Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 6
2 Обзор литературы 13
2.1 ПЭТ как уникальный исследовательский и диагностический метод 13
2.2 Значение радиохимии в развитии ПЭТ 20
2.3 Фтор-18 - основной радионуклид для ПЭТ 22
2.3.1 ПЭТ радиоизотопы 22
2.3.2 Получение фтора-18 в мишени циклотрона 29
2.3.3 Стратегии получения РФП на основе фтора-18 31
2.3.4 Основные методы введения фтора-18 в органические соединения. 35
2.3.5 Ароматическое нуклеофильное замещение как метод введения фтора-18 в арены 44
2.3.6 Применение изотопного 19F/18F-o6MeHa для синтеза, соединений меченных фтором-18 54
2.4 Уникальные возможности ПЭТ в in vivo исследованиях лигандрецепторных взаимодействий 57
2.4.1 Фармакокинетика ПЭТ радиолигандов 60
2.5 Исследование бензодиазепиновых рецепторов методом ПЭТ 64
2.5.1 ГАМК и бензодиазепиновые рецепторы 64
2.5.2 [пС]Флюмазенил - радиолиганд для исследования БЗР методом ПЭТ 66
2.5.3 Другие радиолиганды для БЗР в ядерной медицине 68
2.5.4 Радиолиганды для центральных бензодиазепиновых рецепторов, меченные фтором-18. 69
3 Экспериментальная часть 73
3.1 Получение фтора-18 и [ F]фторирующих агентов 73
3.2 Введение метки фтора-18 в модельные соединения 75
3.2.1 Радиофторирование модельных соединений. 75
3.2.2 Конкурентное радиофторирование. 76
3.2.3 Введение фтора-18 в ароматические соединения, содержащие катион диазония. 80
3.3 Изучение реакции изотопного ' F/1 F-обмена в молекуле флюмазенила 82
3.3.1 Получение радиофторирующего агента 83
3.3.2 Получение флюмазенила, меченного фтором-18 83
3.3.3 Идентификация и анализ [ F]флюмазенила. 85
3.3.4 Изучение устойчивости флюмазенила в условиях нуклеофильного радиофторирования 86
3.3.5 Изучение химической кинетики изотопного 19F/18F обмена в молекуле флюмазенила. 88
3.3.6 Очистка [18Р]флюмазенила методом твердофазной экстракции 91
3.4 Синтез [18Р]флюмазенила без добавления носителя из Ro 15-2344 91
3.5 Синтез модельных соединений и соединений-предшественников. 94
3.6 Доклинические исследования с [ Р]флюмазенилом 99
3.6.1 In Vitro авторадиография 99
3.6.2 ПЭТ исследования 100
3.6.3 Исследование метаболизма [ Р]флюмазенила в крови. 102
4 Результаты и обсуждение 103
4.1 Получение [ Р]флюмазенила по реакции изотопного F/ F обмена 103
4.2 Изучение реакции изотопного 19F/ F-обмена в молекуле флюмазенила 106
4.2.1 Зависимость выхода [ Р]флюмазенила от растворителя и радиофторирующего агента 106
4.2.2 Зависимость выхода [ Р]флюмазенила от температуры 109
4.2.3 Зависимость выхода [l8F]OM3 от концентрации ФМЗ 110
4.2.4 Влияние перемешивания реакционной смеси, присутствия следов воды и носителя (фтор-19) изотопный F/I8Fo6MeH в молекуле флюмазенила. 111
4.2.5 Идентификация^ Р]флюмазенила хроматографическими методами. 113
4.2.6 Очистка [ Р]флюмазенила твердофазной экстракцией 114
4.2.7 Изучение кинетики изотопного обмена в молекуле флюмазенила. 115
4.3 Конкурентное нуклеофильное радиофторирование флюмазенила, Ro 15-2344 и ряда модельных соединений 121
4.4 Обсуждение возможности использования [18Р]флюмазенила низкой удельной активности, полученного изотопным 19F/l8F-o6MeHOM, для проведения ПЭТ исследований 128
4.5 Получение [18Р]флюмазенила с высокой удельной активностью из Ro 15-2344. 130
4.6 Подтверждение функциональной пригодности [ Р]флюмазенила в качестве рецепторного радиолиганда методом авторадиографии и in vivo ПЭТ исследований на обезьянах. Сравнение с [иС]Флюмазенилом 133
4.6.1 In Vitro авторадиография 133
4.6.2 ПЭТ исследование 134
4.6.3 Анализ метаболитов в плазме крови 136
4.7 Перспективы применения [|8Р]флюмазенила в ПЭТ 138
Выводы. 140
- Значение радиохимии в развитии ПЭТ
- Ароматическое нуклеофильное замещение как метод введения фтора-18 в арены
- Другие радиолиганды для БЗР в ядерной медицине
- Изучение реакции изотопного ' F/1 F-обмена в молекуле флюмазенила
Введение к работе
"Вероятно, что наибольшая польза, которую человечество извлечет из
исследований по атомной энергии, будет связана не с использованием самой
атомной энергии, а с широким применением изотопных, так называемых
меченых атомов для решения разнообразных проблем... "Г. Сиборг.
Развитие и совершенствование современных методов ядерной медицины -позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ) и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) - существенно расширило возможности in vivo изучения нейрохимических процессов, протекающих с участием различных рецепторных систем и соединений, связывающихся с ними (лигандов). Метод ПЭТ позволяет получать уникальную количественную информацию о распределении рецепторов в различных отделах мозга и их состоянии, что важно для проведения фундаментальных исследований, а так же диагностики различных заболеваний центральной нервной системы.
К рецепторным радиолигандам, используемым в ПЭТ, предъявляется следующие требования: высокая аффинность (характеризуемая константой равновесия связывания лиганда с, рецептором избранного типа - Kd), селективность к данному типу или подтипу рецепторов, способность радиолиганда проникать через гематоэнцефалический барьер, низкий уровень неспецифического связывания, высокая удельная активность, относительная устойчивость к метаболизму и т.д.
