Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Современная классификация микобактерий туберкулеза и их морфологические, культуральные и биологические свойства 10
1.2 Изменчивость микобактерий туберкулеза под действием физико химических и биологических факторов 20
1.3 Лабораторная диагностика туберкулеза и перспективы ее развития
1.3.1 Бактериоскопический метод исследования 25
1.3.2 Культуральный метод исследования 29
1.3.3 Идентификация микобактерий туберкулеза культуральным, биохимическим и биологическим методами 35
1.3.4 Полимеразная цепная реакция, ее применение для индикации и идентификации микобактерий туберкулеза 39
1.4 Заключение по обзору литературы 43
2 Собственные исследования
2.1 Материалы и методы исследований 43
2.2 Результаты исследований
2.2.1 Изучение влияния различных фитопрепаратов на скорость и интенсивность роста музейных и полевых культур микобактерий 49
2.2.2 Изучение влияния фитопрепаратов на скорость и интенсивность роста микобактерий туберкулеза из биологического материала от лабораторных животных 56
2.2.3 Изучение влияния фитопрепаратов на скорость и интенсивность роста микобактерий туберкулеза из биологического материала от крупного рогатого скота з
2.2.4 Испытание модифицированной питательной среды в сочетании с полимеразной цепной реакцией для индикации и идентификации микобактерий туберкулеза 67
3 Обсуждение результатов исследования 80
4 Выводы 87
5 Практические предложения 88
6 Библиографический список
- Лабораторная диагностика туберкулеза и перспективы ее развития
- Идентификация микобактерий туберкулеза культуральным, биохимическим и биологическим методами
- Изучение влияния различных фитопрепаратов на скорость и интенсивность роста музейных и полевых культур микобактерий
- Испытание модифицированной питательной среды в сочетании с полимеразной цепной реакцией для индикации и идентификации микобактерий туберкулеза
Введение к работе
Актуальность темы. Туберкулез крупного рогатого скота занимает особое место среди инфекционной патологии животных. Инфекция длительное время может протекать в латентной форме, не проявляя клинических признаков болезни, не влияя на продуктивность и жизнедеятельность животных. Быстро распространяясь среди поголовья животных, туберкулез искореняется с большим трудом.
В неблагополучных хозяйствах туберкулез крупного рогатого скота наносит значительный экономический ущерб владельцам животных и представляет большую опасность в заражении людей, организация мероприятий по борьбе с этим заболеванием была и остается актуальной проблемой.
Против туберкулеза животных пока не разработано эффективных средств специфической профилактики и лечения. Поэтому, основным звеном в проведении профилактических и оздоровительных мероприятий является своевременная и качественная диагностика.
Одним из основных диагностических подходов является обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в исследуемом диагностическом материале (бронхиальные смывы, мокрота, моча, кровь, лимфатические узлы, кусочки паренхиматозных органов и др.).
Наиболее эффективным методом выявления микобактерий на сегодняшний день является культуральный посев на питательные среды. Также в последнее время широкое развитие получил современный молекулярно-генетический метод – полимеразная цепная реакция (А.С. Донченко и др., 1994, 2004;
В.И. Голышевская, 1995; Л.А. Таллер и др., 1995; В.Г. Ощепков и др., 2001, 2009; Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов и др., 2002; Т.М. Shinnik, 1996).
Выделение микобактерий туберкулеза из патологического материала, в силу генетических и фенотипических особенностей возбудителя, связано с определенными трудностями – это медленный рост на искусственных питательных средах, способность к полиморфизму и длительной персистенции возбудителя в измененной форме (В.С. Федосеев, И.Н. Рубцова, А.Н. Байгазанов, 1988; О.А. Иртуганова, 2006).
В связи с тем, что туберкулез в настоящее время остается огромной проблемой человечества, усовершенствование лабораторной диагностики, направленное на повышение чувствительности известных традиционных методов и сокращение сроков исследования, за счет модификации существующих и разработки новых способов диагностики этого заболевания, является актуальной задачей.
