Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Экдистероиды растений рода Serratula'.выделение, идентификация и химические превращения 5
1.1. Выделение, идентификация и биологическая активность фитоэкдистероидов растений рода Serratula 7
1.2. Трансформации экдистероидов 13
Глава 2. Обсуждение результатов 37
2.1. Выделение, идентификация и биологическая активность фитоэкдистероидов из растения Serratula coronata 37
2.1.1. Новый способ выделения фитоэкдистероидов. Выделение экдистероидов из растения Serratula coronata 37
2.1.2. Идентификация выделенных фитоэкдистероидов 41
2.1.3. Диссоциативный захват электронов молекулами 20-гидроксиэкдизона 47
2.1.4. Биологическая активность выделенных фитоэкдистероидов 49
2. 2. Трансформации 20-гидроксиэкдизона 49
2.2.1 Взаимодействие 20-гидроксиэкдюона с трифторуксусным ангидридом в хлороформе 49
2.2.2. Взаимодействие ацетонидов 20-гидроксиэкдизона с трифторуксусным ангидридом в хлороформе в присутствии пиридина 54
Глава 3. Экспериментальная часть 57
3.1. Выделение фитоэкдистероидов из Serratula coronata 58
3.2. Трансформации 20-гидроксиэкдизона под действием трифторуксусного ангидрида 62
3.3. Взаимодействие ацетонидов 20-гидроксиэкдизона с трифторуксусным ангидридом 64
Выводы 69
Литература 71
- Выделение, идентификация и биологическая активность фитоэкдистероидов растений рода Serratula
- Новый способ выделения фитоэкдистероидов. Выделение экдистероидов из растения Serratula coronata
- Взаимодействие 20-гидроксиэкдюона с трифторуксусным ангидридом в хлороформе
- Взаимодействие ацетонидов 20-гидроксиэкдизона с трифторуксусным ангидридом
Введение к работе
Актуальность темы. Экдистероиды являются сравнительно новой группой природных низкомолекулярных биорегуляторов, по своей структуре относящиеся к полигидроксилированным стеринам. Характерной особенностью их структуры является г/ис-сочленение циклов А и В, наличие в кольце В Д'-6-кетонной группировки и 14а-гидроксилыюй группы. Экдистероиды впервые были обнаружены у членистоногих в качестве гормонов, регулирующих процессы их роста, дифференциации и метаморфоза. Поскольку на личиночной стадии развития экдистероиды регулируют линьку, эти соединения называют гормонами линьки насекомых. Характерной особенностью экдистероидов является их широкое распространение в животном и растительном мире -зоо- и, соответственно, фитоэкдистероиды.
Обнаружение экдистероидов в достаточно больших количествах (до 1.5-3% от сухого веса) в некоторых видах растений было довольно неожиданным и обусловило к ним большой практический интерес в качестве регуляторов роста и развития насекомых, защитных средств растений от насекомых-вредителей, а также в плане создания па их основе лекарственных препаратов, поскольку они оказались нетоксичными для млекопитающих.
К настоящему времени идентифицировано более 250 представителей
фито- и зооэкдистероидов, причем большинство составили
фитоэкдистероиды. Весьма перспективным источником
фитоэкдистероидов являются растения рода Serratula. Были сообщения об исследовании экдистероидного состава, выделении и идентификации некоторых видов растений данного рода, произрастающих в Средней Азии, на Украине, Северо-Востоке европейской части России. В то же время, флора Башкирии как источник экдистероидов практически не изучалась.
Наряду с выделением природных фитоэкдистероидов важны их
синтетические трансформации, позволяющие получать более
труднодоступные экдистероиды и их фармакологически значимые аналоги.
В этой связи поиск доступного источника фитоэкдистероидов*, выделение и идентификация экдистероидов из растительного сырья, а также исследование химических трансформаций фитоэкдистероидов представляются актуальными задачами.
Работа выполнялась как плановая в Институте нефтехимии и катализа АН РБ и УНЦ РАН при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 00-03-32811а).