Важную роль в процессах, протекающих в центральной нервной системе, играет ГАМК-эргетическая система, которая реализует биохимическое действие Г'АМК (у-аминомасляной кислоты), являющейся основным тормозным нейромедиатором центральной нервной системы.
Бензодиазепиновые рецепторы (БЗР), являющиеся частью ГАМК-эргетической системы, способны специфически связывать целый ряд соединений, носящих название бензодиазепинов, и модифицировать действие ГАМК. Именно с этим связано физиологическое действие бензодиазепинов, которые оказывают депрессивное влияние на ЦНС, и нашли широкое применение в фармакологии в качестве анксиолитиков, транквилизаторов и релаксантов.
& Для изучения БЗР методом ПЭТ предложен целый ряд радиолигандов,
среди которых наиболее широкое применение нашел [пС]флюмазенил. [пС]флюмазенил является меченой формой флюмазенила, антагониста БЗР с высокой аффинностью (Kj=5hM) и применяется в анестезиологии для снятия бензодиазепиного наркоза. В настоящее время [пС]флюмазенил признан «золотым стандартом» среди радиолигандов для БЗР и широко используется для диагностики некоторых форм эпилепсии методом ПЭТ, а также других заболеваний центральной нервной системы.
Основным недостатком РФП на основе углерода-11 является малый
период полураспада этого изотопа (Т|/2 = 20,4 мин). Это накладывает
ц ограничения на время проведения радиохимического синтеза и ПЭТ
исследования. Альтернативой может служить использование аналогов, меченных более долгоживущим фтором-18 (Ti/2=110 мин). Применение этого радионуклида дает также дополнительные преимущества, такие, как возможность получения нескольких клинических доз дорогостоящих РФП в одном синтезе и их доставки в ПЭТ центры, не имеющие собственного циклотронно-радиохимического комплекса.
Молекула флюмазенила содержит в своем составе атом фтора. Таким образом, введение радиоактивного фтора-18 в ту же позицию в молекулу флюмазенила не должно приводить к изменению биохимического поведения
=7=
[18Р]флюмазенила по сравнению с [' С]флюмазенилом. И тем самым, разработанные для [пС]флюмазенила фармакокинетические модели и протоколы ПЭТ исследований, а также накопленная обширная база данных (более 500 публикаций) могут быть использованы ив ПЭТ исследованиях с
1 Я
[ Р]флюмазенилом.
Предложенные ранее фторпроизводные флюмазенила
to і о
[ Р]фторфлюмазенил и ;V-(2'-[ Р]фторэтил)флюмазенил содержат метку
# фтора-18 в различных положениях боковой цепи. Первые исследования мозга
человека с использованием iV-(2'-[ Р]фторэтил)флюмазенила показали, что метаболизм этого радиолиганда является более сложным по сравнению с флюмазенилом, и что это затрудняет интерпретацию полученных данных. В связи с этим разработка методов синтеза [ Р]флюмазенила, полного химического аналога флюмазенила, является актуальной.
О возможности получения [ Р]флюмазенила из флюмазенила и его нитро-аналога(11о 15-2344) путем нуклеофильного радиофторирования сообщалось в стендовом докладе, сделанном Голландскими учеными в 2001 году на 14 международной конференции, посвященной радиофармацевтике [162]. Для
) Я
* получения [ Р]флюмазенила авторы использовали предложенный ими
метод "instant fluorination" проводя радиофторирование при пониженном
давлении в высококипящем растворителе (коллидине) в присутствии следов
воды. Однако большое количество примесей, возникающее при
использовании этого метода, привело к необходимости использования
сложной процедуры очистки [|8Р]флюмазенила и низкому выходу препарата
[ Р]флюмазенила [175].
Предложенный метод не может быть адаптирован к современным автоматизированным системам для нуклеофильного радиофторирования, предназначенных для проведения реакций в стандартных апротонных
=8=
растворителях (ацетонитрил, ДМСО, ДМФ) при температурах 80-160С.
Целью данной диссертационной работы было исследование ароматического нуклеофильного радиофторирования флюмазенила и Ro 15-2344 в более мягких условиях с целью разработки эффективной методики синтеза [ ' Р]флюмазенила.
В связи с большей доступностью флюмазенила по сравнению с Ro 15-2344, детальное изучение влияния на выход нуклеофильного радиофторирования таких параметров, как природы растворителя и [ F]фторирующего агента, концентрации вещества предшественника (флюмазенила), температуры, времени реакции, чувствительности реакции к присутствию следов воды и перемешиванию реакционной смеси, проводилось с использованием реакции изотопного 19F/l8F-o6MeHa. Также была поставлена задача изучения химической кинетики изотопного l9F/18F-o6MeHa и относительной реакционной способности флюмазенила, Ro 15-2344 и ряда модельных соединений методом конкурентных реакций.
На основании проведенных исследований была разработана' методика
1 о
получения [ Р]флюмазенила с высокой удельной активностью, включающая реакцию нуклеофильного радиофторирования Ro 15-2344, очистку [|хР]флюмазенила от компонентов реакционной смеси методом полупрепаратиной ВЭЖХ и получение стерильного препарата [,8Р]флюмазенила, пригодного для внутривенного введения.
Заключительным этапом данной работы было проведение доклинических исследований препарата [ F]флюмазенила методами авторадиографии, на срезах человеческого мозга и ПЭТ исследований на обезьянах, призванных доказать возможность использования [ Р]флюмазенила в качестве радиолиганда для изучения БЗР методом ПЭТ.
Положения, выносимые на защиту.
[|8Р]Флюмазенил может быть получен с высоким радиохимическим выходом методом нуклеофильного радиофторирования флюмазенила (изотопный 19F/l8F-o6MeH) и его нитро-аналога (Ro 15-2344). Радиофторирование Ro 15-2344 с последующей очисткой методом полупрепаративной ВЭЖХ позволяет получать [18Р]флюмазенил высокой удельной активности ( > 185 ГБк/цмоль), необходимой для проведения рецепторных исследований мозга методом позитронной эмиссионной томографии.
