Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Нуклеиновые кислоты биологических жидкостей 12
1.1. Нуклеиновые кислоты сыворотки крови в норме и при различных патологиях .12
1.2. Нуклеиновые кислоты асцитной и синовиальной жидкости 23
1.3. Нуклеиновые кислоты,выделяющиеся в культура-льную среду при выращивании клеток 26
1.4. Гипотезы о функциональном значении внеклеточных нуклеиновых кислот 37
Собственные исследования .41
Глава 2. Материал и методы исследования 41
2.1. Анализируемый материал 41
2.2. Выделение нуклеиновых кислот из тканей 42
2.2.1. Получение ДНК из ткани печени крыс 42
2.2.2. Получение тотальных ГНК из гепатомы Зайде ла крыс 43
2.3. Выделение нуклеиновых кислот из биологических жидкостей 44
2.3.1. Получение нуклеиновых кислот из асцитной жидкости опухолевого происхождения 44
2.3.2. Получение нуклеиновых кислот из сыворотки крови 43
2.4. Определение дезоксирибози ДНК по методу Бар-тона 46
2.5. Определение рибозы РНК орциновым методом 46
2.6. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности CsCl 47
2.7. Определение устойчивости высокомолекулярных нуклеиновых кислот сыворотки крови к действию ферментов 48
2.7.1. Обработка препаратов нуклеиновых кислот сыворотки крови ДНКазой 48
2.7.2. Обработка препаратов РНКазой 48
2.7.3. Обработка препаратов нуклеиновых кислот проназой 48
2.7.4. Определение устойчивости высокомолекулярных нуклеиновых кислот сыворотки крови к действию фосфодиэстеразы 49
2.7.5. Определение чувствительности нуклеиновых кислот сыворотки крови к щелочному гидролизу 49
2.8. Аналитический электрофорез в ном ПАХ 49
2.9. Окраска электрофореграмм "stain all", 51
2.10. Аналитический электрофорез в агарозе 51
2.11. Выделение высокомолекулярных ДНК из Одного агарозного геля методом электроэлюции 53
2.12. Рестрикционный анализ высокомолекулярных ДНК биологических жидкостей 53
2.13. Спиртовая хроматография препарата нуклеиновых кислот 54
2.14. Метод ник-трансляции высокополимерных ДНК с использованием 32pdH 55
2.15. Гибридизация высокомолекулярных ДНК сыворотки крови крыс при большом избытке клеточной ДНК в растворе
2.16. Гибридизация нуклеиновых кислот по методу Саузерна (блот-гибридизация) 57
2.17. Определение формы высокомолекулярной ДНК сыворотки крови с помощью электронной микроскопии (Miller et al.,1978) 59
2.18. Методы очистки некоторых реактивов 59
2.18.1. Очистка этанола . .59
2.18.2. Очистка хлороформа 59
2.18.3. Перекристаллизация акриламида .59
2.18.4. Перекристаллизация бисакриламида
2.19. Реактивы,использовавшиеся в работе 61
Глава 3. Результаты собственных исследований 62
3.1. Нуклеиновые кислоты сыворотки крови здоровых крыс 62
3.1.1. Особенности нуклеиновых кислот сыворотки крови крыс по данным спектрофотометрии 3.1.2. Оценка величины потери нуклеиновых кислот в процессе выделения из сыворотки крови 65
3.1.3. Соотношение ДНК и РНК в сыворотке крови крыс 66
3.1.4. Фракционный состав нуклеиновых кислот сыворотки крови 67
3.1.5. Одноцепочечная структура РНК сыворотки крови 78
3.1.6. Осаждаемостъ РНК сыворотки крови при центрифугировании в градиенте плотности CsCi. 78
3.1.7. Генетическая уникальность наиболее высокомолекулярных ДНК (17 и 20 МД) сыворотки крови крыс 81
3.1.8. Фрагментация 20 и 17 МД ЩК сыворотки крови крыс реотриктазой Kpn I 84
3.1.9. Электронно-микроскопическое выявление вы-сокополимерной ДНК в сыворотке крови крыс 84
3.2. Нуклеиновые кислоты сыворотки крови крыс с опухолями 89
3.2.1. Спектрофотометрические особенности нуклеиновых кислот сыворотки крови крыс с ге-патомой Зайдела 89
3.2.2. Изменение соотношения отдельных фракций высокополимерных ДНК в сыворотке крови крыс с гепатомой Зайдела и в асцитной жидкости 90
3.2.3. Стабильность спектра низкомолекулярных РНК сыворотки крови при гепатоме Зайдела 93
3.2.4. Спектр низкомолекулярных нуклеиновых кислот асцитной жидкости гепатомы Зайдела 97
3.2.5. Сходство и отличия спектра нуклеиновых кислот асцитной жидкости у онкологических больных и экспериментальных животных с гепатомой Зайдела 98
Обсуадение результатов . 105
Выводы 116
Список литературы 118
- Нуклеиновые кислоты сыворотки крови в норме и при различных патологиях
- Аналитический электрофорез в агарозе
- Осаждаемостъ РНК сыворотки крови при центрифугировании в градиенте плотности CsCi.
