляторних элементов мтДНК, вовлеченных в транскрипцию и репликацию генома, варьируют.
Две нити мтДНК могут быть разделены на денатурирующих (щелочных) градиентах хлорида цезия вследствие различного содержания G+T в нитях, и, из-за этого свойства, обозначаются как «тяжелая нить» (Heavy или Н-нить) и «легкая нить» (Light или L-нить), соответственно. Транскрипция каждой нити происходит от одного или двух промоторов (в зависимости от вида) при непосредственном участии РНК-праймеров по механизму, напоминающему репликацию ДНК с участием фрагментов Оказаки [Льюин Б., 1987]. Эти промоторы обозначаются: промотор легкой нити (LSP или Light. Strand Promotor) и промотор тяжелой нити (HSP или Heavy Strand Promotor), в зависимости от того, какая нить мтДНК служит матрицей для транскрипции. Большие полицистронные транскрипты, синтезированые на каждой нити, после процессинга образуют зрелые тРНК, рРНК и мРНК, делая возможной экспрессию митохондриальной генетической информации [Attardi G., Montoya J., 1983; Clayton D.A., 1984; Attardi G., Schatz G., 1988]. У всех позвоночных, исследованных до настоящего времени, молекула мтДНК, кроме области структурных генов, содержит также некодирующий регион, внутри которого содержатся промоторы для инициирования транскрипции и точно определенная точка начала репликации ДНК Н-нити (Он).
Репликация митохондриальной ДНК осуществляется внутри органелл с помощью ДНК-полимеразы у и ряда других белков. Синтез ДНК в митохондриях проходит автономно от синтеза яДНК. Это подтверждается тем, что репликация ДНК в митохондриях наблюдается как в делящихся, так и в покоящихся соматических клетках, а также при ингибировании синтеза яДНК а-афидиколином [Гаузе Г.Г., 1977; Kang D. et al., 1997]. Интенсивность синтеза ДНК в митохондриях связана с усилением аэробного метаболизма и с образованием новых органелл в результате обновления популяции митохондрий в клетках. Период полужизни митохондриальной ДНК, оцениваемый по включению 3Н-тимидина, колеблется в митохондриях различных органов даже у одного организма от 8 до 12 суток [Mazzochi G. et al., 1976].
Синхронность репликации ядерной и митохондриальной ДНК показана только для трипаносом и других одноклеточных жгутиковых семейства Kinetoplastida [Englund Р.Т. et al., 1982]. Установлено, что цепи мтДНК. раскручиваются не по всей длине, а на коротком участке; здесь образуется репликационная вилка, перемещение которой возможно только при раскручивании ДНК-спирали и закручивании двух дочерних молекул. Конформацию спирали изменяют три группы ферментов. Митохондриальная ДНК-хеликаза является основным фактором скручивания-раскручивания двойной спирали ДНК и работает на матрице мтДНК перед ДНК-полимеразой. Наличие такого полипептида подтверждено при анализе очищенных митохондриальных лизатов яиц морского ежа Paracentrotus lividis [Roberti М. et al., 1996]. Показано, что выделенная фракция хеликазы способна раскручивать (при обязательном присутствии АТФ и ионов магния) 39-нуклеотидный мотив, присоединенный путем отжига к одноцепочечной ДНК фага М13: при этом подтверждено движение в направлении 3 — 5 . По основным кинетическим характеристикам хеликаза морского ежа проявляет существенное сходство с rep-хеликазой E.coli и митохондриальной хеликазой клеток головного мозга быка. МтДНК-хеликазная активность была выявлена также и у других организмов. Весьма вероятно участие ферментов данного типа в репликации у позвоночных животных и, в частности, у млекопитающих, в том числе, у человека [Clayton D., 1984; Shadel G., Clayton D., 1997; Clayton D., 2000]. Анализ локализации точки начала репликации мтДНК in vivo с однонуклеотидным разрешением, показал его универсальность у различных представителей позвоночных [Shadel G., Clayton D., 1997].
В митохондриях печени крыс обнаружена также топоизомераза, которая обладает способностью релаксировать как положительные, так и отрицательные супервитки ДНК. Митохондриальная топоизомераза является специфической для этих органелл, так как ее активность ингибируется этидий бромидом и беренилом, которые не эффективны в отношении ядерных топоизомераз. Данный фермент обладает способностью удалять положительные сверхвитки ДНК митохондрий, что свидетельствует о возможном участии ДНК-топоизомеразы в процессе репликации ДНК [Минченко А.Г., Дударева Н.А., 1990].