Нуклеофильное радиофторирование флюмазенила и Ro 15-2344 протекает по механизму ароматического нуклеофильного замещения. Относительные константы скорости радиофторирования флюмазенила и Ro 15-2344 на два порядка ниже, чем для ароматических соединений, содержащих сильные электроноакцепторные заместители (NCK, CN) в орто- или «ара-положении к уходящей группе (F, N02). Сравнение реакционной способности флюмазенила и Ro 15-2344 показывает, что в реакции ароматического нуклеофильного замещения с фторид-анионом подвижность нитрогруппы в составе Ro 15-2344 существенно ниже, чем фтора в молекуле флюмазенила.
Методом авторадиографии на срезах головного мозга человека ив ПЭТ исследованиях на обезьянах впервые продемонстрировано сходство в фармакокинетическом поведении [ Р]флюмазенила и [иС]флюмазенила, широко применяемого в практике ПЭТ. Благодаря более высокому периоду полураспада фтора-18 (110 мин), [|8Р]флюмазенил имеет ряд преимуществ перед [пС]флюмазенилом, и является новым перспективным радиолигандом для визуализации центральных бензодиазепиновых рецепторов методом ПЭТ.
Научная новизна.
Впервые изучены реакции получения [ Р]флюмазенила путем нуклеофильного радиофторирования флюмазенила и Ro 15-2344 в "стандартных" условиях. Проведено изучение химической кинетики изотопного обмена в молекуле флюмазенила и влияния на выход [|8Р]флюмазенила таких параметров, как природы растворителя и [|8Р]фторирующего агента, концентрации вещества предшественника (флюмазенила), температуры, времени реакции, чувствительности реакции к присутствию следов воды и перемешиванию реакционной смеси.
Предложена оригинальная методика получения [ Р]флюмазенила с высокой удельной активностью, включающая реакцию нуклеофильного
1 Я.
радиофторирования Ro 15-2344, очистку [ Р]флюмазенила от компонентов реакционной смеси методом полупрепаратиной ВЭЖХ и получение стерильного препарата [|8Р]флюмазенила, пригодного для внутривенного введения.
В сотрудничестве с Каролинским институтом (Швеция) впервые проведен полный спектр исследований по оценке [ Р]флюмазенила в качестве рецепторного радиолиганда:
Методом post-mortem авторадиографии на срезах головного мозга человека показано, что радиолиганд избирательно накапливается в областях с высокой плотностью центральных бензодиазепиновых рецепторов и полностью вытесняется при добавлении нерадиоактивного флюмазенила.
Методом ПЭТ изучено накопление [ Р]флюмазенила в мозге обезьян (Cynomolgus monkey), определены области специфического связывания радиолиганда. Показано, что введение нерадиоактивного флюмазенила
в момент его максимального накопления (18 мин) полностью
1 Й
ингибирует процесс связывания [ Р]флюмазенила с центральными БЗР.
1 о
Проведены сравнительные ПЭТ исследования [ Р]флюмазенила и [пС]флюмазенила на обезьянах, продемонстрировавшие идентичность двух радиолигандов и указывающие на потенциальную возможность
і о
использования [ Р]флюмазенила'как радиолиганда для исследования бензодиазепиновых рецепторов человека методом позитронной эмиссионной томографии.
Практическая значимость.
Как показывают проведенные нами доклинические исследования,
і о it
распределение в тканях и метаболизм [ Р]флюмазенила и [ С]флюмазенила идентичны. Это доказывает функциональную пригодность [18Р]флюмазенила как радиолиганда для изучения БЗР методом ПЭТ. Значительно облегчить и ускорить процесс внедрения [ Р]флюмазенила в рутинную ПЭТ диагностику
1 R
может тот факт, что для [ Р]флюмазенила могут быть использованы
детально разработанные для [пС]флюмазенила ПЭТ протоколы и
фармакокинетические модели, а также накопленные для него обширные исследовательские и клинические данные. Использование [ Р]флюмазенила открывает новые возможности для получения» нескольких клинических доз дорогостоящего РФП в одном синтезе и доставки РФП в ПЭТ центры, не имеющие собственного циклотронно-радиохимического комплекса, а так же проведения более длительных ПЭТ исследований.
Весною 2005 года с использованием [ Р]флюмазенила уже были проведены первые клинические ПЭТ исследования пациентов, больных эпилепсией.
= 12=
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Значение радиохимии в развитии ПЭТ
Возможности метода ПЭТ в значительной степени определяются арсеналом доступных РФП. Именно выбор подходящего РФП позволяет изучать с помощью ПЭТ такие разные процессы, как метаболизм, транспорт веществ, лиганд-рецепторные взаимодействия, экспрессию генов и т.д. Широкий спектр различных классов РФП делает ПЭТ достаточно универсальным инструментом современной молекулярной биологии и клинической медицины. Поэтому радиохимический синтез новых РФП и разработка эффективных методик синтеза уже зарекомендовавших себя РФП в настоящее время становится "лимитирующей стадией" развития метода ПЭТ. Проблема разработки новых РФП нетривиальная задача, требующая совместной работы высококвалифицированных биохимиков, биологов, врачей, химиков-органиков, аналитиков и радиохимиков. В Таблица 2.4 представлены основные этапы разработки и внедрения новых РФП в ПЭТ практику. Прототипом для РФП могут служить эндогенные соединения, принимающие участие в интересующих процессах. Планирование новых РФП может основываться на данных, имеющихся для фармацевтических препаратов или полученных при скрининге на биологическую активность различных классов соединений. В последнее время оформилась тенденция обратной связи между ПЭТ и фармацевтикой, согласно которой данные ПЭТ исследований могут существенно помочь при разработке новых фармацевтических препаратов [18]. Например, аммиак-l3N ([l3N]NH3), являющийся основным РФП для оценки перфузии миокарда, долгое время получали достаточно сложным методом, включающим восстановление 13М-нитрата, образующегося: при облучении воды протонами, сплавом Деварда и дистилляцией продукта в токе гелия [21]. Благодаря фундаментальным исследованиям реакций атомов отдачи азота-13, образующихся по реакции I60(p,a)13N в водной мишени циклотрона [22, 23], удалось создать ядерно-химический метод синтеза аммиака-13Ы непосредственно в мишени циклотрона. Этот метод обеспечивает стабилизацию азота-13 в форме ,3Ы-аммиака за счет введения в облучаемую воду восстанавливающих добавок, например, этанола [24] или метана [25]. Наибольший интерес для разработки новых РФП представляют углерод-11 и фтор-18. Период полураспада этих изотопов позволяет проводить синтез достаточно сложных соединений. Углерод-11. Углерод-11 может быть получен по ядерной реакции ,4N(p,a) ПС в газовой мишени циклотрона. В зависимости от состава облучаемой газовой смеси метка стабилизируется либо в форме [пС]СОг либо в форме [ПС]СН4. Из этих соединений может быть получен целый ряд синтонов (Рисунок 2.3.), использующихся для получения РФП, меченных углеродом-11. Углерод-Г1 играет важную роль в разработке новых РФП для ПЭТ.
