Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современные представления о генетике рака толстой кишки 11
ГЛАВА II. Материалы и методы 41
2.1 Методы генетического анализа 42
2.2 Методы молекулярно-генетических исследований 45
ГЛАВА III. Клинико-генеалогические и генетико-математические исследования рака толстой кишки 53
3.1 Распространенность рака толстой кишки 53
3.2 Сравнительная характеристика семейного фона при раке толстой кишки, синдромах Lynch I-II и ПМЗН 55
3. Генетический анализ рака толстой кишки 64
3.4 Гетерогенность РТК и идентификация его наследственных форм 69
ГЛАВА IV. Поиск молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с риском развития РТК 87
4.1 Ассоциации полиморфных вариантов генов-супрессоров OGG1, MSH3, MSH6, MLH1 с риском развития рака кишечника у человека 88
4.2 Ассоциации генов TS, GSTM1 с риском развития спорадической формы рака кишечника у человека 99
4.3 Анализ соматических мутаций гена K-Ras в аденокарциномах и аденомах толстой кишки 104
ГЛАВА V. Медико-генетическое консультирование в семьях больных раком толстой кишки
5.1 Скрининг в семьях больных РТК 119
5.2 Регистр раковых семей - раздел РТК 133
7. Заключение 135
8. Выводы 145
9. Список литературы
- Современные представления о генетике рака толстой кишки
- Распространенность рака толстой кишки
- Ассоциации полиморфных вариантов генов-супрессоров OGG1, MSH3, MSH6, MLH1 с риском развития рака кишечника у человека
- Скрининг в семьях больных РТК
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Современные достижения клинической и молекулярной генетики способствуют изучению проблемы наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям и дают возможность более глубокому проникновению в биологическую сущность опухолевых заболеваний, изучению механизмов их распространенности в популяции и в отдельных семьях. С практической точки зрения медико-генетические исследования создают основу для индивидуального прогнозирования в онкологических отягощенных семьях с целью семейной профилактики, основанной на создании регистра «групп риска» среди родственников пробандов, с последующим наблюдением за ними. Большинство распространенных онкологических заболеваний в генетическом отношении изучены недостаточно, а вопрос о соотносительной роли наследственных и внешнесредовых факторов в их развитии остается открытым.
Рак толстой кишки (РТК) является одним из самых распространенных злокачественных новообразований у человека. Значение проблемы РТК возрастает в связи с неуклонным ростом заболеваемости и смертности от данного заболевания в экономически развитых странах (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2004).
Раннюю диагностику рака толстой кишки до настоящего времени нельзя считать удовлетворительной, поскольку у каждого третьего на момент установления диагноза уже отмечается генерализация опухолевого процесса. Причиной сложившейся ситуации является низкая выявляемо сть на ранних этапах развития опухоли (Старинский В.В. И соавт., 2002).
В последнее десятилетие решение вопросов этиологии, патогенеза, ранней диагностики и профилактики опухолей во многом связывают с медико-генетическими исследованиями, направленными на изучение роли наследственной предрасположенности в развитии РТК, его генетической
гетерогенности и открытиями в области молекулярной генетики. Большая часть исследований посвящена практическим аспектам РТК, подходам к лечению и возможной профилактике. В настоящее время многими лабораториями мира картированы и клонированы сотни генов, вовлеченных в канцерогенез, многие из них представлены в популяциях человека десятками полиморфных вариантов. Исследования ведутся в трех основных направлениях: картирование и клонирование новых генов, комплексный анализ и ДНК-диагностика пациентов, разработка методов и подходов к генотерапии онкологических заболеваний (Залетаев Д.В., 2000). Однако, вопрос о причинах возникновения РТК и роли наследственных факторов в его развитии на сегодняшний день остается открытым. В последние годы появилось значительное количество работ (Aktan-Collan К et al., 2007; Fearnhead N. S. et al., 2002; Jo W.S. et al., 2005), указывающих на высокую значимость наследственных факторов в развитии заболевания. Кроме того, появилась возможность выявлять гены, мутации которых, ассоциированы с развитием РТК.
В многочисленных исследованиях показано, что 15-20% больных РТК имеют родственников первой степени родства с такой же патологией (Гарькавцева Р.Ф., Белев Н.Ф., 2001). Для родственников риск заболеть постепенно возрастает в зависимости от числа пораженных членов семьи, тяжести клинической картины и возраста проявления у них злокачественного новообразования.