С помощью метода ПЦР данные о наличии уникальной точки начала репликации были подтверждены [Kang D. et al., 1997]. Репликация начинается в специфической точке начала {ori Н - Он) в кольцевой двухцепочечной ДНК с РНК-праймера, транскрибируемого с промотора легкой цепи (LSP). Праймер образуется при участии мтРНК-полимеразы и митохондриального транскрипционного фактора A (mtTFA) [Shadel G.S., Clayton D.A., 1997]. Этот кодируемый яДНК белковый фактор играет центральную роль в биогенезе митохондрий, в данном случае, осуществляя функцию контроля связи между транскрипцией и переходом к репликации ведущей цепи мтДНК [Clayton D.A., 1984]. В результате синтеза короткого РНК-транскрипта образуется R-петля -стабильный гибрид ДНК-РНК, состоящий из родительских цепей ДНК и новосинтезированного РНК-транскрипта. Транскрипт процессируется с образованием праймера, который далее элонгирует митохондриальная ДНК-полимераза. Процессинг РНК-транскриптов LSP осуществляет сайт-специфическая митохондриальная РНК-процессирующая эндонуклеаза (РНКаза MRP, от англ. mitochondrial RNA processing). Фермент имеет сложную структуру, сходную у разных видов организмов [Shadel G.S., Clayton D.A., 1997].
Молекулярно-биологические методы исследования
Процедура включала этапы экстракции ДНК из костных останков без остатков тканей и костного мозга. Первый этап экстракции состоял из стадии декальцинирования костной стружки. Экстракция ДНК включала в себя лизис ядерных клеток в присутствии додецилсульфата натрия и протеиназы К [Корниенко и соавт., 2001]. Для повышения эффективности экстракции ДНК в клеточный лизат дополнительно вводили реагенты-тиовосстановители, дитиотрейтол или 2-меркаптоэтанол, которые разрушали дисульфидные белковые сшивки, дезорганизуя тем самым надмолекулярные клеточные ансамбли. Проводили очистку от фрагментов белков фенол/хлороформом, концентрирование раствора ДНК осуществляли при помощи концентратора Centricon 100 [Hochmeister M.N. et al., 1991; Fisher D.L. et al., 1993].
Выделение ДНК из крови методом органической экстракции. При выделении ДНК из крови использовали органические растворители [Schneider P.M., 1998]. В основе метода лежит лизис клеток крови под действием додецилсульфата натрия и протеиназы К. Лизат клеток обрабатывали смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт. ДНК получали преципитацией с использованием хлорида натрия и холодного этанола с последующим растворением в трис-ЭДТА буфере. 2.3.3. Очистка ДНК белых клеток крови, иммобилизованной на FT A Gene Guard системе, от ингибиторов ПЦР.
Связанную ДНК освобождали от гема и других ингибиторов ПЦР с помощью специального FTA-реагента для отмывки [Burgoyne L. et al., 1996а; Burgoyne L., 1996b; Elliot J.C. et al., 1997]. В течение всей процедуры очистки ДНК оставалась связанной с твердым носителем, который затем непосредственно вносили в ПЦР-смесь.
Основная процедура выделения включала очистку от металлосодержащих соединений и протеинов с последующим кипячением образца в присутствии Chelex 100; затем супернатант непосредственно добавляли в ПЦР смесь [Walsh S.P. et al., 1991b; Willard J.M. et al., 1998].
От пятен крови на FTA-карте отрезали фрагменты диаметром 1-3 мм, которые помещали в микроцентрифужные пробирки. Добавляли 200 мкл 5% суспензии Chelex 100, инкубировали при +56С в течение 60 мин. После инкубации пробирки встряхивали и помещали на 8 мин в кипящую водяную баню. Центрифугировали 3 мин при 10000 об/мин, супернатант использовали для проведения ПЦР. Для контроля чистоты реагентов в процессе выделения ДНК проводили экстракцию пробы, не содержащей ДНК (холостая проба).
Препараты выделенной ДНК хранили при температуре -70С.
2.3.5. Проведение электрофореза выделенной ДНК Электрофоретическое разделение препаратов выделенной ДНК проводили в геле 0,8-1,0% агарозы при постоянном напряжении 7 В/см в течение 30-40 минут [Херрингтон С, Макги Дж., 1999]. После разделения фракции ДНК визуализировали по интенсивности флуоресценции в ультрафиолетовом свете в присутствии бромистого этидия. В качестве размерного стандарта использовали ДНК фага X, обработанную рестриктазами EcoRI и Hindlll.