Цель и задачи. Целью настоящей работы было усовершенствовать методы выделения и идентификации микобактерий туберкулеза из биоматериала, взятого от животных.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
-
-
-
Разработать питательную среду, позволяющую ускорить выделение и повысить высеваемость микобактерий туберкулеза из биоматериала от крупного рогатого скота.
Разработать метод ускоренного выявления микобактерий туберкулеза на основе комбинированного применения культурального метода и полимеразной цепной реакции.
Научная новизна.
Разработана плотная питательная среда, содержащая фитопрепарат – 10%-ный водный экстракт полыни – для ускоренной изоляции типичных и измененных микобактерий туберкулеза, повышающая высеваемость микобактерий из биоматериала животных на 30%. Получен патент
№ 2382076 «Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза» от 20 февраля 2010 г.Впервые разработан комбинированный культурально-генетический метод (КГМ), основанный на исследовании «слепых» смывов с поверхности питательных сред в ранние сроки культивирования методом полимеразной цепной реакции. Предлагаемый метод позволяет дополнительно выявлять труднорастущие и некультивируемые формы микобактерий, при этом значительно сокращая сроки исследования до 3-5 суток.
Практическая значимость и внедрение результатов исследований.
Повышение высеваемости микобактерий, выделенных из биоматериала от животных и сокращение сроков исследования, позволяет оперативно организовывать противотуберкулезные мероприятия в неблагополучных хозяйствах, а в случае исключения туберкулеза - предотвращать необоснованный убой здоровых животных.
Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций:
«Комплекс ускоренной дифференциальной диагностики туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота в благополучных хозяйствах», утвержденные секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области, протокол № 9 от 15.11.08;
«Методы ускоренного выявления типичных и измененных (L-форм) микобактерий туберкулеза», утвержденные секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области, протокол № 5 от 30.09.10;
Также материалы исследований использованы при проведении научно-исследовательской работы в ГНУ ВНИИБТЖ и учебном процессе Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ.
Апробация. Материалы исследований доложены на заседаниях ученого совета ВНИИБТЖ г. Омск (2006-2010г.), координационных совещаниях ВИЭВ
г. Москва (2006-2010г.), на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов Института ветеринарной медицины ОмГАУ (2008, 2010г.), на заседаниях совета молодых ученых ВНИИБТЖ (2006-2011 г.), на межрегиональных научно-практических конференциях ВНИИБТЖ (2007-2010г.), на международной научной конференции молодых ученых,
г. Новосибирск (2010г.). Основные положения диссертации, выводы и практические предложения доложены, обсуждены и рекомендованы к защите на межлабораторном заседании сотрудников ВНИИБТЖ (2011г.).Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 15 научных статей, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Ветеринария и кормление», «Достижения науки и техники АПК»).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 13 рисунками. Библиографический список включает 223 источника, в том числе 31 – иностранных автора.
Автор выражает искреннюю благодарность за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертационной работы и оказание научно-методической помощи кандидатам ветеринарных наук А.Д. Панкратовой и Е.Ю. Секину, а также сотрудникам лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Усовершенствованная плотная питательная среда, содержащая фитопрепарат, для ускоренного выявления микобактерий туберкулеза.
-
Разработанный метод диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с использованием полимеразной цепной реакции.
Лабораторная диагностика туберкулеза и перспективы ее развития
Со времен открытия «туберкулезной? палочки», морфологические, тинкториальные, культурально-биохимические, биологические и другие свойства микобактерий изучали М.К.. Юсковец (1948), И:С. Драбкина!(1963), ЮІК. Вейсфеллер (,1975); ЄЖ Прозоровский,. ЛІН. . Кац,. Г.ЯІ..Каган-- (1981), А.И: Кузин (1984 : Н:П: Овдиенко, ВЇИ; Косенке (1990), В-А. Пузанов; Г.М. Николаева: (1994); Л.А. Таллер: (1995) В;И; Голышевская- (1995); А;Лі. Гинцбург- (1997), Ю:А: Макаров.-. (1997), Е.Л( Головлев» (1998), А.Х. Найманов (2002)-." В.Г. Ощепков; (2001), Н:М1 Колычев (2001), Н.А. Донченко. (2001), А.С. Донченко (2004), Б.И Вишневский, и др. (2002); ШВ. Елисеева- и др. (2006);. B.R. Bloom (1992), F Coutlee et ah (1995); DIE. Caldwell; (jMi Wolfaardt, WiRL.. Korber, JiRi Lawrence: (1997), T.F.Byrd (1998), M;V. De Souza (2005); I. Trcka, J.Lamca (2005), M. Scopic, J.E. Shitaye (2007).