Можно предположить, что генетически обусловленные формы РТК характеризуется существенной фенотипической неоднородностью. Основной целью на данном этапе исследований является не только изучение генетических механизмов наследственной предрасположенности к известным наследственным синдромам (семейный аденоматоз толстой кишки, синдром Гарднера, синдром Турко, синдром Пейтц-Егерса), но также исследование фено-генотипических связей наследственных форм РТК, и таких как
наследственный неполипозный рак толстой кишки, рак толстой кишки, возникающий на фоне наследственно обусловленного семейного полипоза толстой кишки. Отсутствие точных данных о генетических механизмах предрасположенности к РТК сдерживает развитие теоретически обоснованной медико-генетической консультации и ее практических перспектив -разработку ранней диагностики, своевременного лечения, профилактики и активной диспансеризации членов семей с высоким риском развития аналогичного заболевания.
Исследования в области молекулярной онкопроктологии направлены на определение структурных и функциональных изменений генов, которые могут служить специфическими маркерами, регистрируемыми при различных формах РТК. На сегодняшний день генетическая основа возникновения РТК хорошо описана только для двух видов колоректального рака: семейного аденоматозного полипоза и наследственного неполипозного рака толстой кишки. Для семейного аденоматозного полипоза проводится мониторинг терминальных мутаций гена АР С. Для диагностики наследственной неполипозной формы рака выявляют мутации генов MSH-2, MLH-1, контролирующих репарацию ДНК и стабильность генома. Однако данные синдромы соответствуют лишь 10% -15% от всех случаев колоректального рака (Lynch Н.Т. et al., 2000; Church J. et al., 2004).
Для остальных 65%-95% случаев (являющихся спорадическими) наследуемая составляющая, определенно вносящая вклад в развитие заболевания, пока охарактеризована в недостаточной степени (Lichtenstein et al., 2000). Тем не менее, вероятность возникновения ненаследственных форм рака толстой кишки у ближайших родственников пациентов с данным диагнозом больше, чем у других представителей той же популяции, что указывает на наличие минорных генетических компонент, определяющих предрасположенность ближайших родственников к данному заболеванию (Sharp L et al., 2000). Средства ДНК-диагностики спорадических вариантов
РТК пока не разработаны. В этой связи поиск и выявление ассоциаций данного заболевания с ранее не изученными полиморфными маркерами может иметь как теоретическую, так и клиническую ценность (Kablenberg M.S. Et al., 2003). Наиболее частыми нарушениями при РТК являются мутации в генах К-ras, GSTM1, TS, OGG1, MSH3, MSH6, MLHL Данные нарушения с определенной частотой регистрируются и на ранних стадиях туморогенеза — в полипах и мелких аденомах толстой кишки, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных маркеров для ранней диагностики. Кроме того, многочисленные исследования, проведенные за последние несколько лет, показали возможность выявления вышеперечисленных молекулярных изменений также и в биологических образцах (копрологических, биопсийных и образцах плазмы крови), полученных от больных РТК.
Все сказанное подтверждает необходимость проведения клинико-
генетических исследований РТК и разработку научно-обоснованных
рекомендаций для медико-генетического консультирования конкретных семей,
как одного из способов ранней диагностики и первичной профилактики РТК.
В связи с этим нам представлялось важным изучить частоту семейного
накопления РТК с целью оценки вклада наследственных факторов в их
возникновении, провести поиск маркеров наследственной
предрасположенности и попытаться выяснить возможную их этиологическую и генетическую гетерогенность. ЦЕЛЬ РАБОТЫ.
Оценка роли и характера наследственного предрасположения в развитии РТК и на этой основе разработка генетических подходов в комплексной диагностике, прогнозировании и профилактике этого заболевания. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Изучить характер и основные параметры семейного накопления рака толстой кишки, как в целом, так и при различных его вариантах с использованием методов генетико-математического анализа.
Выявить степень генетической обусловленности РТК путем оценки соотносительного вклада наследственных и средовых факторов в общую подверженность к развитию этого заболевания и провести проверку предположения о генетической общности РТК и опухолей других локализаций.
Установить структуру и соотношение генетически детерминированных форм РТК.