Поскольку углерод образует скелет всех органических соединений, выбор метода и позиции введения метки углерода-11 достаточно широк. Другая причина - это наличие хорошо проработанных универсальных стратегий введения углерода-11 в органические соединения. Так в соединения, в составе которых имеются спиртовые, карбоксильные, фенольные группы, а также в амины и соединения с другими группами, способными выступать в качестве нуклеофила, метка углерода-11 может быть введена по реакции метилирования с использованием [пС]метилиодида или [ С]метилтрифлата. [пС]метилиодид можно получить различными способами. Так у называемый «мокрый» метод основан на реакции восстановления [пС]С02 литий алюминий гидридом с последующей конверсией полученного интермедиата в меченый метил йодид в результате нагревания с 57% иодистоводородной кислотой. Этот метод, предложенный в 70-е годы, был использован в первых работах по синтезу Ь-[пС-метил]метионина [27], наиболее широко применяемого РФП на основе меченых аминокислот. Недостатком метода является сложность автоматизации, однако, в роботизированном варианте он используется во многих ПЭТ центрах, включая ИМЧ РАН [28]. В настоящее время используется более простой «газо-фазный» метод, который положен в основу современных автоматических модулей для "С-метилирования. В этом случае [nC]CH3I получают пропусканием пС-метана, получаемого либо реакцией [пС]С02 с водородом, либо прямо в мишени циклотрона, через трубку, содержащую кристаллический йод, который при температуре реакции (около 700С) находится в виде паров. Для увеличения выхода продукта процесс повторяется несколько раз в результате циркуляции [29]. Недавно предложен метод получения [ПС]СН3І в один прием ("single-pass"), что позволяет достичь более высокой удельной активности [30] — принципиально важной характеристики в синтезе рецепторных радиолигандов [31]. В ряде случаев [пС]СНз1 переводят в [пС]СНзОТґ (метил трифлат), более эффективный метилирующий агент, реакции с которым протекают при комнатной температуре и при существенно более низких количествах исходных субстратов для метилирования, которые часто являются крайне дорогостоящими.
Этот метод, впервые предложенный в работе [32], наиболее широко используется для введения углерода-11 в метильную группу при N-, О- или S- атомах в составе различных органических молекул. Меченный углеродом-11 метил трифлат широко применяется в современных "on-line" технологиях получения РФП, где предшественник наносят на поверхность твердого носителя или просто вводят в петлю жидкостного хроматографа, куда затем поступает радиоактивный реагент в токе газа. Преимуществом "on-line" технологий является использование минимальных количеств реагентов, быстрота и простота автоматизации [33]. Огромные возможности реакции пС-метилирования для синтеза различных классов РФП продемонстрированы в недавнем обзоре [34]. Коммерчески доступны автоматизированные системы (синтезайзеры) для [пС]метилирования большого спектра соединений (например, TRACERlab FXC от GE). Другой широко применяемый способ введения метки углерода-11 в органические соединения основан на реакции [пС]С02 с реактивами Гриньяра или другими источниками карбанионов. Однако, существенным экономическим фактором, сдерживающим использование [ПС]РФП в клинической ПЭТ практике, является необходимость, вследствие малого периода полураспада, производить синтез[ С]РФП в непосредственной близости от места применения, иногда и непосредственно перед каждым ПЭТ исследованием. Таким образом, применение [ПС]РФП ограничено только ПЭТ центрами, имеющими циклотронно-радиохимический комплекс и соответствующий квалифицированный персонал. Фтор-18. Относительно небольшой период полураспада фтора-18 (109,8 мин.) позволяет получать ПЭТ изображения высокой контрастности при низкой дозовой нагрузке на пациентов. Низкая энергия позитронного излучения обеспечивает высокое пространственное разрешение ПЭТ изображений (Таблица 2.6). С другой стороны период полураспада фтора-18 достаточно велик, чтобы обеспечить возможность транспортировки [ И]РФП из централизованного места производства в клиники и институты, имеющие ПЭТ сканеры (т.н. концепция сателлитов, реализованная для [ Р]ФДГ). Другими преимуществами большего периода полураспада фтора-18 по сравнению с углеродом-11 являются возможность расширить временные границы ПЭТ исследования и синтеза РФП. В публикациях, посвященных разработке РФП для ПЭТ, с каждым годом стремительно возрастает доля статей посвященных новым [ Р]РФП. Наметилась тенденция поиска РФП, меченных фтором-18, являющихся аналогами уже апробированных [ПС]РФП. Освещению важнейших меченных фтором-18 РФП посвящен ряд обзорных статей [35, 36, 37] Однако создание РФП на основе фтора-18 сопряжено с рядом трудностей. Первым принципиальным моментом является то, что фтор не входит в состав эндогенных соединений и тем самым введение фтора в биологически активные соединения может неожиданным образом сказаться на их биохимических свойствах. Это связано с уникальными свойствами фтора как "модификатора" биохимических и физико-химических параметров биологически активных соединений [38, 39]: Хотя иногда такое изменение свойств может оказаться благоприятным.