Несмотря на многочисленные исследования этих авторов, систематика туберкулезных и других кислотоустойчивых микобактерий остается, к сожалению; несовершенной. На сегодняшний день научная, классификация микобактерий неполностью учитывает их фенотипическое и генотипическое разнообразие.
Микобактерий относятся к прокариотам: в их цитоплазме нет высокоорганизованных органелл (митохондрий, аппарата Гольджи, лизосом), в геноме содержится более 4 млн. нуклеотидов и 4 тыс. генов; (Е.Г. Бочкарев, Т.С. Денисова и др., 2002; A. Weil, et al., 1996).
Морфология клеток зависит от условий обитания и культивирования микобактерий. Большинство, включая- М. tuberculosis, имеют сходные ( морфологические признаки: неподвижные, слегка изогнутые, не образующие спор или капсул палочковидные клетки размером 0,2-0,7 х 1,0-10 мкм, часто содержат одно или несколько кислотоустойчивых зерен. Концы слегка закруглены. Обычно они длинные и тонкие, но возбудители бьгаьего и птичьего видов более толстые и короткие по сравнению с М. tuberculosis.
В состав микобактериальной клетки входят: вода (85,9%), белки, углеводы, липиды и минеральные соли. Липиды составляют от 10 до 40% сухого вещества, растворимы в спирту, эфире и хлороформе. Белковый компонент - различные туберкулопротеины, составляющие 56% сухого вещества клетки. Туберкулопротеины подразделяются по физико-химическим свойствам на 3 типа: с высокой молекулярной массой (32000 - 44000) - хорошо растворимые, биологически активные; со средней молекулярной массой (16000) — менее растворимые, менее биологически активные; с низкой молекулярной массой (9000) — нерастворимые, наиболее тесно связанные с нуклеиновой кислотой, образующие комплексы - нуклеопротеиды. В состав туберкулопротеинов входят почти все известные аминокислоты.
В клетках микобактерий туберкулёза содержится до 15,3% углеводов, большей частью в виде полисахаридов, свободных и в соединениях с фосфатидами, белками.
Минеральные вещества в составе микобактериальной клетки составляют около 6% массы - это кальций, фосфор, магний, калий, железо, цинк и марганец, в основном в виде соединений (Н.М. Колычев, В.Г. Ощепков, 2001).
Микобактерий туберкулёза для синтеза белков клеточной мембраны, цитоплазмы и органоидов используют различные органические соединения, что указывает на их значительную и разнообразную ферментативную активность.
По типу дыхания микобактерий, как правило, аэробы, но в некоторых условиях их можно рассматривать, как факультативные анаэробы.
По данным таких авторов, -как М.И. Перельман, В.А. Корякин, И.В. Богадельникова (2004), внутриклеточное дыхание микобактерий осуществляется оксидоредуктазами. К этой большой группе окислительно 15 восстановительных ферментов относятся дегидрогеназы, оксидазы а также каталаза и пероксидаза. Особый интерес представляют каталаза и пероксидаза, поскольку от их ферментативной активности зависят такие биологические свойства микобактерий туберкулёза, как вирулентность, и лекарственная устойчивость к препаратам группы гидразидов изоникотиновой кислоты. Так как, у всех аэробных микроорганизмов завершающим продуктом окислительно-восстановительных процессов является перекись водорода, каталаза расщепляет перекись водорода на; воду и: кислород, а пероксидаза катализирует окисление перекисью водорода ряда фенолов и ароматических аминов.