Пель работы состояла в исследовании доступного, произрастающего на территории Башкирии растения Serratula coronata (серпуха венценосная) как источника фитоэкдистероидов, выделении и идентификации этих соединений, а также исследовании синтетических трансформаций одного из наиболее распространенного представителя фитоэкдистероидов - 20-гидроксиэкдизона для получения на его основе других, реже встречающихся в природе фитоэкдистероидов и их аналогов.
Научная новизна. Разработан новый метод выделения экдистероидов, основанный на выжимании сока из надземной части свежесобранных растений вида Serratula coronata с последующим концентрированием и экстракцией этилацетатом. Из этилацетатного концентрата были выделены, очищены с помощью ВЭЖХ и идентифицированы 7 фитоэкдистероидов. Из них - 20-гидроксиэкдизон, экдизон, полиподин В и аюгастерон С ранее идентифицированы в Serratula coronata. Кроме того, впервые выделены 22-(9-ацетил-20-гидроксиэкдизон и 22-дезокси-20-
' При постановке темы диссертационной работы принял участие д.х.н Балтаев У.А., предложивший в качестве перспективного источника фитоэкдистероидов растение Serratula coronata, произрастающее на территории Башкирии, за что автор выражает ему благодарность.
гидроксиэкдизон (таксистерон). Обнаружен новый фитоэкдистероид - 2-дезокси-3-эга<-4Д20-дигидроксиэкдизон, названный нами коронатастеро-ном. Структура нового экдистероида установлена на основании одно- и двумерных экспериментов ЯМР 'Н и ВС и селективного протонного двойного резонанса.
На примере 20-гидроксиэкдизона показана аналитическая значимость в химии экдистероидов метода масс-спектрометрии диссоциативного захвата электронов, которая позволяет фиксировать характеристичные ионы [М-Н2]", [М-пН20]" (п--1-3) и [М-Н2-пН20]' (п=1-3).
Установлено, что при взаимодействии 20-гидроксиэкдизона (20Е) с трифторуксусным ангидридом (ТФУА) в хлороформе в одну стадию образуется 225-аналог шидастерона как результат направленной дегидратации 20Е с обращением конфигурации С(22)-атома. Оказалось, что применение избытка ТФУА приводит к дальнейшим превращениям с получением, в итоге, шидастерона природной 22/?-конфигурации. Выделен промежуточный продукт этого превращения - (22S)-onu-20,22-0-(11 RS-гидрокси-2',2',2'-трифторэтилиден)-20-гидроксиэкдизон, идентифицированный с помощью ЯМР 'Н и ЬС.
Найден метод селективной защиты 20,22-гидроксильных групп путем взаимодействия экдистероидов с ацетоном в присутствии борфтористово дородной кислоты. Этим методом получены 20,22-ацетониды 20-гидроксиэкдизона и аюгастерона С.
Установлено, что при взаимодействии 2,3:20,22-диацетонида 20Е с эквимольным количеством ТФУА в присутствии пиридина образуются его 25-трифторацетат, а при использовании избытка ТФУА имеет место также 14,15-дегидратация. К образованию 25-
Практическая значимость. Разработан эффективный метод выделения фитоэкдистероидов из надземной части растений вида Serratula coronata, произрастающего в Башкирии и других регионах России, что позволяет рассматривать 20-гидроксиэкдизон и некоторые другие экдистероиды как достаточно доступные для их применения в медицине и сельском хозяйстве, а также для химических трансформаций. Так, основной компонент фитоэкдистероидов растения Serratula coronata - 20-гидрокснэкдизон является активным началом известного препарата «Экдистен» тонизирующего и иммуностимулирующего действия, а также препаратов для улучшения качества зимовки пчел, повышения выхода коконов тутового шелкопряда и для борьбы с паразитом пчел Varroa jacobsoni. Испытания противовоспалительной активности 20-гидроксиэкдизона на модели формалинового отека при лечении мышей, выполненные в лаборатории конструирования биологически активных веществ ИНК АН РБ и УНЦ РАН под руководством д.м.н. Башкатова С.А., показали, что введение водного раствора 20Е в дозе 50 мг/кг приводит к снижению отека в 3.5 раза.