Ароматическое нуклеофильное замещение как метод введения фтора-18 в арены
При нуклеофильном замещении атакующий реагент (нуклеофил) отдает субстрату свою электронную пару, с помощью которой образуется новая связь, а уходящая группа (нуклеофуг) отщепляется со своей электронной парой: В зависимости от структуры реагирующих соединений и условий проведения реакции механизм нуклеофильного замещения может быть различным [100]. Наиболее интересным с позиций синтеза [,8Р]РФП, является классический механизм ароматического нуклеофильного замещения, предложенный Баннетом и Миллером. Для его обозначения используют символы SivAr или SN pso [101]. Этот механизм включает две стадии: На первой лимитирующей стадии нуклеофил присоединяется к субстрату с образованием анионного интермедиата (а-анионного комплекса, получившего название комплекса Мейзенгеймера). Во второй, быстрой стадии происходит отщепление нуклеофуга. Необходимым условием для реализации классического механизма ароматического нуклеофильного замещения является наличие в ароматической системе уходящей группы и электроноакцепторных заместителей (EWG). Электроноакцепторные заместители, уменьшая электронную плотность в ароматической системе в целом и на атоме углерода, при котором протекает замещение, облегчают атаку нуклеофила. Кроме того электроноакцепторные заместители способны за счет отрицательных индуктивного и мезомерного эффектов стабилизировать переходный а-комплекс. Влияние EWG, обладающих отрицательным мезомерным эффектом, на скорость нуклеофильного замещения особенно существенно если они находятся, в орто- или гса/?а-положениях к уходящей группе. Сильное активирующее влияние оказывает атом азота в гетероциклических соединениях. В отсутствии подобной активации ароматическое нуклеофильное замещение (SNAr) сильно затруднено. Известно, что в бензольном ряду заместители обычно активируют замещение уходящей группы в следующем порядке: орто пара мета [102]. При этом степень активации зависит не только от электронных свойств заместителя, но и от пространственного влияния орто-заместителя.
Так, например, o-CN-rpynna вызывает меньшие стерические затруднения, чем о-гЮг-группа. На основании изучения кинетики реакции: в [103] приводится следующий ряд EWG в порядке убывания их активирующей способности: Z = -N2+, -rf{R)= (пиридин), NO, N02, -N= (пиридин), S02Me, NMe3+, CF3, CN, CHO, COR, Неактивированные EWG арены могут вступать в реакцию ароматического нуклеофильного замещения в форме л-комплексов с трикарбонилом хрома [104, 105, 106]: Согласно механизму S Ar скорость определяющей является стадия присоединения нуклеофила (а не разрыва связи с уходящей группой, как в, случае алифатического нуклеофильного замещения). Поэтому важнейшей характеристикой уходящей группы оказывается ее электроотрицательность. Чем более электроотрицательна уходящая группа, тем больший положительный заряд она наводит на атом углерода, при котором протекает замещение, облегчая тем самым атаку нуклеофила. В отличие от алифатического нуклеофильного замещения, энергия связи уходящей группы с субстратом не имеет решающего значения. Поэтому в качестве уходящей группы часто используются нитрогруппа, фтор и хлор. В Таблица 2,10 приведены некоторые физико-химические характеристики связей Аг-Х и уходящих групп X, где X=N02, F,.C1. Связь C-F намного короче, прочнее и менее поляризуема, чем связи C-NO2 и С-С1. Для групп NO2 и F характерен сильный полярный эффект (относительно большие ах и oF), но стерический эффект (Es) и эффект поляризуемости (аа) для группы N02 много больше, чем для F. Хлор наиболее поляризуем и наименее электроотрицателен среди названых заместителей. Эти характеристики уходящих групп X существенно влияют на их относительную подвижность в реакциях ароматического нуклеофильного замещения. Для большинства реакций ароматического нуклеофильного замещения ряд подвижности уходящих групп выглядит следующим образом: F N02 СІ [102]. Ароматическое нуклеофильное радиофторирование Ароматическое нуклеофильное замещение широко используется для синтеза РФП, меченных фтором-18. Для протекания ароматического нуклеофильного радиофторирования необходимо присутствие в ароматической системе сильных, электроноакцепторных заместителей (N02, СНО, COR, CN и т.п.) и уходящей группы (N02, F, CI, N+Me3). Для оценки реакционной способности соединений в ароматическом нуклеофильном замещении в ряде работ было предложено использовать химический сдвиг на спектрах 13С-ЯМР атома углерода, при котором протекает замещение [107, 108]. С-ЯМР химический сдвиг является чувствительным показателем электронной плотности на атоме углерода и характеризует электроноакцепторные свойства активирующих и уходящих групп. Как уходящие группы в синтезе меченных фтором-18 соединений широко применяются NO2, С1 и F. Превосходной уходящей группой является NMe3+. В статье [114] изучено использование в реакции ароматического нуклеофильного радиофторирования в качестве уходящих групп катионных функций NMe3+ и SMe2\ В то время как SMe2+ практически не замещалась на фтор-18, проведение конкурентных реакций показало (Таблица 2.13), что константы скорости замещения NMe+3 в несколько раз больше констант скоростей замещения NO2 группы в аналогичных соединениях.