- Изменение соотношения отдельных фракций высокополимерных ДНК в сыворотке крови крыс с гепатомой Зайдела и в асцитной жидкости
Введение к работе
Актуальность исследования. Роль нуклеиновых кислот в хранении и передаче наследственных свойств клеток,в программировании структуры белков и таким образом определении их функциональной специфики в наши дни общепризнана. Новейшие достижения молекулярной биологии,однако,убеждают,что эти ключевые элементы жизни при известных обстоятельствах могут играть и негативную роль,порождая в результате минимальных изменений структуры отдельных клеточных генов,управляющих в норме дифференциацией и развитием,канцерогенные факторы-онкогены.
Указанные события развиваются на уровне клетки,её генома. Однако их побудительные импульсы имеют экстрацеллюлярную природу, поступают извне,из окружающей среды. С этой точки зрения кровь,омывающая ткани и клетки,представляет первостепенный интерес и как возможный источник упомянутых инициирующих малигниза-цию агентов,и как среда,содержащая продукты неопластического процесса.
Между тем,сравнительно мало внимания в этом плане до настоящего времени уделялось анализу такой ткани,как кровь,сыворотка крови,которую можно рассматривать как интегральный метаболический резервуар организма,суммарно отражающий ассимилятор-но-диссимиляторный баланс целостного организма. В то же время, в литературе накапливаются данные,свидетельствующие о сложном спектре нуклеиновых кислот бесклеточной части крови,происхождение и функциональное назначение которых не только при патологических состояниях,но и в норме остаются все ещё неясными. Являются ли они лишь конечными продуктами обмена,предназначений-
ми на выброс,или играют какую-то биологическую роль.
Показано, что содержание нуклеиновых кислот в сыворотке крови млекопитающих, в том числе и человека,невелико и составляет около 0,5-1 мкг/мл РНК ( Сох and Gokcen,1977)> а ДДК -около 0,01 мкг/мл ( Dennin,1979).
Лучше изучены нуклеиновые кислоты,продуцируемые in vitro лимфоцитами или эмбриональными клетками ( Anker et ai.,1972,1975, Dieterhorst,1976,Jacherts et ai#/l97^B случае выделения нуклеиновых кислот лимфоцитами довольно хорошо обоснована их необходимость в переносе иммунной информации (Jacherts,1979)« Выделение нуклеиновых кислот эмбриональными тканями и органами может быть необходимым для координации внутригеномных перестроек в процессе дифференцировки. Получение экспериментальных результатов о природе и изменениях спектра нуклеиновых кислот биологических жидкостей при росте опухоли представляется важным для понимания причин и механизмов взаимодействия опухоли и организма. Анализ изменений фракционного состава сыворотки крови при раке является актуальным ещё и потому, что повышение содержания ДНК в сыворотке крови предложено использовать как диагностический тест на наличие опухолей при ряде их локализаций (Shapiro et ai.,1985). Эти данные могут быть также полезны для выяснения механизма переноса генетической информации между клетками в норме и при неопухолевой патологии.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение высоко - и низкомолекулярных нуклеиновых кислот ( ДНК и РНК ) в сыворотке крови и асцитной жидкости при экспериментальных перевивных опухолях у крыс и мышей, а также у больных опухолями яичников. В связи с указанной целью были поставлены следующие задачи:
Дать количественную и физико-химическую характеристику нуклеиновых кислот сыворотки крови и асцитной жидкости у экспериментальных животных с опухолями и у онкологических больных.