Биотест на Drosophila melanogaster, выполненный на кафедре биологии
Эксетерского университета (Великобритания) профессором Л. Дайненом,
показал следующие значения экдизоновой (линочной) активности (ED5o):
20-Гидроксиэкдизон 7.5хЮ"9М
Коронатастерон 1.6x10 7М
Аюгастерон С 6.2хЮ"8М
Таксистерон 9.5хЮ'8М
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены
или представлены на V Международной конференции «Наукоемкие
химические технологии» (Ярославль, 1998), International Conference on
Natural products and physiologically active substances (Novosibirsk, 1998),
XIII th Ecdysone Workshop (Jena, 1998), III Всероссийском совещании
«Лесохимия и органический синтез» (Сыктывкар, 1998), Одиннадцатой
Всероссийской конференции по химическим реактивам «Реактив-98»
5 (Уфа, 1998), VI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем «Яльчик-99». (Казань-Москва-Йошкар-Ола, 1999), 18 th Conference on isoprenoids (Prachatice, 1999), VI Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 1999), 1ой Всероссийской конференции по химии гетероциклов памяти А.Н. Коста (Суздаль, 2000), XIV th Ecdysone Workshop "Ecdysone 2000" (Rapperswil, Switzerland, 2000), Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2000).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и тезисы 13 докладов на конференциях, получено 3 патента РФ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 3^ страницах компьютерного набора (формат А4) и включает введение, литературный обзор на тему «Экдистероиды растений рода Serratula: выделение, идентификация и химические превращения», обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы, список литературы {10*-) наименований).
Выделение, идентификация и биологическая активность фитоэкдистероидов растений рода Serratula
Экдистероиды довольно широко распространены в растительном мире [1]. Из обследованных 1056 видов флоры Японии активность гормона линьки насекомых (биотест на поедание с использованием Chilo suppressalis) обладали экстракты 5.1% видов растений [1-3].
Как правило, растение содержит не один экдистероид, а набор («коктейль»), включающий основной и минорные компоненты [4]. С помощью комбинации хроматографических методов эти соединения могут быть выделены [5,6] и идентифицированы с помощью различных физико-химических и спектральных методов [7,8]. Для аналитического и препаративного разделения экдистероидов наиболее эффективным является метод ВЭЖХ. Поскольку экдистероиды - полярные соединения, как правило, используют обращенно-фазовую препаративную ВЭЖХ с использованием С18-привитых силикагелевых колонок. В качестве подвижных фаз используют двух- или трехкомпонентные системы. Наиболее часто используемыми являются системы: изопропанол-вода [9] (эффективна при разделении 5а- и 5(3-изомеров), метанол-вода [10-14] и ацетонитрил-вода (эффективна при разделении За- и 3(3-изомеров [15-17]. Нормально-фазовую ВЭЖХ применяют для разделения малополярных экдистероидов с использованием колонок Zorbax-Sil. В качестве подвижных фаз эффективны системы растворителей дихлорметан-изопропанол-вода [18], изооктан-изопропанол-вода [19], хлороформ-этанол [20], хлороформ-метанол [21].
Наиболее информативными при установлении структуры экдистероидов являются методы ЯМР Н и 13С, а также масс-спектрометрия [7]. Во многих случаях для идентификации экдистероида достаточно несколько качественых одномерных (ID) спектров в сочетании с данными, полученными независимыми методами (например, масс спектрометрией). В последнее время возрастающее внимание уделяется использованию двумерных (2D) корреляционных методов ЯМР Н [8]. В наиболее сложных случаях необходимы исследования ЯМР С. Этот метод был впервые применен в 1972 г для а-экдизона. В то время как большинство протонов в спектрах находятся в интервале 3 м.д., углеродные атомы в спектрах ЯМР 13С расположены в области до 100 м.д., причем карбонильные и олефиновые атомы углерода находятся еще дальше в низкополевой области (до 220 м.д.). Из этого, очевидно, следует, что спектры ЯМР С имеют лучшее разрешение и легче поддаются интерпретации. Кроме .того, можно выявить и не связанные с протонами атомы, а также различить метальные, метиленовые, метановые и четвертичные атомы углерода методами DEPT [22]. Для веществ растительного происхождения необходимое для снятия спектра ЯМР С количество вещества (несколько мг) обычно доступно. Значительно сложнее задача получения достаточного количества материала из насекомых, хотя имеются примеры ЯМР 13С экдистероидов насекомых. Недавно разработаны усовершенствованные методы ЯМР "С, в которых информацию по ядрам С получают из сигналов более чувствительных Н ядер в экспериментах по инверсионной корреляции [23,24].