Существенным преимуществом использования NMe3+ является то, что получающийся при замещении этой группы меченые фторароматические соединения могут быть легко очищены от веществ предшественников, в частности экспрессными методами твердофазной экстракции, поскольку различия в растворимости и липофильности между этими соединениями значительны. В качестве примера можно привести синтез этилового эфира 4-[18Р]фторбензойной кислоты, использующегося для получения меченных фтором-18 белков и пептидов [115]: Однако соли иодония являются относительно не стабильными соединениями, и применение этого метода для введения фтора-18 в более сложные соединения пока не известно. Реакции фтор-де-диазотирования как метод получения меченных фтором-18 аренов. Среди других механизмов ароматического нуклеофильного замещения в контексте синтетических подходов к получению фтораренов необходимо упомянуть о SNI механизме. В реакциях протекающих по этому механизму уходящая группа отщепляется на первой стадии с образованием карбокатиона (в форме тесной ионной пары с анионом диазониевой соли), который в свою очередь взаимодействует с нуклеофилом. Этот механизм реализуется только при использовании таких "хорошо уходящих" групп, как катион диазония (-N2 ) который отщепляется в форме молекулы азота. В синтезе фтораренов по реакции Бальца-Шимана термическому разложению подвергаются соли диазония с такими анионами, как BF4", PF6" , SbF6" или AsF6". Предложены методики in situ дедиазотирования при воздействии на ароматические амины изоамилнитрита в присутствии эфирата фторида бора [118] или по реакции с NOBF4 в СНгСЬ. Процесс разложения триазенов в пиридине с HF также протекает через промежуточное образование катиона диазония и приводит к образованию фтораренов. Фтордедиазотирование в мягких условиях с хорошими выходами можно проводить в ионных растворителях, представляющих собой соли имидозолиума и BF4" или PF6" [119]. Применение классической реакции Бальца-Шимана (термического разложения борфторидов диазония) для синтеза [18F]P OT ограничено низкими выходами, поскольку уже теоретически 75% фтора-18 остается в виде фторида бора, а на практике выходы не превышают 2-15%. Другим недостатком использования борфторидов диазония является то, что вследствие использования носителя удельная активность меченых продуктов оказывается низкой. В работе [120] было изучено фтордедиазотирование толуилдиазониевых солей с различными противоионами, не содержащими фтор. Лучшие результаты были получены с (2,4,6 -триизопропилбензил)сульфонатом:
Другие радиолиганды для БЗР в ядерной медицине
Среди других радиолигандов для БЗР необходимо упомянуть [ 1]йомазенил [148], обладающий высокой аффинностью к БЗР (14 нМ). Этот радиолиганд широко используется для исследования центральных бензодиазепиновых рецепторов методом ОФЭКТ. Как и [ С]флюмазенил, [ 1]йомазенил применяется в диагностике височной эпилепсии, обнаруживая пониженное накопление в эпилептических очагах. Применение ОФЭКТ с использованием [ 1]йомазенила рекомендовано в качестве уточняющего диагностического метода вместе с МРТ в случае трудноизлечимой височной эпилепсии [149]. В ряде работ [ 1]йомазенил был использован при исследовании больных ишемией, шизофренией, болезнью Ал ьцгеймера и другими нейрофизиологическими заболеваний заболеваниями. Для применения в ПЭТ йомазенил был помечен углеродом-11 [150, 151]. Были проведены сравнительные исследования с [1231]йомазенилом [152]. В недавней работе [153] сообщается о синтезе нового ОФЭКТ радиолиганда для БЗР - [99тТс]техмазенила. По данным этой работы [ Тс]техмазенил не накапливается в мозге мышеи и не связывается с бензодиазепиновыми рецепторами. Основным ограничением радиофармпрепаратов (РФП) на основе углерода-11 является малый период полураспада изотопа (Ті/2 = 20,4 мин). Это предъявляет жесткие требования как к времени проведения радиохимического синтеза, так и ПЭТ исследования. Альтернативой может служить использование аналогов, меченных более долгоживущим фтором-18 (Т/2=110 мин). Применение этого ПЭТ-радионуклида дает и дополнительные преимущества, такие, как возможность получения нескольких клинических доз дорогостоящих РФП в одном синтезе и их доставки в ПЭТ центры, не имеющие собственного циклотронно-радиохимического комплекса. [18Р]М-фторэтилфлюмазенил ([18Р]ФЭФ) - меченный фтором-18 аналог флюмазенила, был впервые предложен в 1990 году Moerlein S. и Perlmutter J. [154, 155]. Как показали доклинические и клинические исследования, і о 11 [ Р]ФЭФ уступает [ С]ФМЗ, обладая более низкой аффинностью к БЗР, более быстрой кинетикой выведения из организма и сложным метаболизмом[156, 157, 158, 159]. Другой радиолиганд для БЗР ([ Р]ФФМЗ) был синтезирован в одну стадию из тозильного предшественника [160], а также по реакции [ Р]фторэтилирования соответствующей кислоты [ Р]фторэтилбромидом [161].
Эксперименты по конкурентному вытеснению с использованием [3Н]ФМЗ показали, что [18Р]ФФМЗ (1С5о=3,5 нМ) обладает аффинностью сравнимой с [ПС]ФМЗ (1С50=2,8 нМ) [161]. Проведенные в этой же работе эксперименты на мышах и авторадиографические эксперименты показали, [18Р]фторфлюмазенил ([18Р]ФФМЗ) что кинетика биораспределения и метаболизма [ Р]ФФМЗ близка к [18Р]ФЭФ. Молекула флюмазенила содержит в своем составе атом фтора. Таким образом, введение радиоактивного фтора-18 в ту же позицию в молекулу флюмазенила не должно приводить к изменению биохимического поведения [ F]флюмазенила. Кроме того, разработанные фармакокинетические модели и накопленная для [пС]флюмазенила обширная база данных (более 500 публикаций) могут быть использованы и в ПЭТ исследованиях с [ Р]флюмазенилом. метки фтор-18 в молекулу флюмазенила путем нуклеофильного замещения фтора-19 или нитрогруппы показана в работе [162], где в качестве предшественника использованы непосредственно флюмазенил или его нитро-аналог, 8-нитро-имидазо[1,5-а][1,4]бензодиазепин-3-карбоксилэтиловый эфир (Ro 15-1344). В первом случае процесс радиофторирования представляет собой реакцию изотопного обмена 19F/18F. Для ее проведения авторами [15] была модифицирована широко распространенная методика [16] нуклеофильного фторирования с помощью реакционноспособного комплекса [К/К2.2.2] "Т\ в котором криптанд (криптофикс К2.2.2) координирует ион калия. Для большинства РФП для ПЭТ радиофторирование проводится в безводных апротонных растворителях (ацетонитрил, диметилсульфоксид, диметилформамид). В модифицированном варианте комплекс [К/К2.2.2] F", получали, минуя стадию предварительного удаления воды с помощью азеотропной отгонки с ацетонитрилом. Реакцию фторирования проводили, при высокой температуре и пониженном давлении в 2,4,6-триметилпиридине в качестве растворителя. В этих условиях, названных авторами "instant fluorination", реакция изотопного обмена протекала с эффективностью 44%. Более полных данных о радиохимическом выходе продукта и условиях его выделения из реакционной смеси в этом сообщении приведено не было. При использовании воды с малым процентом обогащения по кислороду-18 в мишени протекает побочная ядерная реакция 0(р,а) N. Поэтому перед началом эксперимента вода, получаемая из мишени после облучения, выдерживалась в течение 4-6 периодов полураспада азота-13 (40-60 минут; N, Ті/2 - 9,96 мин.). Начальная активность фтора-18 на начало эксперимента составляла 0,3-7,4 ГБк (3-200 мКи). Для получения радиофторирующих агентов было использовано две методики: а) Реакционноспособный фторирующий комплекс [К/К2.2.2] F" получали по методике используемой в ИМЧ РАН для синтеза [18Р]ФДГ [163]. Полученный в мишени радионуклид сорбировали на колонке с анионообменной смолой QMA, отделяя [,00]Н20. [,8F]фторид смывали с колонки 2 мл раствора, содержащего карбонат калия и криптофикс (К2.2.2) в эквимолярной пропорции (1/2) в смеси ацетонитрил/вода (96/4, v/v). Элюат, содержащий комплекс [К/К2.2.2]+ 18F\ упаривали досуха в токе азота. содержащий ацетонитрил и рассчитанное количество либо карбоната калия и криптофикса (К222), либо карбоната калия и краун-эффира, либо карбоната тетрабутиламония.