Характерным родовым; признаком;микобактерий: являетсяіустойчивость к действию кислот, щелочей ; и спиртов І что обусловлено! значительной толщиной и особым; строением многослойной оболочки микробнойтслетки. Иод наружной мембраной из гликолипидов располагается слой миколовых кислот, связанных с молекулами Сахаров; и белков, далее - слой из пептидогликана и белков,, а поперек все слои клеточной стенки прошивают молекулЫ Липоарабиноманнана.
Высокое содержание; липидных комплексов в клеточной стенке, из которых:- наиболее важным химическим компонентом является миколиларабиногалактан, обеспечивает гидрофобный барьер, препятствующий проникновению обычных красителей (Ю К. Вейсфейлер, 1975).
Кислотоустойчивость микобактерий выявляется путем микроскопии при окраске мазков по методу Циля-Нильсена. Если микобактерий, прокрасить с помощью специальной процедуры окраски- карболовым фуксином, который проникает в клетку и связывается с миколовыми кислотами внешней:оболочки, увеличивая ее гидрофобность и препятствуя выходу красителя из клетки, то они уже не теряют окраску, даже при обесцвечивании смесью кислоты и спирта. Из-за этого свойства оболочки, клетки, микобактерий; называют кислотоустойчивыми.
Идентификация микобактерий туберкулеза культуральным, биохимическим и биологическим методами
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных (ГНУ ВНИИБТЖ) в лаборатории клеточной биотехнологии (2006-2008гг.); в лаборатории эпизоотологии и спецпрофилактики туберкулеза животных (2009-2010гг.), часть исследований выполняли в лаборатории диагностических исследований в соответствии с заданием 08.01.04 «Создать систему иммунной защиты крупного рогатого скота от туберкулеза с применением молекулярных вакцин. Выявить молекулярно генетические аспекты паразито-хозяинных отношений при туберкулезе животных и обосновать ускоренную диагностику с учетом изменчивости свойств возбудителя».
Биологический материал для исследования отбирали в хозяйствах Омской, Новосибирской, Челябинской областей с различным эпизоотическим состоянием по туберкулезу животных, а также на мясокомбинате МПЗ «Компур» г. Омска и мясокомбинате г. Калачинска в период с 2006 по 2010 гг.
Для проведения лабораторных исследований был отобран биологический материал — лимфатические узлы (заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные, портальные, мезентеральные) и кусочки паренхиматозных органов (печень, селезенка) от 311 голов крупного рогатого скота, положительно реагировавших на ГШД-туберкулин. Для эксперимента на лабораторных животных использовали 25 морских свинок живой массой 250-300 гр., содержащихся в виварии с соблюдением надлежащих норм кормления и содержания (Ф.З. Андросов, ИІЯ. Беляев, Р.Т. Клочко,1981).
Кроме этого, для исследования были использованы коллекционные, официально зарегистрированные штаммы культур: М. bovis шт.8, М. avium шт. 9 (получены в 1986 году в Государственном научно-контрольном институте), а также М. bovis шт. 14, M.intracellulare (получены в 1986 году - в лаборатории специфической профилактики туберкулеза ВНИИБТЖ).
Бактериологические исследования, включающие бактериоскопический метод, культуральный посев, биопробу на лабораторных животных проводили в соответствии с нормативно-технической документацией: «Наставление по диагностике туберкулеза животных» (2002г.); Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.32322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», введ. 2008-05-01; Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза, приложение №11 к приказу «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в РФ» от 21 марта 2003г. №109; Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.32322-08 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности»; ЮМУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности», 2004; МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», 2009.
Предпосевную обработку биологического материала от лабораторных животных и крупного рогатого скота проводили по методу Гона в модификации Левенштейна-Сумиоши (Наставление по диагностике туберкулеза животных, 2002).
Для сокращения сроков выделения микобактерий из биологического материала от животных нами сконструированы 4 варианта питательных сред с использованием биологически активных добавок растительного происхождения.