Количество и качество выделенной ДНК оценивали с помощью компьютерной гель-документирующей системы BioDoc Analyze (производство фирмы «Biometra»), имеющей чувствительную CCD камеру и программное обеспечение для качественной оценки и количественного анализа результатов электрофореза [Корниенко и соавт, 2001].
С помощью программного обеспечения BioDoc Analyze рассчитывали размеры фрагментов выделенной ДНК, по заданным числовым параметрам размерного маркера, а по интенсивности флуоресценции получали информацию о количестве ДНК, содержащейся в данной фракции.
Количественная оценка выделенной ДНК Концентрацию ДНК в пробах после процедуры экстракции определяли с помощью флуориметра Hoefer DyNA Quant 200. В присутствии ДНК у бисбензимида (общеизвестен как краситель Hoechst 33258 или Н 33258) изменялись параметры флуоресценции, интенсивность которой была пропорциональной концентрации ДНК. В отсутствие ДНК максимум поглощения и эмиссии Hoechst 33258 составлял 356 и 492 нм, соответственно. При взаимодействии Н 33258 с ДНК эти пики сдвигались в область 365 нм (поглощение) и 458 нм (эмиссия) [Cesarone С. et al., 1979; Daxhelet G.A. et al., 1989]. По интенсивности флуоресценции (по калибровочной кривой или по сравнению с образцом ДНК с известной концентрацией) определяли концентрацию препаратов ДНК.
Энзиматическая амплификация локусов гипервариабельного региона митохондриальной ДНК Энзиматическую амплификацию гипервариабельного участка мтДНК, основанную на полимеразной цепной реакции, проводили по локусам HV1 (16024-16365) и HV2 (00073-00340) с использованием следующих праймеров. Для HVl-локуса: F15971 (5 -ТТА ACT CCA CCA TTA GCA CC-3 ) и R16410 (5 -GAG GAT GGT GGT CAA GGG AC-3 ), для НУ2-локуса: F15 (5 -CAC ССТ ATT AAC С AC TCA CG-3 ) и R448 (5 GA GAT TAG TAG TAT GGG AG-3 ).
Типирование локусов HV1 и HV2 в области D-петли митохондриальной ДІЖ проводили с использованием набора GeneAmp PCR Core Reagents (РЕ Applied Biosystems) для ферментативной амплификации ДНК следующим образом.
ПЦР-смесь объемом 25 мкл содержала: 2,5 мкл 10Х буфера (конечная концентрация компонентов: 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 50 мМ КС1 и 1,5 мМ MgCb), 2 мкл 2,5 мМ смеси 4-х дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1 мкл 10 мкМ прямого праймера, 1 мкл 10 мкМ обратного праймера и 0,25 Ед AmpliTaq ДНК полимеразы. В реакционную смесь вносили препараты ДНК и объем доводили до 25 мкл стерильной деионизованнои водой.
Полиморфизм нуклеотидных последовательностей гипервариабельных сегментов 1 -го и 2-го типов
Использование генетических маркеров митохондриального генома для идентификации личности возможно только при условии оценки дискриминирующего потенциала метода мтДНК-идентификации, для чего необходимо иметь Базы Данных нуклеотидных последовательностей мтДНК. Без оценок частот митотипов возможны два варианта выводов мтДНК-идентификации: "исключается полностью" и "не исключается". Для получения статистически достоверного экспертного заключения при совпадении нуклеотидных последовательностей опытной и референтной проб необходимо иметь репрезентативную статистику встречаемости различных вариантов митотипов в данной популяции. Только такой подход позволит дать экспертный вывод с оценкой вероятности кровного родства.
В задачах идентификации личности человека с использованием маркеров мтДНК первичные генетические данные представляют собой массивы нуклеотидных последовательностей длиной около 600 нуклеотидных пар для двух гипервариабельных сегментов - HV1 и HV2. В процессе проведения молекулярно-генетического исследования выполняется сравнение нуклеотидной последовательности объекта идентификации - неопознанного биологического объекта и объектов сравнения - представителей матроклинной родственной группы. Вычисление надежности результатов идентификации требует математического расчета на основе анализа частоты митотипов в данной популяции.