Определить значение молекулярно-генетических маркеров для ранней диагностики, прогнозирования и профилактики РТК:
популяционно-генетический анализ связи полиморфизма генов-супрессоров OGG1, MSH3, MSH6 и MLH1, относящихся к системе репарации генетических повреждений, с развитием спорадической формы рака кишки.
поиск и выявление полиморфизма генов TS, GSTM1 у больных раком толстой кишки.
анализ соматических мутаций гена K-Ras в аденокарциномах и аденомах толстой кишки;
5. Разработать систему эффективного прогнозирования развития РТК и
формирования «групп риска» для научно-обоснованного медико-
генетического консультирования семей с высокой предрасположенностью к
РТК.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
На основе комплексного клинико-генетического исследования
представлены степень и характер семейного отягощения при различных вариантах РТК, получены оценки соотносительного вклада наследственных и внешнесредовых факторов в развитии данного заболевания, таким образом определена степень генетической обусловленности РТК и его отдельных форм. Разработан комплексный подход, позволяющий идентифицировать наследственно детерминированные формы РТК, представлена их структура и соотношение. Выявлены спектры мутаций в гене K-Ras у больных с
аденокарциномами, доброкачественными и злокачественными полипами. Проведен поиск ассоциации определенных аллелей генов OGG1, MSH3, MSH6, MLH1, GSTM1 nTS с риском развития рака толстой кишки.
На основе применения различных методов оценки риска разработан дифференцированный подход к уточнению индивидуального развития заболевания у родственников больных РТК и сформулированы научно-обоснованные принципы медико-генетического консультирования при этом заболевании. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.
Систематизированные в результате проведенной работы исследования будут использованы для выявления наследственно обусловленных форм заболевания и лиц, имеющих с генетической точки зрения высокий риск развития РТК, что позволит сформировать регистр, включающий родственников, отнесенных к контингенту повышенного генетического риска развития РТК и организовать их клинический мониторинг с целью ранней диагностики и повышения эффективности медико-генетического консультирования семей, отягощенных РТК. Выявление генотипов, ассоциированных с высоким риском развития спорадической формы рака толстой кишки, позволяет осуществить раннюю диагностику предрасположенности к данной форме онкологического заболевания, а в дальнейшем, возможно, проведение необходимых профилактических мероприятий по предотвращению развития болезни. Этот подход может быть положен в основу выявления генетической предрасположенности к возникновению разных типов опухолей, что способствует снижению смертности от данных заболеваний. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (г. Киев, 2007г.), совместной научной конференции сотрудников НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.
По теме диссертации опубликовано 14 работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Диссертация иллюстрирована 21 рисунком и 33 таблицами. Список литературы включает 203 источника.
Современные представления о генетике рака толстой кишки
В последние десятилетие РТК становится все более актуальной проблемой клинической онкологии. Это обусловлено тем, что в большинстве экономически развитых стран мира уровень заболеваемости и имеет тенденцию к неуклонному увеличению этого показателя. В структуре онкологической заболеваемости в мире колоректальный рак в настоящее время занимает второе-третье место как у мужчин, так и у женщин (Wu J.S., Fario V.W., 2000). Ежегодно в мире диагностируется около 1 миллиона новых случаев РТК. Пятилетняя выживаемость при РТК составляет примерно 60% в развитых странах и менее 40% в государствах с ограниченными ресурсами (Boyle P. et al., 2002; Faivre J. et al., 2002).
В некоторых странах Западной Европы и Америки колоректальный рак переместился на второе место по частоте. В США ежегодно выявляется 130 000 новых случаев злокачественных новообразований толстой кишки. В Японии РТК занимает одно из первых мест среди всех локализаций рака (Solomon С.Н. et al., 2002).
За последние 20 лет РТК переместился в структуре онкологической заболеваемости населения Российской Федерации с 6-го на 3-е место. А с возрастом РТК смещается у мужчин на 2-е место, а у женщин на 1-е место (в возрастной группе 70 лет и старше). Тревожным является тот факт, что при первичном обращении пациентов к врачу запущенные формы рака (III-IV стадии) диагностируются у 71,4% больных раком ободочной кишки и у 62,4% в случаях заболевания раком прямой кишки (Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2004).