Охарактеризовать электрофоретически фракционный состав нуклеиновых кислот сыворотки крови крыс в норме и при гепатоме Зайдела, а также опухолевой асцитной жидкости.
Осуществить молекулярно-генетический анализ нуклеиновых кислот сыворотки крови крыс с помощью рестрикционных нуклеаз, гибридизации, а также электронной микроскопии и других современных методов.
Научная новизна. Впервые дана подробная физико-химическая и молекулярно-биологическая характеристика нуклеиновых кислот сыворотки крови животных с некоторыми экспериментальными опухолями и онкологических больных опухолями яичников, а также выявлены изменения в спектре нуклеиновых кислот биологических жидкостей при опухолях. Показано, что содержание нуклеиновых кислот в сыворотке крови крыс составляет 1,0-2 мкг/мл. Выявлен сложный фракционный состав нуклеиновых кислот сыворотки крови человека и крыс. В сыворотке крови доноров и интактных животных содержатся две гомогенные по электрофоретической подвижности высокомолекулярные ДНК с мол.массой 20 и 17 мегадальтон (МД), составляющие около 1% тотального препарата ДНК. Кроме того, обнаружена геторогенная область с мол.массой от 2 до 15 МД. Рест-рикционный анализ показал наличие гомогенных последовательностей
в наиболее высокомолекулярных фракциях ДНК сыворотки крови. С помощью молекулярной гибридизации были выявлены два типа последовательностей в 17 и 20 Щ ДНК: уникальные и повторяющиеся.
Наряду с ДНК, в сыворотке крови содержатся 5 фракций низко-
молекулярной РНК с константой седиментации 8-I0S . Эти РНК составляют более Э0% препарата. Наличие выраженного подобия фракционного состава нуклеиновых кислот биологических жидкостей у человека и ряда животных говорит об их какой-то жизненно-важной функции. При опухолях содержание ДНК в сыворотке крови увеличивается. Спектр низкомолекулярных РНК остается стабильным и при опухолевой патологии.
Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы заключается в установлении впервые детального спектра и получении физико-химических характеристик фракций РНК и ДНК в сыворотке крови и асцитных жидкостях человека, а также крыс - носителей опухолей ( гепатома Зайдела, асцитная карцинома Эрлиха). .
Показано отличие по ряду энзимо-химических параметров РНК сыворотки крови от низкомолекулярных ядерных РНК клеток.
Получены данные в пользу стабильности фракционного состава РНК сыворотки крови в жизнедеятельности животных в норме и при опухолях и нарушении фракционного состава ДНК.
Эти экспериментально-теоретические результаты могут в перспективе при дальнейшей разработке послужить рациональной основой возможного диагностического теста на рак и способом прослеживания динамики онкологического процесса и хода лечения, тем более, что для этих целей уже предложено определять тотальное содержание ДНК при различных опухолях в сыворотке крови.
Практическое значение работы заключается в том, что обнаруженное при опухолях изменение соотношения 17 и 20 МД ДНК в сторону увеличения 20 МД ДНК может составить теоретическую основу для разработки метода отбора групп с повышенной вероятно-
- II -
стью присутствия опухоли при массовых обследованиях населения. Полученные в работе данные об изменении спектра нуклеиновых кис~ лот асцитной жидкости при раке могут быть полезны при разработке дифференциальной диагностики асцитов опухолевого и застойного происхождения.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, раздела собственных данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включает 9 таблиц и 21 рисунок. Список цитируемой литературы включает 140 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.
Апробация диссертации. Апробация диссертации проведена на совместной научной конференции лаборатории биохимии, экспериментальных опухолей, эндокринологии, химических канцерогенных агентов, экспериментальной и клинической онкоиммунологии, экспериментальной терапии НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова Минздрава СССР 21 марта 1984 г. Материалы диссертации докладывались на научной конференции лаборатории биохимии, в лаборатории химии белка Ленинградского государственного университета им.А.А.Жданова, Ленинград 1975 г., на заседании Ленинградского отделения Всесоюзного биохимического общества, Ленинград 1982 г., на конференции молодых ученых НИИ онкологии им.проф. Н.Н.Петрова Минздрава СССР, Ленинград 1978 г., на У Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию биологически активных веществ, Рига 1983 г.