Масс-спектры экдистероидов являются вторым по значению источником информации о строении экдистероидов [7]. В настоящее время для идентификации экдистероидов используют ряд методов ионизации молекул: электронный удар, химическая ионизация, бомбардировка быстрыми атомами.
Наиболее распространенным методом ионизации экдистероидов является электронный удар. При электронном ударе регистрируемые в масс-спектре ионы образуются в результате взаимодействия вещества с потоком электронов с энергией, превышающей потенциал ионизации данного соединения. Возникающие при взаимодействии нейтральных молекул с такими электронами молекулярные ионы (М+) подвергаются различным процессам фрагментации и образуют положительно заряженные частицы. Характер распада М+ экдистероида при электронном ударе подробно исследован на примере экдизона [25], экдистерона [26] и некоторых других экдистероидов [27]. Однако метод масс-спектрометрии электронного удара имеет ограничения при анализе малолетучих и термически неустойчивых соединений.
Одним из сравнительно новых методов анализа экдистероидов является масс-спектроскопия с химической ионизацией (МСХИ). Согласно этому методу, в результате электронного удара ионизируется не исследуемое вещество, а газ-реактант (обычно метан, изобутан или аммиак). Ионы, образующиеся в ион-молекулярных реакциях (СН3+, СгН5+ в случае метана, NH4+ в случае аммиака), затем взаимодействуют с субстратом. Так, при исследовании понастерона А методом МСХИ при участии метана наблюдались пики (М+Н)+, (М+Н-Н20)+, (М+Н-2Н20)+ [7], а при использовании в качестве газа-реактанта аммиака идентифицирован ряд экдисгероидов из растений Ajugu replants [28].
Новый способ выделения фитоэкдистероидов. Выделение экдистероидов из растения Serratula coronata
Известно несколько способов получения 20-гидроксиэкдизона (экдистерона) из растения рода Serratula. Согласно одному из них [30], выделение экдистерона из соцветий Serratula xerathomoides производят путем измельчения воздушно сухих листьев с последующей экстракцией из них метанолом. Полученный экстракт упаривают, разбавляют водой, многократно экстрагируют гексаном, проводят дополнительную отгонку метанола, экстракцию бутанолом, его упаривание, элюирование хлороформ-метанолом на колонке с окисью алюминия. Недостатком этого метода является невысокий выход экдистерона (0.26% от воздушно-сухого веса сырья), а также многостадийность и большая продолжительность процесса (десять операций на 115 часов).
Согласно другому способу [31], первичную экстракцию сырья приводят метанолом, с одновременным упариванием в экстракторе вакуум-циркуляционной установки, с последующим удалением сопутствующих веществ жидкостной экстракцией и очисткой продукта жидкостно-адсорбционной колоночной хроматографией на оксиде алюминия. Способ включает девять последовательных операций: три экстракции, три выпарки, одну операцию фильтрования, одну операцию растворения и колоночную адсорбционную хроматографию. Время осуществления способа 66 - 70 часов. Недостатками указанного способа являются использование операций жидкостно- жидкостной экстракции, которые требуют многократности их повторения и минимум трехкратного объема экстрагента к экстрагируемому объему на каждой операции экстракции, длительность, трудоемкость и многостадийность процесса, а также значительная энергоемкость способа вследствие трех операций выпарки и длительности работы вакуумно-циркуляционной установки.
Согласно способу [32], для получения экдистерона надземную часть растения рода Serratula измельчают и экстрагируют водой при температуре не выше 100 С в течение до 1 часа. Полученный экстракт пропускают через слой твердого гидрофобного сорбента, например активированного угля, диасорба, полисорба, осуществляя одновременно разделение сопутствующих веществ и конечного продукта и его очистку. Затем конечный продукт экстрагируют с сорбента органическим растворителем. Недостатком этого метода является невысокий выход конечного продукта (0.49 %), использование больших объемов органических растворителей, а также дистилированной воды. В типовом примере описания изобретения для получения 1 г экдистерона расходуется 8 л. дистиллированной воды, 4 л 20% этилового спирта (который не регенерируется), 8 л смеси (1:1) этилацетат-этанол, 200 г активированного угля.