За основу взяты стандартные плотные яичные среды Левенштейна-Иенсена и Фаст-ЗЛ, как наиболее часто используемые в бактериологической диагностике туберкулеза животных.
В качестве ростостимулирующих добавок изучали 10%-ные водные экстракты, полученные из сухого растительного сырья (семейство астровых Asteraceae, род полыней Artemisia) и препарата медицинского назначения Лив-52.
Трава полыни содержит эфирное масло, горькие гликозиды - анабсинтин, абсинтин, органические кислоты, аскорбиновую кислоту, витамины группы В, К, каротин, флавоноиды, крахмал, смола, соли разных кислот, белок, небольшое количество дубильных веществ.
Главными составными частями эфирного масла полыни являются терпеновый алкалоид туйол и кетон туйон, азулен и лактоны артабин и арабсин, а также фитонциды (R.K. Лавренов, F.B. Лавренова, 1999; Г.А. Непокойчицкий, 2007).
Лив.52 — содержит активные ингредиенты таких лекарственных трав, как Capparis spinosa (Каперсы колючие), Gichorium intybus (Цикорий обыкновенный), Mandur bhasma (железа оксид), Solarium nigrum (Паслен черный) Terminalia arjund (Терминалия аржуна), Cassia occidentalis- (Кассия западная) Achillea millefolium (тысячелистник обыкновенный) Tamarix gallica (Тамариск, гальский), обработанные над паром. Обладает антиоксидантними, и мембраностабилизирующими свойствами. Это комбинированный медицинский препарат растительного происхождения; снижает деградацию, клеточных мембран, обусловленную? перекисным окислением- липидов; повышает концентрацию1 антиоксидантові предотвращает формирование радикальных дериватов.
Для; приготовления; экстрактов; растительные компоненты заливали дистиллированной водой; из расчета Г:5 и автоклавировали при 1 атмосфере в, течение 30 минут. Затем экстракт фильтровали через несколько слоев! марли, доводили полученный- объем до 100 мл и повторно автоклавировали при 0;5 атмосферах- в; течение 15 минут. Соблюдая? все правила: асептики, готовый стерильный экстракт добавляли к стандартным питательным средам в;дозах 0,1; 0,2; 0,3 мл на 5: мл.среды, оставляли; в, термостате при; 37С для- исключения прорастания посторонней микрофлоры.
Изучение влияния различных фитопрепаратов на скорость и интенсивность роста музейных и полевых культур микобактерий
Проанализировав данные научных трудов опубликованные российскими и зарубежными учеными в различных изданиях, следует отметить, что в настоящее время против туберкулеза нет достаточно эффективных средств лечения и специфической профилактики, поэтому одним из приоритетных направлений в борьбе с этой патологией является своевременное выявление больных туберкулезом и точность в постановке диагноза. Достижение этого возможно в основном за счет качественной и быстрой диагностики.
Несмотря на значительные успехи-в борьбе с туберкулезом, эта проблема все еще остается актуальной и требует особого внимания, так как обусловлена опасностью заражения животных и людей (A.M. Смирнов, 1999; М.В. Шилова, Т.С. Хрулева, 2005; Э.Б. Цыбикова, И.М. Сон, 2007; В.Н. Ласкавый, О.М. Демидова, 2009; I. Pavlik et al., 1999).
Одним из основных диагностических подходов является обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в исследуемом биологическом материале (бронхиальные смывы, мокрота; моча, кровь, лимфатические узлы, кусочки паренхиматозных органов и др.).
Из,всего5разнообразия существующих методов выявления-микобактерий на сегодняшний день основными являются культуральный посев на питательные среды и биологическая проба на лабораторных животных (Т.Ю. Салина и др., 2000).