Анализ первичных последовательностей показал, что HV1 и HV2 являются высоко полиморфными регионами (табл. 4). Результаты исследования нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов локусов HV1 и HV2 показали наличие 185 митотипов, 161 из которых были уникальными. Первичные последовательности всех митотипов представлены в EMBL GenBank (регистрационные номера AF448598-AF448721 и AF450327-AF450450, Kornienko I.V., Ivanov P.L., 2001). При сравнении с референтной последовательностью легкой цепи мтДНК в пределах контрольного региона обнаружили 140 полиморфных позиций, 95 из которых были на участке HV1, а 45 - на HV2 (табл. 4)1
В таблице полиморфизма сверху указаны номера, в которых имеются отличия и соответствующие им нуклеотиды в референтной последовательности [Anderson S. et al., 1981], а затем перечисляются все митотипы в выборке с указанием нуклеотида, который заменил в данной позиции референтный (табл. 4). В случае, если в таблице имеется знак "-" или номер именуется, например, как "315.1", значит, в данной позиции имеется делеция или инсерция, соответственно. Правый столбец цифр указывает на то, сколько раз встретился данный митотип в выборке.
При анализе первичных последовательностей контрольного региона мтДНК российской популяции ни в одном из случаев не была обнаружена точковая гетероплазмия. В тоже время гетероплазмия длины амплифицированных фрагментов встречалась довольно-таки часто. Это может быть либо объективным следствием большего давления отбора на точковые мутации, либо субъективным следствием простоты определения гетероплазмии длины с помощью методики ПЦР. В этом случае последовательности нуклеотидов накладывались друг на друга, и в области несовпадения возникал фазовый сдвиг, что делало не возможным чтение всей первичной последовательности только с использованием прямых праймеров F15971 (для HV1) и F15 (для HV2). В этом случае для определения полной первичной последовательности, амплифицированные сегменты HV1 и HV2 секвенировали с обоих концов (рис. 6).
Результаты секвенирования фрагмента HV2 в районе 303-315 нуклеотидов. На верхней панели представлена секвенсограмма легкой цепи мтДНК (прямой праймер F15). На нижней панели показана секвенсограмма тяжелой цепи мтДНК (обратный праймер R448).
Высокий уровень нуклеотидных замен в гипервариабельных областях D-петли доказывает, что этот регион имеет высокий потенциал для генетического маркирования в популяционных исследованиях.
Как видно из таблицы 4, полиморфизм региона HV1 выше, чем HV2. Вероятно, это связано с тем, что HV2 является местом локализации сайтов, ответственных за начало репликации мтДНК: здесь расположены сайты связывания белковых факторов mTFl и репликативных праймеров [Shadel G.S., Clayton D.A., 1997; Clayton D.A., 2000]. Тогда как в HV1 расположены последовательности, ответственные в основном за терминацию транскрипции мтРНК [Doda J.N. et al., 1981]. Естественно, что большее давление отбора будут испытывать мутации, возникающие в HV2.
На основании результатов исследования была определена величина генетического разнообразия митотипов (h) HV1+HV2, которая оказалась равной 0,998. При этом величина h для отдельного локуса HV1 выше, чем для HV2 (0,981 и 0,967, соответственно).
Для характеристики надежности результатов молекулярно-генетической идентификации по генетическим маркерам мтДНК были рассчитаны величины случайного совпадения генетических признаков HV1 и HV2 в популяции. Вероятность того, что два, случайно выбранных из популяции, индивида будут иметь один и тот же митотип по HV1 или по HV2 равна 0,0234 и 0,0374, соответственно.
Увеличение идентификационной значимости мтДНК-типирования при дополнительном анализе структурных генов митохондриального генома
Стандартная схема идентификации личности с использованием маркеров мтДНК предусматривает проведение секвенс-анализа гипервариабельных локусов контрольного региона (HV1 и HV2). Основным критерием использования этих маркеров для ДНК-идентификации личности послужила высокая степень их полиморфности. Однако разрешающая способность мтДНК-анализа по локусам HV1 и HV2 не достаточно высока для надежного экспертного заключения в случаях поступления большого количества неопознанных тел. Это объясняется тем, что среднее число отличий от референтной последовательности [Anderson S. et al., 1981] для европеоидов, как правило, не превышает 6-8 [Holland М.М., Parsons T.J., 1999; Parsons T.J., Coble M.D., 2001]. Если исследуемый митотип обладает высокой частотой встречаемости в базе данных, то потенциал дискриминации мтДНК-идентификации личности будет крайне низким.
Основное ограничение при исследовании кровного родства по HV1 и HV2 сегментам заключается в наличии идентичных митотипов, что явно снижает дискриминирующий потенциал этих генетических маркеров. В целях повышения потенциала индивидуализации мтДНК-идентификации представляется перспективным анализ дополнительных генетических маркеров мтДНК, лежащих за пределами некодирующей области. Данный методический подход оправдан в случаях сильной деградации исследуемого образца, когда исследование ядерных генетических маркеров не представляется возможным, либо когда в качестве референтных образцов доступны лишь объекты от отдаленных родственников по материнской линии.