Средний возраст заболевших колоректальным раком в России 65-68 лет. Около 85% случаев колоректального рака приходится на возраст старше 55 лет (Papapolycbroniadis С, 2004). Но, несмотря на довольно четкое увеличение частоты РТК в старших возрастных группах, все чаще это заболевание диагностируют в молодом возрасте, особенно его наследственные формы.
Общепринято, что в развитии рака вообще и РТК, в частности, большую роль играют факторы внешней среды, выявление которых и на сегодняшний день продолжает оставаться насущной проблемой, стоящей перед современной медициной. Образ жизни и особенности диеты являются источниками важнейших факторов риска развития карциномы толстого кишечника. В большом числе эпидемиологических исследований показано, что заболеваемость раком толстой кишки выше в экономически развитых странах по сравнению с развивающимися (Аксель Е.М., Ушакова Т.И., 2001). Действие окружающей среды играет немаловажную роль в развитии спорадических форм рака. Несмотря на то, что воздействию канцерогенов подвергается вся популяция человека, возникновение опухолей происходит далеко не во всех случаях. Это связано с тем, что развитие рака обуславливается не только действием канцерогенов, но и функциональным состоянием генов, контролирующих процессы детоксикации этих канцерогенов, репарацию ДНК и апоптоз (Kotnis et al., 2005).
Для многих средовых факторов, для которых показаны ассоциации с увеличением риска РТК еще не ясны молекулярные механизмы их воздействия. Тем не менее, наиболее очевидной тенденцией является сочетанное исследование факторов среды, которым подвергается индивид, и генетический статус исследуемого. Исследования такого рода делают огромный вклад в выделение рисковых групп в популяции и служат основой для раскрытия молекулярных механизмов взаимодействия особи и среды. 1.2. Генетические аспекты рака толстой кишки. В последние годы появилось значительное количество работ (Белев Н.Ф. с сооавт., 2004; Fearnhead N. S. et all., 2002; Jo W.S. Et all, 2005), указывающих на высокую значимость наследственных факторов в развитии заболевания. Огромное количество факторов риска РТК, приводимых разными авторами, не позволяет точно оценить риск развития РТК у данного пациента, оценивая в конечном итоге, лишь общепопуляционный риск. Однако один фактор -наличие больных РТК родственников в семье — значительно повышает риск развития данного заболевания у пациента. В многочисленных исследованиях показано, что 15-20% больных колоректальным раком имеют родственников первой степени родства с такой же патологией (Белев Н.Ф. с соавт., 1999; Jarvinen H.J. et al., 2000; Lynh H.T. et all., 2000; Winaver S.J. et all., 1996). В то же время, ряд авторов приписывают большинству случаев РТК влияние средовых факторов, оставляя генетическим особенностям скромную роль.
История изучения роли наследственности в этиологии злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта, в частности, рака толстой кишки, охватывает почти столетие. О возможном наследственном характере накопления злокачественных опухолей в некоторых семьях впервые предложил Warthin А. в 1913г. Он описал 4 семьи, отягощенные раком желудочно-кишечного тракта, впервые ввел термин «раковая семья» и показал, что рак в таких семьях передается как простой доминантный признак. Однако в то время подобные сообщения относились к разряду казуистических, практически не вызывая интереса у исследователей. В 40-50-х годах количество публикаций, описавших случаи семейной агрегации рака, как одной и той же, так и разных анатомических локализаций, заметно увеличилось. Специальные медико-генетические исследования были длительны, поскольку требовали обширных выборок родословных и тщательного сбора клинико-генеалогической информации, весьма трудоемки и постепенны, в силу своей новизны. Сегодня эти исследования представляют неоценимый теоретический источник знаний о природе рака большинства анатомических локализаций, в том числе и опухолей толстой кишки.
В медико-генетических исследованиях 60-80-х годов были использованы три основных метода классического генетического анализа: клинико-генеалогический, популяционно-статистический и близнецовый. Сбор клинико-генеалогических данных в этих исследованиях проводился строго по нозологическому принципу, т.е. сведения о родословных собирались через больных (пробандов) той или иной формой рака. Анализ родословных основывался на сравнении частоты той же формы рака, что и у пробанда, с частотой той же самой формы рака в общей популяции или контрольной группе. Так было показано, что в семьях пробандов, пораженных раком толстой кишки, аналогичная форма рака встречается в 3-4 раза чаще, чем в популяции (Anderson D., 1980).