В связи с постоянно меняющимися условиями окружающей среды, а также под влиянием различных химических веществ (химиопрепараты, антибиотики, дезинфектанты) и физических факторов микобактерий туберкулеза настолько изменяют метаболизм, что многие штаммы снижают или теряют свою вирулентность и способность к размножению на питательных средах. Наблюдается снижение высеваемости микобактерий даже из биоматериала с явными туберкулезными поражениями (И.Р. Дорожкова, З.М. Кочемасова, М.М. Дыхно, 1984; А.Г.Хоменко, 1995; E.F. Бочкарев, Т.С. Денисова и др., 2002; В.А. Краснов, И.Г. Урсов, 2004). Проблема изменчивости микобактерий на сегодняшний день является актуальной и имеет определяющее значение при выборе терапевтических и диагностических подходов.
В последнее время в комплексе мер борьбы с туберкулезом фтизиатрами широко применяется фитотерапия.
Исследователями изучено около 2526 растений и установлена туберкулостатическая активность хинонов, алкалоидов, лактонов и эфирных масел, содержащихся в них. Антиоксидантные компоненты растений представлены азуленом, комплексом ферментов, витаминов, микроэлементов и минеральных солей (Н.В. Казаринова, К.Г. Ткаченко, 2000; А.Г. Гарифулов, 2006; Н.Х. Седых, О.В. Авдонина, 2007; A.M. Убайдуллаев, Ф.К. Ташпулатова, 2008).
Экспериментально и клинически доказано, что биологически активные вещества, содержащиеся в ряде лекарственных трав, препятствуют перекисному окислению липидов, обладают мембраностимулирующим действием и выраженными антиоксидантными, свойствами, а также оказывают положительное влияние на устранение некоторых сопутствующих туберкулезу симптоматических расстройств (ОЩ. Барнаулов, 1999; F.K. Никонов, Б.М. Мануйло, 2005; Е. Sherry, P.N. Warnke, 2004).
Высокий терапевтический эффект при лечении туберкулеза легких оказывают эфирные масла мяты перечной, полыни, солянки холмовой, софоры японской и др. (Т.И. Виноградова, 1996; М.Ю. Сафонова, 1997; В.А. Шкурупий, Г.А. Мостовая и др., 2002; В.А. Шкурупий, О.А. Одинцова и др., 2006).
Механизм действия эфирных масел ряда растений заключается в снижении проницаемости и деструкции цитоплазматических мембран и интенсивности метаболизма, а также в уменьшении активности аэробного дыхания микроорганизмов.
Наряду с бактериостатическими свойствами растений в биологии, медицине и ветеринарии также имеются данные о влиянии растений на стимуляцию роста микроорганизмов in vitro. H.F. Баронец (2004) отмечает выраженное стимулирующее: влияние водных экстрактов из корней алтея и солодки, травы фиалки и пастушьей сумки, слоевищ морской капусты, экстрактов топинамбура и белокочанной капусты, на рост микроорганизмов. Автор также сообщает о синергичном влиянии комплексов из лекарственных растений: алтей-зверобой алтей-шиповник, зверобой-календула алтей-календула-череда, - имеющих в, своем составе
B.W. Катола, Н.Ю. Леусова (2010) сообщают о влиянии водного экстракта сухих семян и стеблей растения паразита-повилики японской на рост микобактерий туберкулеза. Этими же авторами на основе исследований: была создана питательная среда для выращивания микобактериштуберкулеза:
G целью повышения качества питательных сред многие исследователи предлагают использовать биодобавки растительного происхождения;
В лаборатории по разработке мер борьбы- с туберкулезом; сельскохозяйственных животных ИЭВСиДВ; GO РАСХН ВН: Донченко, С.В; Иониной, (2002) была разработана.питательная среда для культивированиях микобактерий- туберкулеза, сокращающая : сроки первичного роста микобактерий; на 5-8? суток; (Патент №2192472);: В; состава среды» входит минеральный комплекс, представляющий собой вытяжку из; золы древесины. березы 1,5%гй концентрации, содержащей все необходимые ДЛЯЇ питания микобактерий макро- и микроэлементы и 0,1%-й оксидат торфа,,являющийся биостимулятором роста микобактерий туберкулеза:.