Нуклеиновые кислоты сыворотки крови в норме и при различных патологиях
Попытки определения нуклеиновых кислот в плазме и сыворотке крови здоровых людей и животных предпринимались в 50-х-бО-х годах. Предполагалось, что определение нуклеиновых кислот в плазме или сыворотке крови может быть полезным в диагностике целого ряда заболеваний. Так Kechenberger (1957) исследовал содержание JQHK и РНК в плазме и сыворотке крови здоровых доноров и лиц с различными заболеваниями ( табл.1). По его данным, полученным с использованием метода Шмидта-Тангаузера, в жидкой части крови содержится большое количество ДНК и РНК, которое меняется при различных заболеваниях (табл.1). Использование других методов прямого определения содержания ДНК и РНК в плазме или сыворотке крови также показало очень высокое содержание нуклеиновых кислот (Казначеев В.П. и Поляков Я.В. 1967, Абдурахманов Б.А. и Каинова А.С. 1979, Волкова З.И.І979, Зелинский СИ. 1980, Фетисова Т.В. и Нилердинова Л.И. 1980, del 1948,lTeimer 194-9,Difilippo 1956,Lomanto 1967,Kamm 1972). Этими авторами найдены изменения в содержании ДНК или РНК в сыворотке и плазме крови человека при большом числе заболеваний. Тем не менее, столь высокое содержание ДБК и РНК в плазме крови трудно объяснить (данные различных авторов приведены в таблице 2 ). Было сделано предположение, что использованные методы прямого определения нуклеиновых кислот в плазме и сыворотке крови являются неадекватными и завышены за счет реакции с какими-либо другими веществами в крови. c.R.Steimnan (1975а) для определения ДНК в сыворотке и плазме крови модифицировал ранее применявшиеся методы. Он определял содержание ДНК по изменению реакции с дифениламином, этидий бромидом и методом РНК-ДНК гибридизации. Автор использовал также метод встречного им-муноэлектрофореза. Выполненная работа показала, что содержание ДНК в плазме крови здоровых доноров ниже чувствительности использованных методов, то есть ниже 0,6 мкг/мл, а использованные ранее прямые методы определения ДНК в плазме или сыворотке крови ( см.табл.2,1-ый раздел) непригодны для этой цели. Используя более специфичные методы определения содержания ДЖ за счет применения антител против этой нуклеиновой кислоты удалось выяснить, что содержание ДЖ в плазме крови человека по крайней мере менее 0,5 мкг/мл ( табл.2). Попытки определения ДНК в плазме, полученной при обработке крови раствором ЭДТА-натрия показала отсутствие в ней ДЕК или присутствие в количестве, ниже чувствительности метода встречного иммуноэлектрофореза,то есть менее 0,5 мкг/мл. Электронномикроскопическим определением ДНК в плазме крови, полученной с использованием ЭДТА-натрия, найдено, что её содержание составляет около 0,01 мкг/мл (Dennin,1979). Было высказано предположение, что ДНК в жидкой части крови отсутствует, а обнаружение её в сыворотке крови связано с гибелью ядерных клеток в сгустке при свертывании крови и выходом ДНК ИЗ ЭТИХ клеток ( Davis and Davis, 1973,Steinman, 1975 a,b). Аналогичные результаты были получены при сопоставлении содержания ДНК в сыворотке и обработанной гепарином плазме крови хомяков (0,124 и 0,141 мкг/мл).
Аналитический электрофорез в агарозе
При проведении электрофореза препаратов нуклеиновых кислот в агарозном геле в трубках использовали аппарат для вертикального электрофореза / Reanai ,Венгрия/. Агарозный гель готовили перед ОПЫТОМ как описано ( Hozumi and Tonegawa, 1976). 2 г агарозы / Sigma,electrophoresis,grade США./ растворяли в 100 мл бидистиллированной воды в кипящей водяной бане. Затем сливали 25 мл горячего раствора агарозы с 30 мл 2-х-кратного трис-ацетатного буфера, содержащего 0,04 М трис-НС1, 0,04 М уксусно-кислого натрия, 0,002 М ЭДТА, доведенного уксусной кислотой до рН 7,7. Буфер перед употреблением подогревали до 40 60С. После застывания агарозного геля в трубках верхний его край частично выбивали и обрезали бритвой. Таким образом удаляли мениск и доводили длину геля до 85 мм. Трубки переворачивали так, чтобы нижний неповрежденный конец становился верхним. лТрубки закрывали в нижней камере батистовыми колпачками для того, чтобы гель не выскользал из трубки. Затем в верхнюю и нижнюю камеры заливали трис-ацетатный буфер, рН 7,7, содержащий 0,02 М трис-НС1, 0,02 М уксусно-киелого натрия и 0,001 М ЭДТА. Препараты наносили на гель в объеме 0,1 мл, смешивая их в соотношении 3:1 с 0,1%-ным раствором бром фенолового синего в 40%-ной сахарозе.