Исследования, проведенные Woolf С, 1955; Macklin М., 1960; Lovett Е, 1976, позволили предположить наличие наследственной предрасположенности к РТК у членов «раковых семей». Для выяснения природы накопления рака толстой кишки были предприняты разные подходы. Так, Woolf С, 1955 сравнивал уровень смертности от РТК среди родственников I степени родства с уровнем в контрольной группе, сходной с родственниками по месту жительства, расе, полу и возрасту. Из 763 смертельных случаев среди родственников у 26 был РТК, по сравнению с 8 в контрольной группе. Таким образом, у родственников I степени родства уровень смертности был в 3,2 раза выше, чем в контрольной группе. Число смертных случаев от других типов рака был одинаковым в обеих группах.
Macklin М, 1960 в США и Lovett Е., 1974 в Англии использовали другой подход. Они сравнивали заболеваемость РТК у родственников пробандов в зависимости от возрастных особенностей и пропорционально уровню смертности в популяции, исключая при этом больных с множественным и диффузным полипозом толстой кишки. Выявление увеличения риска возникновения РТК у родственников больных было различным (2,9 и 3,6 соответственно). Все эти исследования основывались на предположении, что РТК является генетически однородным заболеванием.
Распространенность рака толстой кишки
За период с 2001 по 2007 годы клинико-генеалогические сведения получены у 631 больных РТК. Среди пациентов мужчин было 271(42.9%), женщин - 360 (57.1%). Изучение семейного накопления проводилось в основном в двух группах пациентов, у которых все или хотя бы одна из опухолей локализовались в толстой кишке: I группа - 493 больных раком толстой кишки, II группа - 63 пациента с первично множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗН). Кроме того, отдельно рассмотрены семьи, в которых накопление злокачественных новообразований соответствовало критериям наследственного неполипозного колоректального рака (синдромы Lynch I и И) и семьи, в которых были идентифицированы наследственные полипозные синдромы.
Распределение пробандов по полу и возрасту приведено в таблице 4. Учитывая наличие межиндивидуальной изменчивости по возрасту проявления заболевания, нами проведен анализ возраста манифестации заболевания. У 58.5% пробандов, пораженных раком толстой кишки, заболевание развивалось в возрасте 50-69 лет (средний возраст 59.4±0.6). Средний возраст пробандов с первично-множественными злокачественными новообразованиями составил 57.8±1.7 лет, у 19% из них заболевание развилось в возрасте 40-49 лет. В семьях с синдромами Lynch-1 и Lynch- II средний возраст пробандов составил 55.3±3.4 лет, а у родственников этих пробандов развитие рака репродуктивных органов происходит несколько раньше 51.5±3.7 при РЯ (р 0.001), 53.2±8.5 при РТМ (р 0.05), 52.3±12.3 (р 0.05) при РЖ. У 68% пациентов с синдромом ННКРР злокачественные новообразования развиваются в возрасте 40-59 лет. Средний возраст развития заболевания у родственников пробандов из семей с ННКРР и ПМЗН составляет 51.5±3.7 год (в популяции - 57.5 лет). Важно отметить, что у 8 из 25 пробандов с синдромом Lynch І, у которых диагноз был установлен до 45 лет, у всех в семьях среди их родственников были выявлены более двух случаев (кроме пробанда) злокачественных новообразований. При этом ПМЗН у родственников развивались до 50 лет (49.7±2.0). Выявленная межиндивидуальная изменчивость по возрасту возникновения заболевания, возможно, определяется генетическими факторами. Различие в возрасте начала развития ПМЗН может также свидетельствовать о их возможной неоднородности.
Сравнительная характеристика семейного фона при раке толстой кишки, ПМЗН и синдроме ННКР. Цель проведения подобных исследований: понять некоторые аспекты предрасположенности к колоректальному раку и полинеоплазии. В связи с этим нам представлялось важным изучить частоту семейного накопления указанной патологии с целью оценки вклада наследственных факторов в их возникновении.
Необходимым этапом для проведения такого анализа является получение корректных оценок популяционных частот (распространенности) с учетом изменения риска в зависимости от возраста ("накопленный риск"). Для получения корректных оценок о частоте исследуемой патологии в анализируемых группах больных и их родственников проводилась коррекция на возраст (Larsson Т., Sjogren Т., 1954). Полученные оценки распространенности рака толстой кишки, ПМЗН и ряда злокачественных опухолей, возможно, патогенетически связанных с ними, представлены в таблице 5.