Нами разработан принципиально новый способ выделения фитоэкдистероидов [83-85], существенным отличительным признаком которого является отказ от первичной экстракции целевого продукта из растительного сырья с помощью органических растворителей или воды. Вместо экстракции применяют выжимание сока с последующей фильтрацией, что позволяет сразу получить концентрат суммы экдистероидов. Из концентрата экдистероидов экстракцией этилацетатом с последующим частичным упариванием и охлаждением выделяется кристаллический экдистерон, а в маточнике получают концентрат минорных экдистероидов. Способ осуществляется следующим образом: из надземной части растения вида Serratula coronata в день сбора или на следующий день выжимается сок (с помощью соковыжималки, пресса или других устройств), который фильтруют, и фильтрат (прозрачно-желтого цвета) концентрируют до 0.2 первоначального объема путем упаривания, вымораживания воды с отделением льда или другим приемом. Из полученного концентрата экстрагируют этилацетатом, экстракт упаривают до 0.1 первоначального объема экстракта, охлаждают, и выпавшие кристаллы экдистерона отфильтровывают. Такой способ существенно упрощает процесс выделения экдистероидов. Также исключается длительный процесс сушки растительного сырья. Все это значительно упрощает способ, при этом увеличивается выход экдистерона, возрастает производительность процесса, сокращаются энергозатраты, уменьшается расход органических растворителей и трудоемкость способа и, как следствие, значительно удешевляется весь процесс. Процесс с момента сбора до получения конечного продукта занимает всего сорок минут [83-86]. На основе разработанного способа из 1.1 кг свежесобранных растений было выделено 1.5 г 20-гидроксиэкдизона (1). Кроме того, с применением колоночной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии были выделены и идентифицированы 22-О-ацетил-20-гидроксиэкдизон (2), полиподин В (3), коронатастерон (4), аюгастерон С (5), таксистерон (6) и экдизон (7) [87-88]. 41 Из выделенных фитоэкдистероидов 1, 3, 5, 7 и ранее выделялись из растения вида Serratula coronata, 2 и 6 впервые выделены из данного вида, а коронатастерон 4 - новый фитоэкдистероид.
Структура нового фитоэкдистероида [89] - 2-дезокси-3-эяи-4Д20-дигидроксиэкдизона, или (20Я,22Я)-3#,4Д 14«,20,22,25-гексагидрокси-5Д холест-7-ен-6-она (4), названного нами коронатастероном, уникальна тем, что, в отличие от всех известных зоо- и фитоэкдистероидов, содержит гидрокси-группу в 4-ом положении. Доказательство этой структуры базируется на одно- и двумерных экспериментах ЯМР !Н и 13С (NOE diff, JMOD СН, COSY, CHCOOR, NOESY) и селективного протонного двойного резонанса. При сравнении спектров ЯМР 13С соединений 1 и 4 (таблица 2), снятых в режиме J-модулированного спинового эха (JMOD), видны существенные различия в положении и мультиплетности сигналов углеродных атомов С(1-5) кольца А молекул 1 и 4, тогда как параметры сигналов остальных атомов обоих соединений близки между собой (таблица 2). Смещение сигнала С(1) в сильное поле (А8=3.8 м.д.) и С(5) - в слабое поле (А8=5.6 м.д.) свидетельствует об отсутствии гидроксильной группы у С(2) атома и о наличии ее при С(4). Следовательно, триплетный сигнал при 5 43.0 м.д. относится к С(2), тогда как дублет при 5 75.3 м.д. отвечает С(4) - атому. Протонный сигнал в области 8 3.31 м.д. отнесен к Н(4) на том основании, что он имеет кросс-пики с Н(3) (5 3.63 м.д.) в гомоядерном НН COSY и с С(4) (5 75.3 м.д.) в гетероядерном СН CORR эксперименте (рис. 1).