Казиахмедов;Э. А. Вердиева (2004) модифицировали питательную среду Финн-2, путем добавления дрожжевого аутолизата, смеси н-алканов; и картофельного экстракта (Патент №221;5039). Модифицированная среда позволяет повысить частоту выделения, микобактерий1 из биоматериала животных на 1650%f и ускоряет рост микобактерий. при-первичном (выделении на 16-18 сутки (З.А. Казиахмедов, 2004).
ОЛЕ. Кузнецов, И.С. Гельберг (2004) сообщают о создании яично-овощной плотной: питательной среды (Кузнецова); разработанной? на базе среды Левенштейна-Йенсена, со значительным уменьшением (в 2,5-3,5 раза) стоимости за счет замены дорогостоящих ингредиентов добавлением отваров овощей. В качестве белковой основы используются яйца и отвар белой фасоли, в качестве углеводсодержащего компонента - отвар картофеля, источника витаминов — отвар моркови.
В.Г. Ощепковым, Л.А. Таллер, Е.Ю. Секиным (ГНУ ВНИИБТЖ), совместно с А.А Петровым, Л.В. Галатовой, Т.Д. Абдырамановой (УГАВМ) была разработана композиция для приготовления питательной среды (Пат.№2332452), представляющая собой 10%-ный раствор фитопрепарата «Люцэвита» - экстракта люцерны, содержащей большое количество аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов, карбоновых и фенолкарбоновых кислот. Раствор препарата «Люцэвита» добавленный в питательную среду Фаст-ЗЛ обогащает ее состав и благотворно влияет на рост и размножение патогенных микобактерий, повышая их биохимическую активность. При посеве проб биоматериала (лимфатические узлы, молоко) на среду Фаст-ЗЛ с добавлением фитопрепарата «Люцэвита» выделяемость микобактерий из молока повышается до 61,5%, а из лимфоузлов — до 88,8%, пр№ выделении на контрольной среде 42 ,3%-66,7% соответственно (Т.Д. Абдыраманова и др., 2008): Перед нами была поставлена цель - усовершенствовать методы выделения и идентификации микобактерий туберкулеза из биоматериала, взятого от животных.
Испытание модифицированной питательной среды в сочетании с полимеразной цепной реакцией для индикации и идентификации микобактерий туберкулеза
Проведенные опыты по изучению влияния модифицированных питательных сред на скорость и интенсивность роста как патогенных, так и «атипичных» микобактерий показали, что внесение биологически активных добавок растительного происхождения в плотные питательные среды, даже такие многокомпонентные, как Левенштейна-Иенсена и Фаст-ЗЛ, способствует сокращению сроков появления первичного роста микобактерий, особенно патогенных, как известно медленнорастущих.
Также были проведены опыты по изучению влияния модифицированных сред на выделяемость, скорость и интенсивность роста микобактерий при культивировании их из биоматериала от лабораторных животных и крупного рогатого скота из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу.
Исследования показали, что растительные добавки (10%-ный водный экстракт полыни и «Лив-52»)- оказывают стимулирующее влияние на рост микобактерий из биологического материала от животных. Наиболее эффективной и информативной по нашим данным оказалась питательная среда Вариант-2 (Левенштейна-Йенсена+10%-ный экстракт полыни).
Наряду с усовершенствованием питательных сред нами был разработан и апробирован культурально-генетический метод (КГМ) для индикации и идентификации микобактерий.
Как известно, молекулярно-генетические методы диагностики не -могут расцениваться как замена традиционной бактериологии, поскольку каждый метод исследования образцов имеет свои неоспоримые ограничения и достоинства (О.А. Иртуганова, 2006).
Однако единственным методическим подходом, способным доказать наличие в образце некультивируемых форм возбудителя, при отсутствии роста колоний на пробирках с питательной средой, является полимеразная цепная реакция (М.Ю. Аксенов, А.Л. Гинцбург, 1993).