С целью изучения степени семейного отягощения злокачественными новообразованиями в семьях пробандов исследованы частота и характер их накопления среди родственников первой степени родства (таб. 6). Из 2569 родственников первой степени родства 493 больных раком толстой кишки у 544 (44.1 ±0.8%) были различные злокачественные и доброкачественные новообразования. Частота злокачественных новообразований среди родственников пациентов с ПМЗН составила 47.9±2.8%, а в семьях с синдромом ННКРР - 69.7±2.6% (р 0.001). Таблица 5. Распространенность злокачественных новообразований (РТК, первично множественных злокачественных новообразований и репродуктивных органов у женщин) в г. Москве.
При вычислении частоты злокачественных новообразований общее число индивидов среди населения корригировалось на возраст по Т. Larsson, Т. Sjogren (1954).
Сравнительный анализ частоты накопления злокачественных новообразований среди родственников первой степени родства показал, что она достаточно высока во всех выделенных группах пробандов и колеблется от 34.8±8.3% в семьях с синдромом Lynch-I до 47.9±2.8 - в семьях больных ПМЗН (таб. 6). Характер агрегации ЗНО варьирует в зависимости от патологии у пробанда. Высокая частота накопления РТК среди родственников отмечается во всех группах пробандов. Наиболее высокая агрегация отмечена у родственников в семьях с «сайт-специфическим» синдромом Lynch-I (19.1±3.2%) и у пробандов, пораженных ПМЗН (12.8±1.8%), что превышает Таблица 6. Частота злокачественных и доброкачественных новообразований среди родственников первой степени родства пробандов с колоректальным раком, первично множественными злокачественными новообразованиями и синдромом наследственного неполипозного колоректального рака (Lynch-I, Lynch-II).
Синдром Lynch-II f 28 163 63 (39.2+ 3.8) 7.6± 2 i # 6.3± 19 - 6.3± 1 д ## 7.6±9 1 3.2+1.4 3.1±1.3 1.3± 0.89 3.8+ 1.4 Популяция 2.24± 0.0051 0.25± 0.0017 0.37+ 0.003 0.25± 0.002 0.15+ 0.0018 i.i±0.005 0.12+ 0.0012 0.07± 0.0009 0.0055± 0.00026 0.84+ 0.003 - Примечание: - р 0.05 (по отношению к контролю) - р 0.01 -р 0.001 t - без учета коррекции на возраст популяционную частоту в 76 и 51 раз (р 0.001), соответственно. Достаточно высока частота рака аналогичной локализации в семьях пробандов с колоректальным раком - 9.4±0.6%, превышающая таковую в популяции в 38 раз (р 0.001). Из представленных в таблице данных также видно, что в семьях больных РТК отмечается высоких уровень накопления и других ЗНО: рака желудка (7.3±0.5%), легких (4.0±0.3%), молочной железы (3.5±0.4%), тела матки (1.8+0.3%) и ПМЗН (0.33+0.1%).
Обращает на себя внимание достаточно высокий уровень накопления среди родственниц пробандов рака гормонозависимых органов: рака тела матки (от 1.8+0.3% при РТК до 6.3+1.9% при синдроме Lynch-II), рака молочной железы (от 1.6+1.0% в семьях с синдромом Lynch-I и 3.5±0.4% - при РТК до 7.6±2.1% в семьях с синдромом Lynch-II).
Ассоциации полиморфных вариантов генов-супрессоров OGG1, MSH3, MSH6, MLH1 с риском развития рака кишечника у человека
Многочисленные литературные данные указывают на участие в канцерогенезе РТК генов репарации ДНК. Для рака толстой кишки характерны мутации в группе генов репарации неспаренных оснований ДНК (MSH2, MSH3, MSH6, MLH1 и др.). Увеличение мутабильности опухолевых клеток ведет к нарушениям в дыхательной цепи, и как следствию, окислительному стрессу. При этом одним из наиболее часто возникающих повреждений ДНК является 8-оксогуанин. Репарацией данного типа повреждений занимается продукт гена OGG1. Для поиска ассоциаций были выбраны гены OGG1, MSH3, MSH6 и MLH1.