Взаимодействие 20-гидроксиэкдюона с трифторуксусным ангидридом в хлороформе
ИК-спектры веществ сняты на спектрометре "Specord 75-IR" (в таблетках КВт). УФ-спектры получены на спектрометре "Specord М-40", растворитель - СН3ОН. Спектры ЯМР Н и 13С регистрировались на приборах "Bruker АМ-300" (рабочая частота для Н- 300.13 МГц, для 13С -75 МГц) растворители - CD3OD, C5D5N и CDCI3. Химические сдвиги приведены в шкале 5 относительно ТМС (внутренний стандарт). ВЭЖХ -анализ выполняли на жидкостном хроматографе «Du Pont», снабженном УФ-детектором (к 242 нм), колонкой с сорбентом Сепарон-С18 (125x4 мм, 5 мкм), элюент: метанол-вода 60:40, 0.8 мл-мин"1, 20 С. Препаративное разделение проводили на жидкостном хроматографе «Waters», снабженном УФ-детектором (X 242 нм), колонкой с сорбентом Сепарон-С18 (125x25 мм, 10 мкм), элюент: метанол-вода, 60:40, 5 мл-мин"1, 20С. Для контроля методом ТСХ использовали пластины с Si02 (Silufol), проявление ванилин-серной кислотой. Удельные углы вращения определены на поляриметре "Perkin-Elmer-141". Температуры плавления определены на малогабаритном нагревательном столе типа «БОЭТИУС». Масс-спектры положительных ионов получены на приборе MX-16 параметры ЭУ -ионизирующее напряжение 70 эВ, рабочая температура 200С. Масс-спектр отрицательных ионов соединения 1 получен на переоборудованном для работы в режиме резонансного захвата электронов промышленном масс-спектрометре МИ-1201 при следующих условиях: ток электронов 1 мкА, ширина их энергетического распределения на полувысоте ДЕщ = 0.3 - 0.4 эВ, развертка энергии электронов в диапазоне 0-14 эВ с калибровкой шкалы энергии по максимуму кривой эффективного выхода (КЭВ) ионов SF67SF6 ( 0 эВ) и максимуму КЭВ ионов NH27NH3 (« 5.65 эВ); исследуемый образец напускался в ионный источник прямым вводом при температуре 200С, температура ионизационной камеры составляла 3.1. Выделение фитоэкдистероидов из Serratula coronata, а. 450 г измельченных воздушно-сухих листьев экстрагировали (Зл х 5) этиловым спиртом. Экстракт упарили на роторном испарителе при остаточном давлении 30-40 Торр. и температуре бани не выше 80С до объема 150 мл. Концентрат разбавили 300 мл дистиллированной водой и гексаном удалили неполярную часть (500 мл х 5). Далее из водного концентрата исчерпывающе экстрагировали этилацетатом сумму экдистероидов. Этилацетат упарили досуха, получив 7 г маслообразного концентрата. Разделение 20-гидроксиэкдизона от сопутствующих веществ осуществляли на колонке с силикагелем (элюент - хлороформ этанол, 5:1), отобрав фракции, содержащие целевой продукт. Выделено 1.5 г 20-гидроксиэкдизона, или (20Я,22/?)-2ДЗД14а,20,22,25 гексагидрокси-5Д-холест-7-ен-6-он (1), выход 0.3 %, [а]о2 +65.0 (с 1.0, МеОН), т. пл. 246С (из смеси ЕЮАс-МеОН, 9:1), ИК-спектр (KBr), V/CM 1: 1610 (С=С), 1655 (С=0), 3420 (ОН). УФ-спектр (EtOH), WHM (Є): 240 (13600). ЯМР !Н (CD3OD, 8, м.д., J/Гц): 0.87 (с, ЗН, Н(18)); 0.95 (с, ЗН, Н(19)); 1.18 (с, ЗН, Н(21)); 1.19 (с, ЗН, Н(26)); 1.20 (с, ЗН, Н(27)); 1.09-2.15 (м, 16Н, СН2); 2.33-2.39 (м, 2Н, Н(5), Н(17)); 3.13 (м, 1Н, Н(9)); 3.31 (д, 1Н, Н(22), J=10.4); 3.83 (д.