Современная диагностика туберкулеза, по мнению многих исследователей должна разумно сочетать традиционные и новейшие технологии с целью получения быстрого и точного результата анализа, что соответствует задачам по контролю туберкулеза (К.А. Тургенбаев, 2005; О.А. Иртуганова, 2006; А.Н. Жанузаков, СТ. Даугалиева, 2006; М.С. Калмыкова, А.Х. Найманов, 2008; PJ. Sykes, 1995; S. Tyagi, F.R.Kramer, 1996).
Предлагаемый нами культурально-генетический метод основан на .сочетании культурального посева биоматериала от животных на модифицированные питательные среды, ускоряющие рост микобактерий туберкулеза с последующим исследованием смывов с поверхности этих сред методом полимеразной- цепной реакции первоначально с использованием комплексной тест-системы, например, «МТБ-КОМ» производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии для одновременного выявления патогенных микобактерий (М. tuberculosis +М. bovis). При необходимости дифференциации этих видов вТТЦР используют тест системы с моновидовыми праймерами: M.tuberculosis, M.bovis («МТБ-ДИФ» — тест-система для выявления и дифференциации возбудителей туберкулеза M.bovis и М. tuberculosis методом полимеразной цепной реакции, производства ВГНКИ-ЦНИИЭ- г.Москва; «МИКО-ГЕН» — набор реагентов для выявления ДНК микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов (Mycobacterium tuberculosis-Mycobacterium bovis complex) и дифференциации Mycobacterium tuberculosis от Mycobacterium bovis complex методом полимеразной цепной реакции, производства ООО «НПО ДНК-Технология», Россия Московская область г. Протвино и др.).
Проведенные нами исследования подтверждают результаты, полученные А.Х. Наймановым, Н.П. Овдиенко, Е.П. Осиповой и др. (2004), которые при исследовании в.ПЦР суспензий патматериала от экспериментально зараженных M. bovis телок возбудитель туберкулеза не обнаружили ни в одном случае, однако при культуральном посеве на питательных средах отмечался слабый рост культур микобактерий. Учитывая это, после окончания срока наблюдения в ПЦР исследовали верхний слой ранее засеянной питательной среды в случаях, когда визуально не обнаруживали рост колоний культур микобактерий. Во всех пробах (100%) инфицированных особей обнаружили М. bovis, в контрольных пробах возбудитель туберкулеза не найден.
Также Л.Н.Черноусовой, Е.Е. Ларионовой и др. (2000) был проведен эксперимент с 19 образцами мокроты от олиго- и абациллярных больных (по бактериоскопии). Результаты показали, что на плотной питательной среде Левенштейна-Иенсена с использованием системы ВАСТЕС ТВ 2 образца вообще не дали роста, а 17 - дали рост на 30-60 сутки с момента посева. В системе MGIT (с использованием жидкой питательной среды) — рост отмечался с 16-30 сутки. Выявление ДНК микобактерий методом ПЦР дало положительный результат только у 9 больных в исходном диагностическом материале (мокрота). После подращивания мокроты на жидкой питательной. среде в системе MGIT с последующим отбором проб и определением в них ДНК микобактерий методом ПЦР регистрировались положительные результаты у остальных 10 пациентов,,начиная с 3 по 18 сутки со дня посева на MGIT.
Однако существенное отличие нашего метода заключается в минимизации сроков исследования. Культурально-генетический метод позволяет уже на 3 сутки получить достоверный результат.
Нами был проведен ряд экспериментов, в которых были исследованы культуры референтных штаммов М. bovis, а также биоматериал от лабораторных животных и крупного рогатого скота из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу. Суспензии, приготовленные из биологического материала, высевали на модифицированные питательные среды, содержащие ростостимулирующие фитопрепараты. Уже на 3 сутки культивирования, когда визуально рост культур не регистрировался, были приготовлены смывы с поверхности ранее засеянных питательных сред и исследованы в ПЦР.
Результаты опытов показали информативность предлагаемого метода: он обладает высокой чувствительностью и специфичностью, а также имеет неоспоримые преимущества по срокам диагностики, сокращая их до 3-5 суток.
Похожие диссертации на Усовершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота
-
-
-