С этой целью мы провели рестрикционный анализ полиморфных сайтов ДНК в приведенных выше генах-супрессорах. В таблице 16 показана характеристика полиморфных сайтов исследованных генов с указанием их условного обозначения.
Выборки когорты больных раком кишечника и контрольной группы проверялись на наличие генетического равновесия по формуле Харди-Вайнберга (табл.17). Отсутствие значимых отклонений в фактических частотах генотипов от теоретически ожидаемых свидетельствует об отсутствии селективных преимуществ отдельных генотипов и различий в их приспособленности. Различие сравниваемых частот оценивались с помощью критерия %. Полученные значения %2 говорят о наличии равновесия Харди-Вайндберга в исследуемых группах по всем четырем полиморфным сайтам. Анализ полиморфизма по каждому из генов-супрессоров.
В каждом гене было исследовано по одному полиморфному сайту. На основании первичных данных были произведены расчеты частот генотипов в контрольной группе и группе больных, и выполнена статистическая обработка результатов (табл. 18-21).
Условные обозначения: А1/А1 - гомозигота по частому аллелю; А1/А2 -гетерозигота; А2/А2 - гомозигота по редкому аллелю; А1/- - присутствие частого аллеля (соответственно в эту группу входят гомозиготы по частому аллелю и гетерозиготы); А2/- - присутствие редкого аллеля (т.е. гомозиготы по редкому аллелю и гетерозиготы). Р - доверительный уровень. Для обозначения генотипов по остальным генам используются аналогичные обозначения.
В таблице 18 представлены частоты трех альтернативных генотипов и двух типов смешанных генотипов, включающих гомозиготы и гетерозиготы каждого аллеля. Как видно из рассчитанных %2, различия генотипов по двум группам статистически не значимы за исключением гомозигот по аллелю А2, %2=3,87 (для р=0.05). Этот генотип гораздо чаще встречается в контрольной группе, и, возможно, является генотипом с пониженным риском развития РТК, для более точного анализа влияния этого полиморфного сайта на риск развития заболевания необходимо дальнейшее расширение выборки.
Статистический анализ данных между выборками больных и здоровых доноров показал значимое различие только по гомозиготам по аллелю С2 гена MSH6. Носители этого аллеля чаще встречаются в группе больных (5,8%), чем в контроле (1,7%). Ассоциация аллеля С2 гена MSH6 с риском возникновения рака молочной железы была показана в работе Тарасова (Тарасов В.А. и соавт., 2006). Получены сходные результаты: гомозиготы по аллелю С2 также чаще встречаются в группе больных, что говорит о возможном участии данного полиморфизма в канцерогенезе рака молочной железы и рака толстой кишки.
На основании полученных выше результатов были рассмотрены все возможные парные комбинации аллельных состояний исследованных генов с целью выявления ассоциаций сочетанных генотипов с повышенным или пониженным риском развития рака толстой кишки. Анализ полиморфных генотипов генов, ассоциированных с риском развития рака кишечника.
Анализ исследованных нами генотипов позволил выявить 13 вариантов генотипов (табл. 22), у которых частота встречаемости в группе больных значимо отличается (с уровнем значимости 0,05) от этой частоты в контрольной группе. Десять из них имели распределение показателя Ki от +1 до 0, что характеризует преобладание этих вариантов в группе больных, и лишь три варианта имели показатель Кі от 0 до -1 с преобладанием доли этих генотипов в контрольной группе.
Скрининг в семьях больных РТК
Медико-генетическонсультирование (МГК) в онкологии является очень важным направлением, которое базируется на тех же основных принципах консультирования, как и при любых наследственных заболеваниях: 1) уточнение генетического диагноза и определение типа наследования в данной семье; 2) определение прогноза потомства и риска заболеть для каждого члена семьи; 3) объяснение семье в доступной форме смысла генетического риска, а также помощь в принятии решения и выборе программы действий.