Для регистрации результатов электрофореза агарозные гели после разделения нуклеиновых кислот выдерживали в течение 30-60 мин в растворе бромистого этидия (2 мкг/мл), промывали дистиллированной водой и фотографировали освещая их ультрахеми-скопом Брумберга, содержащем фильтры УФС-І. На объектив фотоаппарата помещали красный светофильтр КС-2. Использовали пленку 65 единиц, выдержку 60-180 с при диафрагме 3,5. В некоторых случаях для количественной оценки соотношения фракций ДНК в геле проводили денситометрию : негативов на денситометре хромо-скан-3, обладающим высокой разрешающей способностью и чувствительностью. Програмировали его работу в режиме отсечения фона пленки и фона чистого участка геля.
Для установления молекулярной массы (мол.массы) высокомолекулярных компонентов в препарате нуклеиновых кислот сыворотки крови использовали в качестве маркеров ДНК фага л и её фрагменты. Фрагменты ДНК фага я. получали обработкой этой ДНК ре-стриктазой Крп I или EcoR І (Таняшин В.И. ,1979). Готовые фрагменты смешивали с препаратом нуклеиновых кислот сыворотки крови и подвергали коэлектрофорезу в одной трубке. Строили график зависимости электрофоретической подвижноети маркерных фрагментов ДЖ в зависимости от мол.массы и с его помощью расчитывали по подвижности мол.массу фракций ДНК сыворотки интактных крыс или крыс с гепатомой Зайдела. В некоторых случаях вертикальный электрофорез проводили в плоском блоке геля.
Учитывая необходимость получения чистых препаратов отдельных фракций ДНК для рестрикционного анализа, участки геля,содержащие интересующие фракции ДНК, вырезали из столбика геля после электрофореза и подвергали электроэлюции. Для этого вырезанный после электрофореза ДНК участок геля помещали в аппарат для горизонтального электрофореза в пластине геля в соответствующую лунку блока 0,85%-ной агарозы. На расстоянии 5-7 мм от лунки по ходу движения ДНК при электрофорезе вырезали ещё одну канавку, движение фракции в пластине геля контролировали в ультрафиолете по свечению в комплексе с бромистым этиди-ем. Отсасывали ДНК из канавки І раз в минуту 5-6 раз, пока вся ДНК не выходила в буфер. Полученную ДНК переосаждали спиртом и использовали для рестрикционного анализа или радиоактивного мечения.
Рестрикционный анализ высокомолекулярных ДНК биологических жидкостей Для установления генетической сложности 17 и 20 МД ДНК сыворотки крови после отделения от других фракций нуклеиновых кислот её подвергали рестрикционному анализу с рестриктазами Крп I и EcoR I. К 2-3 мкг ДНК добавляли 10-15 единиц активности рестриктазы. Инкубировали смесь в 50 мкл буфера 2-3 часа при 37с и подвергали электрофорезу в 0,85-ной агарозе, используя в качестве маркеров известной величины фрагменты ДНК фага д. , полученные с помощью рестриктазы Крп і и EcoR I (Таняшин В.И.,1979). Буфер для действия рестриктазы Крп I и EcoR I содержал 10 тю лей трис-НСІ рН 7,5; 100 мло лей ИаСі (їїасі в буфер для действия рестриктазы Крп і не добавляли), 10 ммолей і%сі2 ; 7 ммолей 2-меркаптоэтанола и 0,1 мг/мл автоклавированной желатины. Для выявления в препарате нуклеиновых кислот сыворотки крови крыс присутствия двухцепочечной РНК использовали метод спиртовой хроматографии на колонке с целлюлозой (Robertson and Hunter, 1975). Колонку размером 1x6 см заполняли микрокристаллической целлюлозой ( Piitrak, ГДР). Целлюлозу предварительно обрабатывали 2 М їїаон далее промывали на воронке Бюхне-ра деионизованной водой до нейтрального значения рН среды. Затем промывали целлюлозу перегнанным этиловым спиртом, нагретым до 50С в соотношении 20:1 (этанолщеллюлоза). Обработанную таким образом целлюлозу подсушивали сначала на воздухе, а затем в ваккуумном шкафу и хранили в склянке с притертой пробкой. При заполнении хроматографической колонки целлюлозу смешивали с буферным раствором, содержащим 35% этанола и вносили в колонку. Затем промывали буфером ТНЭ (0,1 М Naci ,0,05 М трис-НСІ рН 7,3 и I мМ ЭДТА-На2 ) до оптической плотности раствора при 260 нм, не превышающей 0,05 0Е. Далее колонку снова промывали ТНЭ-буфером с добавлением 35% этанола. На колонку наносили препарат растворенный в ТНЭ-буфере с 36% этанола и регистрировали оптическое поглощение, несвязавшейся фракции,затем промывали колонку ТНЭ-буфером с добавлением 15% этанола, наконец, двухце-почечную РНК элюировали чистым ТНЭ-буфером. В качестве контроля проводили хроматографию ДНК фага д и двухцепочечной РНК фага fi-2.