Полученный раствор упаривали досуха, добавляя в процессе упаривания щ, ацетонитрил для более глубокого удаления следов воды. Для проведения реакции к полученному безводному комплексу добавляли раствор реагентов. Все операции проводились с использованием лабораторного робота RB 86 (Anatech, Швеция) с рабочими станциями (Scanditronix, Швеция) или на Л специально собранной для этих целей экпериментальной установке, включающей: изготовленный по заказу нагревательный блок из алюминия с отверстием под реакционный сосуд и смотровым отверстием нагревательный элемент (220 В) микропроцессорный терморегулятор FGH СС8/232 газовую линию (N2) с регулятором потока Экспериментальная установка предусматривает возможность дополнительной установки блоков трех и двухходовых вентилей (Burkert) до #; 16 штук, управляемых с кнопочной консоли или с персонального компьютера платой ввода-вывода PCI 1672 (Advantage, Taiwan). Для управления вентилями с ПК на Visual Basic 6 (Microsoft) была написана программа под Windows 98/NT 3.2.1 Радиофторирование модельных соединений В качестве предварительных экспериментов перед проведением конкурентных реакций были изучены реакции радиофторирования ряда соединений. Процедура радиофторирования включала следующие стадии: $ Получение радиофторирующего агента: К полученному из мишени циклотрона водному раствору [l8F] фторид- аниона добавляли рассчитанное количество раствора тетрабутиламмония в 1- 2 мл ацетонитрила. При температуре 130 С в токе азота отгоняли растворители. Добавляли 2 мл ацетонитрила и проводили дополнительную « азеотропную отгонку следов воды. Полученный безводный фторирующий комплекс растворяли в известном объеме ДМФ. Радиофторирование: Из раствора [18Р]ТБАФ в ДМФ отбирали аликвоты, которые добавляли к раствору фторируемого соединения. Концентрация всех фторируемых соединений в реакционной смеси составляла 15 мМ. Измеренная во всех экспериментах активность реакционной смеси находилась в интервале от 0,1 ГБк (3 мКи) до Л ГБк (30 мКи). Реакционная смесь нагревалась до 130 С. Через 15 мин из реакционной смеси отбирались пробы (5мкл) для анализа. В заключении проводилось измерение активности реакционной смеси после реакции. С учетом распада фтора-18 потери активности во всех случаях не превышали 5%. Анализ: Анализ реакционной смеси проводился методом ТСХ и ВЭЖХ. ТСХ проводился на силикагелевых пластинках (ЛенХром, Россия). В качестве подвижной фазы использовалась смесь растворителей этанол/этилацетат (15/85).
Изучение реакции изотопного ' F/1 F-обмена в молекуле флюмазенила
В работе была сделана попытка проведения реакция радиофторирования солей диазония, представленных в Таблица 3.3. Соли диазония были синтезированы по реакции диазотирования из соответствующих анилинов (см. стр. 94). Перед каждым экспериментом по радиофторированию проводилась очистка солей диазония методом переосаждения: соль диазония растворяли в 2 мл ацетонитрила до насыщения; к отфильтрованному раствору по каплям добавлялся диэтиловый эфир до помутнения раствора; осадку давали отстояться; далее осадок отфильтровывали и сушили под вакуумом (5-10 мм рт. ст.) в течение 3-4 часов. Радиофторирование было изучено в ацетонитриле, ДМСО и ДМФ. В качестве межфазных катализаторов использовались криптат карбоната калия, комплекс краунэфира с карбонатом калия или тетрабутиламмоний карбонат. Состав элюентов, использованных для получения фторирующих комплексов, в расчете на соли диазония приведен в Таблица 3.4. К безводному радиофторирующему агенту добавляли раствор 8 мг соли диазония в 0,5 мл растворителя и поднимали температуру. Радиофторирование изучалось при различных температурах: 50С, 80С, 100С, 130С. Через 3, 5 и 10 минут на анализ отбирались пробы объемом 5 мкл. Анализ реакционной смеси проводился методом ТСХ и ВЭЖХ, с предварительной дериватизациеи соли диазония по реакции с йодидом калия или с ІУ.іУ-диметиланилином: ТСХ проводился на силикагелевых пластинках (ЛенХром, Россия). Составы использованных для элюирования подвижных фаз приведены в Таблица 3.5. Распределение соединений на пластинке определялось визуально для диазосоединений, и под УФ лампой для иодбензолов, положение меченых соединений определялось с помощью тонкослойного сканера с детектором по радиоактивности (MiniGita, Германия). Для ВЭЖХ анализа была использована обращеннофазовая жидкостная хроматография: насос Gilson 305, инжектор Rheodyne 7125, объем петли 20 мкл, ультрафиолетовый (УФ) детектор Gilson 116 (длина волны 254 нм) и детектор по радиоактивности Beckman 170, колонка Lichrosphere 100RP18e 250x4мм (Merck), подвижная фаза - 0.01М НЗР04/ацетонитрил (3/1).