В настоящее время все большее признание приобретает мнение о том, что прогресс в лечении РТК может быть достигнут не только усовершенствованием методов лечения, сколько улучшением современной диагностики. Однако, даже внедрение современных методов обследования толстой кишки не решает проблемы в. целом, поскольку как доброкачественные так и злокачественные новообразования длительное время протекают бессимптомно, а выявленный РТК в большинстве случаев является уже поздней стадией опухолевого процесса. Кроме того, специальное обследование всего населения с целью выявления пред- и опухолевой патологии толстой кишки — задача нереальная и экономически неоправданная. Очевидно, что необходимы новые подходы и тесты, которые могли бы выявить рак на предшествующих ему стадиях или по крайней мере на ранней стадии злокачественной трансформации клеток. Именно МГК дает реальные пути решения проблемы ранней диагностики и эффективной профилактики рака путем оказания своевременной медико-генетической помощи лицам с наследственно обусловленным риском возникновения злокачественных новообразований. Профилактика опухолей — вполне реальная цель, достижение которой видится в скрининге родственников больных и активной динамической диспансеризации лиц с высоким риском развития рака. На первом этапе проводится медико-генетическое консультирование пробандов из наследственно отягощенных семей. Выявленные наследственно отягощенные семьи заносятся в генетический канцеррегистр. Вторым этапом медико-генетического консультирования является определение генетического диагноза и степени риска возникновения злокачественного новообразования у родственников больных с целью формирования групп повышенного риска. На третьем, заключительном этапе, осуществляется активное диспансерное наблюдение (мониторинг) в выделенных группах в зависимости от возраста и в соответствии с категорией риска.
Анализ нашего материала, представленный в главе 3, позволил унифицировать критерии диагностики наследственных форм с целью включения в канцер-регистр: «семейная история» колоректального рака и/или аденом толстой кишки, ранний возраст манифестации РТК (моложе 50 лет), наличие в семье родственников с полинеоплазиями и другими злокачественными новообразованиями (рак эндометрия, яичников, молочных желез), специфические опухолевые ассоциации, определяющие генетические синдромы, наличие у консультируемого фоновых и предопухолевых процессов: АТК, гиперпластических процессов эндометрия, дисгормональных процессов молочных желез, опухолевых образований яичников и др. Генеалогический метод остается основным на современном этапе в уточнении генетического диагноза, при этом окончательный диагноз устанавливается с привлечением других специалистов и негенетических методов исследования.
Как было показано выше, доля пациентов с генетически детерминированными формами рака толстой кишки составила 22% (138 семей), а почти в 12% (22 семьи с полипозными синдромами и 53 семьи с синдромом Линча) случаев РТК является проявлением моногенно-наследуемых синдромов. В главе 3 нами было изучены частота и характер семейного накопления злокачественных и доброкачественных новообразований среди 3206 родственников 1 степени родства 609 больных с различными клиническими формами РТК. Высокая частота накопления ЗНО среди родственников отмечается во всех группах пробандов и колеблется от 34,8±3,9% в семьях с синдромом Линч I до 47,9±2.8% - в семьях больных ПМЗН по сравнению с популяционной частотой, которая равна 2,24±0,0051% (таб. 6). Наиболее высокая агрегация РТК среди родственников наблюдается в семьях с «сайт-спецефическим» синдромом Линч I 19,1 ±3,2%, превышающую популяционную более чем в 70 раз. Особенно высок процент выявления злокачественных новообразований в семьях с синдромами Линч I и П, а также с перично-множественными заболеваниями. Родственники таких больных
должны получать медико-генетическую консультацию относительно прогноза развития аналогичного заболевания у них, а в некоторых случаях длительное время находиться под диспансерным наблюдением у онкологов и генетиков. Такие наследственные состояния, как семейный аденоматозный полипоз, наследственный неполипозный РТК, синдромы Гарднера, Пейтца-Егерса, ювенильный полипоз толстой кишки, предполагают развитие РТК в сочетании с опухолями других локализаций. В случае установления моногенно наследуемой формы РТК, определение риска заболевания у родственников больного проводилось обычным способом, путем теоретических расчетов на основе простых генетических (менделевских) моделей. В этом случае риск развития заболевания для детей пробанда составляет 50%, а для его сибсов — 35-50% (с учетом неполной пенетрантности). Здесь необходимо подчеркнуть, что если у пробанда установлена вновь возникшая мутация, то повторный риск для сибсов, исходя их популяционных данных о частоте мутирования, очень незначителен и им можно пренебречь. Объяснение молекулярно-генетических основ позволяет изучать этиологию и патогенез заболевания, разрабатывать систему ранней диагностики и оптимизации наблюдения, лечения и профилактики с учетом индивидуального генотипа пациента.