Осаждаемостъ РНК сыворотки крови при центрифугировании в градиенте плотности CsCi.
Выделение нуклеиновых кислот опухолевыми клетками должно нарушать нормальное соотношение отдельных фракций нуклеиновых кислот в биологических жидкостях у животных, в частности в сыворотке крови. Действительно, некоторые авторы находили повышение содержания ДНК в сыворотке крови онкологических больных. В настоящем исследовании были проанализированы изменения в содержании и составе нуклеиновых кислот сыворотки крови крыс с гепатомой Зайдела. Спектрофотометрия препарата нуклеиновых кислот сыворотки в ультрафиолетовой области показала, что выход материала, поглощающего ультрафиолет при я 260 нм, не отличается достоверно у опухолевых и контрольных животных (табл.7). Соотношение оптического поглощения препарата при длине волны я 260 нм, 230 нм, 280 нм также не отличается от контроля (табл.7). Из 100 мл свежеприготовленной сыворотки крови крыс с гепатомой Зайдела получали около 2 оптических единиц (0Е) препарата ( Я =260 нм)(в I мл 0), практически столько же, как и в сыворотке крови интактных крыс. Как и в случае препарата, получаемого из сыворотки здоровых животных, нуклеиновые кислоты сыворотки крови опухолевых крыс, имели примеси, снижающие соотношение оптического поглоще 260 260 ния при длине волны л нм и Л нм до величины 230 280 1,45 0,05 и 1,65 0,05 соответственно. и в асцитной жидкости опухоли Учитывая, что основную массу нуклеиновых кислот биологических жидкостей составляет РНК, мы могли при изучении суммарных препаратов нуклеиновых кислот не выявить различия в содержании ДНК. Однако, повышение содержания ДНК в сыворотке крови крыс было показано полуколичественно другим методом. При нанесении на 0,85 -ный агарозный гель 2 ОЕ препарата нуклеиновых кислот из сыворотки здоровых крыс в одну лунку и 2 ОЕ препарата из сыворотки крови крыс с гепатомой Зайдела в соседнюю лунку и последующем электрофорезе было установлено, что препарат крыс с опухолями имеет большее количество ДНК, особенно в зоне мол.массы 2-15 мегадальтон. Для количественной оценки содержания отдельных фракций ДНК сыворотки крови в соседние лунки вносили 0,1; 0,2; 0,5 и I мкг ДНК фага д и сопоставляли её флюоресценцию с флюоресценцией исследуемых фракций ДНК. Было показано, что при нанесении образца препарата нуклеиновых кислот сыворотки крови крыс с гепатомой Зайдела содержание 20 ВД ДНК было выше по сравнению с контролем, а содержание 17 МД ДНК не увеличивалось. Менялось соотношение 17 МД и 20 ВД ДНК. Так, в контрольном препарате 17 МД ДНК резко преобладало над 20 ВД ДНК (рис.16), а у крыс с гепатомой Зайдела 20 МД количественно преобладала над 17 ВД ДНК. Флюоресценция 20 МД ДНК была промежуточной между свечением 0,1 мкг и 0,2 мкг ДНК фага Л , а флюоресценция 17 ВД ДДК почти достигала таковой при нанесении I мкг ДНК фага д . Таким образом, в норме 17 ВД ДНК и 20 ВД ДНК суммарно могли составлять около 1% препарата нуклеиновых кислот. При опухолях их содержание было несколько больше, так как при нанесении 2 0Е препарата (100 мкг) флюоресценция 20 ВД ДНК была чуть больше, чем для I мкг ДНК фага а . Точную количественную оценку фракции ДНК с мол. массой 2-15 мегадальтон произвести не удалось. Однако, по интенсивности флюоресценции с бромистым этидием в препарате сыворотки крови крыс с гепатомой Зайдела её было в 2-3 раза больше,чем в контрольных препаратах. Сравнивая флюоресценцию 2-15 ВД ДНК с таковой для рестрикционных ( EcoR і ) фрагментов ДНК печени крыс, можно сказать, что в норме содержание этой фракции ДНК составляет не более 2-5 мкг в каадом образце ( то есть не более 2-5$ в препарате ), а при опухолях - не более 5-Ю мкг в каадом образце ( то есть не более 5-10$ в