т, 1Н, Н(2), 3J,=8.3, 3J2=3.3), 3.94 (м, 1Н, Н(3), w1/2=10.4); 5.79(д,1Н,Щ7),У=2.3). б. 100 г. воздушно сухих листьев растения рода Serratula заливали 1 л. дистиллированной воды и экстрагировали в течении 30 мин. при температуре 45-100С и периодическом перемешивании. Экстракт сливали и концентрировали до 0.3 л путем упаривания воды на роторном испарителе при остаточном давлении 30-40 Торр. и температуре бани не выше 80С. Из концентрата экстрагировали 20-гидроксиэкдизон этилацетатом (0.7 л. х 3), экстракты объединили, упарили этилацетат до 100 мл, охладили и отфильтровали выпавшие кристаллы экдистерона. Выход продукта 0.7 г, что составляет 0.7% от воздушно сухих листьев. в. Из 1.1 кг свежесобранных в вегетационный период (надземная часть) Serratula coronata с помощью соковыжималки получили сок, который отфильтровали (600 мл), остатки полученные после выжима залили 1 л. дистиллированной воды и экстрагировали в течении 30 мин. при температуре 45-100С и периодическом перемешивании. Сок и водный экстракт объединили и сконцентрировали на роторном испарителе при остаточном давлении 30-40 Торр. и температуре бани не выше 80 С до объема 50 мл, после охлаждения экстрагировали этилацетатом (5x200 мл). Полученный экстракт упарили (60С, 30-40 Торр.) до объема -90 мл, охладили до комнатной температуры и отфильтровали выпавшие кристаллы, получив 1.89 г (1.5% в расчете на воздушно-сухие листья) соединения 1. г. Из 1.1 кг свежесобранных в вегетационный период (надземная часть) Serratula coronata с помощью соковыжималки получили сок, который отфильтровали (600 мл) и сконцентрировали на роторном испарителе при остаточном давлении 30-40 Торр. и температуре бани не выше 80С до объема 50 мл, после охлаждения экстрагировали этилацетатом (5x200 мл). Полученный экстракт упарили (60 С, 30-40 Торр.) до объема -90 мл, охладили до комнатной температуры и отфильтровали выпавшие кристаллы, получив 1.76 г (1.4% в расчете на воздушно-сухие листья) соединения 1.
Взаимодействие ацетонидов 20-гидроксиэкдизона с трифторуксусным ангидридом
Таксистерон 6 впервые был выделен в аморфном состоянии из тиса Taxus cuspidata [90], превращен в 2,3-Диацетат, для которого был снят масс-спектр и спектры ЯМР 1Н и 13С. Сообщалось также о выделении из растения Silene nutans кристал ического таксистерона [91], однако приведенные авторами физико-химические константы существенно отличались от полученных нами для соединения 6.
Структура таксистерона 6 нами подтверждена спектром ЯМР С, в котором наблюдаются существенные изменения в положении сигналов С(20)-С(24) в сравнении с соответствующими сигналами в спектре ЯМР 13С соединения 1, а для сигнала С(22) характерны не только сильнопольное смещение (А8=32.5 м.д.), но и трансформация из дублета (в спектре 1) в триплет.
Интересно отметить, что характерное смещение сигналов протонов в слабое поле, наблюдаемое при замене растворителя CD3OD на C5D5N, в случае соединения 6 проявляется в разной степени по отношению к сигналам Н(5) и Н(17) (табл. 3). В результате, перекрывающиеся сигналы этих протонов (8 2.30-2.42 м.д.), при снятии спектра ЯМР Н в C5D5N выходят раздельно, причем в более слабом поле (5 3.03 м.д.) оказывается тогда как сигнал Н(17) имеет вид триплета (5 2.89 м.д., JH(17)-H(16)= 8.8 Гц). По-видимому, специфическое влияние C5D5N вследствие координации молекул растворителя с группами ОН(З) и С=0 соединения 6 в большей степени оказывает дезэкранирующий анизотропный эффект на Н(5) по сравнению с аналогичным эффектом в отношении Н(17). В этой связи, можно было ожидать влияния изменения температуры снятия спектра на величину относительного сдвига сигналов Н(5) и Н(17) соединения 6. Действительно, при понижении температуры влияние растворителя возрастает и сигналы Н(5) и Н(17) ещё больше расходятся, тогда как повышение температуры уменьшает это влияние, и сигналы Н(5) и Н(17) сближаются (табл. 3).