В практике молекулярно-генетической судебно-медицинской идентификации личности область структурных генов мтДНК, как правило, не исследуется. Данные литературы свидетельствуют о наличии полиморфных позиций за пределами контрольного региона [Корниенко И.В. и соавт., 2002е; Soong Deok Lee et al., 2002; Brandstatter A. et al., 2003; Lutz-Bonengel S. et al., 2003, Корниенко И.В. и соавт., 2003с, Kornienko I.V. et al., 2003]. Поэтому исследование полиморфных позиций за пределами этого участка мтДНК позволит получить ценную информацию, которая могла бы усилить идентификационную значимость мтДНК-типирования.
Именно в силу вышеизложенных причин для усиления надежности мтДНК-идентификации личности мы исследовали возможность использования структурных генов мтДНК в качестве дополнительных генетических маркеров. Несмотря на то, что большинство точечных замен локализованы в области D-петли, структурные гены также полиморфны [Johnson К.Р., Sorenson M.D., 1998; Ingman М. et al., 2000; Корниенко И.В., 2004]. Ранее методами рестрикционного анализа было показано, что вариабельность различных участков митохондриальной ДНК увеличивается в ряду: гены рРНК, гены тРНК, гены трех субъединиц цитохромоксидазы и апоцитохрома Ь, гены двух субъединиц АТФазы и семи субъединиц НАДН-дегидрогеназного комплекса, локусы D-петли [Hauswirth W.W., Clayton D.A., 1985; Roe В.A. et al., 1985; Cann R.L. et al., 1987; Fujii H. et al., 1988; Southern S.O. et al., 1989; Минченко А.Г., Дударева H.A., 1990; Kogelnik A.M. et al., 1996; Kogelnik A.M. et al., 1998; Ingman M. et al., 2000]. Эволюционная изменчивость митохондриальных генов также неодинакова. Наиболее консервативным является ген субъединицы I цитохромоксидазы, а гены субъединиц 5 и 6 НАДН-дегидрогеназного комплекса и субъединицы 8 АТФазы характеризуются наибольшей изменчивостью в процессе эволюции организмов [Christiansen G, Christiansen С, 1983; Roe В.А. et al., 1985; Балмышева Н.П., Соловенчук Л.Л., 1999], причем скорость накопления мутаций в гене шестой субъединицы (ND6) в 1,5 раза выше, чем в гене пятой субъединицы (ND5) НАДН-дегидрогеназного комплекса [Kumar S., 1996].
Мы провели сравнительный анализ первичных нуклеотидных последовательностей 13 структурных генов мтДНК: гена 1-й субъединицы цитохром С оксидазы (СОХ1), гена 2-й субъединицы цитохром С оксидазы (СОХ2), гена 3-й субъединицы цитохром С оксидазы (СОХЗ), гена цитохрома В (CytB), гена 1-й субъединицы NADH дегидрогеназы (ND1), гена 2-й субъединицы NADH дегидрогеназы (ND2), гена 3-й субъединицы NADH дегидрогеназы (ND3), гена 4-й малой субъединицы NADH дегидрогеназы (ND4L), гена 4-й субъединицы NADH дегидрогеназы (ND4), гена 5-й субъединицы NADH дегидрогеназы (ND5), гена 6-й субъединицы NADH дегидрогеназы (ND6), гена 6-й субъединицы АТФазы (АТР6), гена 8-й субъединицы АТФазы (АТР8). При анализе были использованы данные по 232 представителям большой европейской расы (AF346974, AF346975, AF346978, AF346981, AF346982, AF346983, AF346988, AF347006, AF381982, AF382001-AF382007, AF382009-AF382011, AY195745-AY195747, AY195750-AY195752, AY195754, AY195755, AY195756, AY195758, AY195764-AY195769, AY195773-AY195775, AY195778, AY195779, AY195781, AY339402-AY339593 [Ingman М. et al., 2000; Маса-Meyer N. et al., 2001; Finnila S. et al., 2001; Mishmar D. et al., 2003]).
![Возможности ладонной дерматоглифики при судебно-медицинской идентификации личности [Электронный ресурс]](/i/i/4467/191365.png "Возможности ладонной дерматоглифики при судебно-медицинской идентификации личности [Электронный ресурс] Сидоренко Андрей Григорьевич")