препарате). Прямое определение содержания в препаратах дезоксирибози не производилось,так как небольшое количество препаратов исключало эту возможность» Был проанализирован препарат нуклеиновых кислот из асцитной жидкости гепатомы Зайдела крыс и опухоли Эрлиха мышей. Показано, что в асцитной жидкости присутствует 20 МД ДНК, но почти отсутствует 17 МД ДНК, а также выявляется фракция 2-15 ГДД ДНК. Таким образом, при гепатоме у крыс имеет место нарушение соотношения 17 и 20 МД ДНК в сторону увеличения последней. Можно думать, что в норме 17 МД ДПК образуется из 20 МД ДДК, однако, нуклеаза, ответственная за это превращение снижает свою активность при опухолях. Во всяком случае, различие в соотношении 17 МД и 20 МД ДНК сыворотки крови в норме и при гепатоме Зайдела позволяет рекомендовать изучить это явление у онкологических больных с целью разработки диагностического теста в дополнение к диагностике опухолей по повышенному содержанию ДНК в крови, предлагаемой в настоящее время Leon et ai.,E98I, Shapiro et ai., 1983. Как известности авторы обнаружили повышенное содержание ДНК при различных формах опухолей в крови онкологических больных, по сравнению со здоровыми донорами.
Изменение соотношения отдельных фракций высокополимерных ДНК в сыворотке крови крыс с гепатомой Зайдела и в асцитной жидкости
Ранее ( Burton et ai.,1968 ) предположил, что ДНК бесклеточной части крови происходит за счет сброса ДНК в ходе превращения эритробластов в эритроциты. Однако, как свидетельствуют данные молекулярной гибридизации, представленные в настоящей работе, кинетика гибридизации (реассоциации) с геномной ДНК отличается от таковой при реассоциации геномной ДНК. Это отвергает предположение Burton et ai.,1968. Недавно В.К. Васильевым (1984) показано, что включение радиоактивных предшественников в ДНК сыворотки крови крыс отличается от включения в ДНК тканей. По всей видимости, между синтезом в каких-то клетках и выбросом сывороточной (плазменной) ДНК существует разрыв около 48 или более часов, как это характерно и для других ДНК-экскре-тирующихся клетками в культуральную или асцитную жидкости. В.К.Васильевым (1984) предполагается блочное встраивание ДНК сыворотки ( плазмы ) в клетки реципиенты и участие в геномных перестройках.
Высокополимерная ДНК,находящаяся в биологических жидкостях возможно выделяется лимфоцитами,так как по данным молекулярной гибридизации,она соответствует уникальному компоненту ДНК, выделяющейся лимфоцитами ( Distelhorst, 1978). Гибридизация препарата 17 и 20 Щ ДНК сыворотки крови крыс с геномной ДНК (печень крыс) в растворе показала, что в этих условиях гибридизуется менее 10$ исследуемой ДНК. Это свидетельствует о наличие большой доли уникальных или отсутствующих в геноме клеток нуклеотидных последовательностей и является одним из важнейших аргументов против происхождения 17 и 20 МД ДНК за счет неспецифической гибели клеток. Другая "разновидность метода молекулярной гибридизации, использованная в работе-блот-гибридизация показала возможность гибридизации 17 и 20 МД ДНК с большим числом фрагментов ДНК.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что гибридизующаяся в наших условиях часть последовательностей ДНК относится к повторяющимся, которые часто встречаются в геноме, а строение 17 и 20 МД ДНК можно представить как композицию, включающую около 10% повторяющихся последовательностей, а остальное - уникальных. Для проверки, является ли уникальная часть 17 и 20 МД ДНК гомогенной по нуклеотидным последовательное тягл или представляет гетерогенный набор уникальных последовательностей, был проведен их анализ с помощью рест-риктазы крп I , которая расщепляет ДНК в точках, содержащих специфический гексануклеотид.