Времена удерживания (RT) при потоке элюента 1 мл/мин для соединений приведены в Таблица 3.6. Соли диазония оказались чувствительными к криптанду К222 и ДМСО: при смешении растворов при комнатной температуре наблюдалось заметное разложение солей диазония с выделением азота и потемнение раствора. В растворах краунэфира с карбонатом калия и тетрабутиламмония в ДМФ и в ацетонитриле заметного разложения при комнатной температуре не наблюдалось. Однако при увеличении температуры выше 100С наблюдалось выделение азота. Меченые органические соединения были зафиксированы методом ВЭЖХ лишь в следовых количествах. По данным ТСХ их радиохимический выход был меньше 2-3%. 3.3 Изучение реакции изотопного 19F/8F-o6MeHa в молекуле флюмазенила В работе было изучено влияние на радиохимический выход реакции радиофторирования флюмазенила таких параметров как концентрация флюмазенила, растворитель, природа и концентрация радиофторирующего агента, растворителя, температуры, а также присутствия следов влаги и фтора-19 в форме фторид аниона. Также было проведено изучение химической кинетики изотопного 19F/18F-o6MeHa в молекуле флюмазенила. К полученному из мишени циклотрона водному раствору [l8F] фторид-аниона добавляли рассчитанное количество раствора тетрабутиламмония или криптата карбоната калия в 2 мл ацетонитрила. При температуре 130 С в токе азота отгоняли растворители. Добавляли 2 мл ацетонитрила и проводили дополнительную азеотропную отгонку следов воды. Полученный безводный фторирующий комплекс растворяли в известном объеме растворителя, в котором проводилась реакция (ДМФ, ДМСО, ацетонитрил). 3.3.2 Получение флюмазенила, меченного фтором-18 От полученного раствора радиофторирующего агента отбирали аликвоты и добавляли к раствору флюмазенила в том же растворителе. Перед проведением реакции смесь интенсивно перемешивалась. Проводилось измерение активности реакционной смеси до и после проведения реакции: начальная активность находилась в интервале от 0,1 ГБк (3 мКи) до 7,4 ГБк (200 мКи). Потери активности с учетом распада фтора-18 во всех случаях не: превышали 5%. Для проведения реакции температуру реакционной смеси поднимали до установленной (100-170 С). Варьировали такие параметры как растворитель, радиофторирующий агент, концентрация флюмазенила и температура. Выход радиофторирования флюмазенила определяли методом радиоТСХ как описано ниже: ТСХ реакционной смеси проводили на пластинках силикагеля с пластиковой подложкой «Сорбфил» («Ленхром»), в системе этилацетат/спирт/вода в объемном отношении (80/15/5). Распределение активности по пластинке измерялось с помощью радиоТСХ сканера MiniGita (Raytest, Германия). Коэффициенты распределения (Rf) для [ F]F" и [ F]OM3 составляли 0,05 и -0,75, соответственно.
Радиохимический выход определялся с помощью программы: MiniGita (Raytest, Германия), как отношение площади под пиком меченого соединения к общей активности. Результаты проведенных экспериментов представлены ниже: Анализ радиофторирования флюмазенила осуществляли методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для анализа из реакционной смеси отбирали пробу 5 мкл, которую растворяли далее в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ. Идентификация и анализ Г F]флюмазенила методом ВЭЖХ Идентификацию и анализ методом ВЭЖХ проводили с использованием следующего оборудования: насос Gilson 305, инжектор Rheodyne 7125, объем петли 20 мкл, ультрафиолетовый (УФ) детектор Gilson 116 (длина волны 254 нм) и детектор по радиоактивности Вeckman 170, при скорости потока 1 мл/мин. Для идентификации были использованы три различные ВЭЖХ системы: система I: колонка Lichrosphere 100 RP 18е (Merck) 250x4 мм, элюент -0.01М раствор фосфорной кислоты /ацетонитрил (3/1 по объему); система 2: колонка Silica (Whatman) 250x4 мм, элюент -дихлорметан/метанол/вода/триэтиламин (98/1,8/0,025/0,015 по объему); система 3: колонка SCX Supelcosil, 250x4 мм, элюент - 0.01М раствор фосфорной кислоты /ацетонитрил (3/1 по объему). Во всех системах достигалось разделение [ F]флюмазенила и меченых примесей, в то время как [ F]F" сорбировался на колонке. Времена удерживания меченого продукта и стандарта флюмазенила во всех использованных системах совпадали с точность до задержки между показаниями УФ детектора и детектора по радиоактивности (Таблица 3.11). Для проведения анализа реакционной смеси в дальнейших экспериментах использовалась хроматографическая система 1. 3.3.4 Изучение устойчивости флюмазенила в условиях нуклеофильного радиофторирования Для изучения устойчивости флюмазенила в условиях реакции был проведен ряд экспериментов. Навеска флюмазенила растворялась в ДМСО. Аликвоты раствора флюмазенила концентрацией «30 мМ были добавлены к высушенному азеотропной осушкой, как при радиоактивном синтезе, криптату карбоната калия. Полученные растворы перемешивались и нагревались в течение часа на масляной бане при температуре 130 и 160 С. Через определенные промежутки времени (15 и 30 мин.) из реакционных смесей отбирались пробы по 5 мкл, которые далее растворялись в 1 мл подвижной фазы и анализировались с использованием обращеннофазной ВЭЖХ (Lichrosphere 100 RP 18е (Merck), 0.01М Н3Р04/ацетонитрил 3/1). На Рисунок 3.2 приведены типичные хроматограммы, полученные при анализе реакционной смеси при Т= 130 С за 15 минут в отсутствии криптата карбоната калия (а) и четырехкратном увеличении его концентрации (Ь).