Выделенный нами аюгастерон С 5 имел т.пл. на 18иС выше приведенной в литературе [92]. С другой стороны, спектр ЯМР 13С соединения 5 был аналогичен литературному для аюгастерона С.
Отличие структуры 5 от базового соединения для сравнения (20-гидроксиэкдизона 1) - в местоположении одной из гидроксильных групп, что наглядно отражается в спектре ЯМР 13С (таблица 2). Как видно, сигнал С(25) атома в спектре 5 смещается в сильное поле (А8=43.4 м.д.), трансформируясь из синглета в дублет (режим JMOD), а сигнал С(11), наоборот, смещается в слабое поле (А5=45.9 м.д.), преобразуясь из триплета в дублет. а-Конфигурация ОН(11)-группы в 5 следует из рассмотрения одно- и двумерного спектров и NOE-эффектов. Отнесение сигнала в области S 4.12 м.д. (т.д, Ьт[).щ9)- (иунацг)=%-9 Гц, 3JH(n).He{l2) -5.6 Гц) к Н(11) сделано на основании наличия кросс-пика между ним и сигналом С(11) (5 69.5 м.д.) в гетероядерном СН CORR спектре. При последовательном насыщении сигналов протонов аксиально расположенных метальных групп - Н(18) (5 1.05 м.д.) и Н(19) (5 0.87 м.д.) наблюдался NOE-эффект на Н(11), что свидетельствовало об их пространственной сближенности и, следовательно, аксиальной ориентации Н(11), то есть, соответственно, экваториальной, или а-конфигурации ОН(П) группы. Дополнительным подтверждением аксиальной направленности Н(11) может служить его КССВ с аксиальным протоном Н(9) (5 3.15 м.д.) равная 8.9 Гц, которая однозначно следует из сверхтонкой структуры сигнала Н(9), имеющего вид хорошо разрешенного дублет-дублета (VHW-HO D= 8-9 Гі 4Лі(9)-н(7)= 2.3 Гц).
О выделении 22-О-ацетил-20-гидроксиэкдизона (2) из других источников сообщалось неоднократно [7,37,93]. Его строение было установлено с помощью масс-спектра и ЯМР Н. Структура 2 нами подтверждена спектром ЯМР 13С [94], в котором наблюдался сдвиг в слабое поле сигнала С(22) (А8=2.2 м.д.) относительно соответствующего сигнала в спектре 1. Кроме того, присутствовали два дополнительных сигнала при 5 173.4 и 21.3 м.д., свидетельствовавшие о присутствии ацетатной группы. Спектр ЯМР 13С полученного нами полиподина В 3 в целом совпадает с приведенным в литературе [95], однако сигналы С(1) и С(9) следует поменять местами, в пользу чего свидетельствует JMOD эксперимент.
Спектры ЯМР Ни С выделенных экдистероидов 1 и 7, и их физико-химические константы были идентичны приведенным в литературе [62]. Таким образом, несмотря на то, что растение Serratula coronata было достаточно подробно исследовано на экдистероидный состав, в данной работе были идентифицированы ранее не выделявшиеся из Serratula coronata 22-0-ацетил-2О-гидроксиэкдизон и 22-дезокси-20 гидроксиэкдизон (таксистерон). Но самое интересное - выделен и идентифицирован новый фитоэкдистероид - 2-дезокси-3-эим-4Д20-дигидроксиэкдизон, названный нами коронатастероном - в честь растения, экдистероидный состав которого, возможно, все еще не полностью изучен. Нельзя исключить также версию, что присутствие найденных нами новых для данного растения фитоэкдистероидов обусловлено ареалом его произрастания. Еще одно объяснение может состоять в том, что в данной работе был применен принципиально отличающийся от обычно используемых способ выделения концентрата экдистероидов в виде сока, выжатого из свежесобранных растений.