Известно, что выделяемая лимфоцитами ДНК способна перено- :; сить иммунную информацию на синтез специфических антител (ja-chertz, 1979). Возможно, что и ДНК сыворотки крови выполняет ту же функцию. Наличие гомологичных последовательностей выявленных обработкой рестриктазой Крп і достаточно большой размер двух высокополимерных (17 и 20 МД ДНК) фракций ДНК сыворотки крови позволяет предположить, что они могут быть плазмидоподобными элементами или генетическими векторами высших организмов.
Сложный фракционный состав нуклеиновых кислот биологических жидкостей, с одной стороны, а также литературные данные об изменениях содержания ДНК в сыворотке крови при ряде заболеваний, с другой, указывали на необходимость изучить фракционный состав нуклеиновых кислот сыворотки крови крыс при развитии опухоли.
Анализ нуклеиновых кислот сыворотки крови крыс с гепато-мой Зайдела позволил заключить, что спектр низкомолекулярных РНК в сыворотке очень устойчив и не изменяется при этом состоянии. Лишь в предагональном периоде в сыворотке крови крыс с гепатомой Зайдела появлялась группа фракций РНК, вероятно, вследствие большого числа погибших опухолевых клеток в этот период. С другой стороны, низкомолекулярная ДНК (ДНК нуклеинового фактора длиною 165-175 пар нуклеотидов) находилась только в асцитной жидкости и могла быть обнаружена в кровотоке только после повреждения защитной функции печени отравлением четыреххлористым углеродом. Низкомолекулярная ДНК нуклеинового фактора не обнаруживалась в крови при отравлении четыреххлористым углеродом неопухолевых животных. ДНК нуклеинового фактора выявляли и не во всех группах крыс получавших четы-реххлористый углерод. Так, из 6-ти групп крыс с гепатомой Зайдела, предварительно в течение месяца подвергшихся воздействию четыреххлористого углерода, только в 2-х группах в сыворотку крови из асцита переходил нуклеиновый фактор.
Учитывая, что ДНК нуклеинового фактора обладает иммуноде-прессивным действием (Белохвостов А.С, 1978), задержка фактора печенью могла бы предотвращать общую иммунодепрессию при раке.
Тем не менее, более интересным представлялось изучение высокополимерных ДНК в сыворотке крови при развитии опухоли, так как повышение их содержания, установленное рядом авторов ( Leon et al.,1981,1982, Nakasaki et al., 1981, Shapiro et al., 198$ ) , могло быть связано с влиянием нуклеинового фактора опухолей, нарушающего какую-то функцию высокомолекулярных ДНК бесклеточной части крови (Белохвостов А.С. и Войтенков Б.О., 1983).
В отличие от низкомолекулярных нуклеиновых кислот, высокомолекулярные ДНК в сыворотке крови крыс с гепатомой Зайдела изменялись. Так, с помощью электрофореза в агарозе в данной работе показано увеличение содержания ДНК при этой патологии и изменение соотношения отдельных фракций. Если у здоровых крыс 17 МД ДНК преобладает над 20 Щ ДНК, то в сыворотке крови крыс с гепатомой Зайдела преобладает 20 МД ДНК, Ещё более резко выражены изменения в асцитной жидкости гепатомы Зайдела непосредственно омывающей опухолевые клетки, где наблюдали наоборот преобладание 20 Щ ДНК над 17 МД ДНК, Это позволило сделать предположение, что при раке нарушается переход 20 МД ДНК в 17 МД ДНК, тем более, что эти ДНК, как показал рестрикционный анализ с эндонуклеазой рестрикции крп і , имеют общую протяженную последовательность. Подавление перехода 20 МД ДНК в 17 МД ДНК осуществляется вероятно каким-то веществом (веществами) опухолевого происхождения, обладающим свойствами ингибитора нуклеаз.
