Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Характеристика возбудителя некробактериоза 9
1.1.1. Морфология Fusobacterium necrophorum 9
1.1.2. Культуральные и биохимические свойства 12
1.2. Диагностика некробактериоза 14
1.3. Полимеразная цепная реакция. 15
1.3.1. Выделение ДНК 15
1.3.2. Подбор праймеров 17
1.3.3. Постановка полимеразной цепной реакции 18
1.4. Гнездовая ПЦР (nested PCR) 21
1.5. Исследование геномного полиморфизма BRAPD-ПЦР 22
1.6. Заключение по обзору литературы 30
2. Собственные исследования 33
2.1. Материалы и методы исследования 33
2.2. Результаты исследований 37
2.2.1. Изучение геномного полиморфизма F. necrophorum subsp. necrophorum с помощью RAPD-PCR-анализа 37
2.2.1.1. Усовершенствованние методики выделения ДНК из культур F. necrophorum и биообразцов с помощью цетриламмония бромид (СТАВ) 37
2.2.1.2. Проверка чистоты выделенной ДНК 39
2.2.1.3. Выбор произвольных праймеров и проведение RAPD-PCR 39
2.2.2. Исследование патогенности культур Fusobacterium necrophorum на лабораторных животных 52
2.2.3. Генетическая характеристика культур Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum
2.2.4. Оптимизация гнездовой ПНР
2.2.5. Разработка совмещенной гнездовой ПНР
3. Обсуждение результатов исследований
4. Выводы
5. Практические предложения
6. Литература
7. Приложение
- Диагностика некробактериоза
- Постановка полимеразной цепной реакции
- Изучение геномного полиморфизма F. necrophorum subsp. necrophorum с помощью RAPD-PCR-анализа
- Генетическая характеристика культур Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum
Введение к работе
Актуальность проблемы. Некробактериоз - инфекционное заболевание домашних животных, проявляющееся гнойно-некротическим поражением различных тканей и органов. Болезнь встречается у многих видов диких животных, болеет им также человек. Возбудитель заболевания - Fusobacterium necrophorum (Е.А. Бобылева, 1940; О.И. Соломаха, 1973; А.А. Самоловов, 1986; L.H. Hagelskjaer et al., 1998).
Болезнь распространена во многих странах Европы, Северной Америки, Южной Африки, в Австралии (A.L. Lundstrom, 1981; A.M. Russell et al., 1982). В нашей стране некробактериоз регистрируется почти повсеместно, наблюдается у разных видов животных, но чаще среди северных оленей и рогатого скота (В.М. Львов, 1971; О.И. Соломаха, 1972). Болезнь причиняет экономический ущерб за счет снижения многих показателей, в т.ч. молочной продуктивности на 5-25%, интенсивности роста на 25-40% (Ю.Г. Анакина, 1988).
Для профилактики заболевания особое значение имеет достоверный и своевременный диагноз. Для его постановки применяют многочисленные методы: эпизоотологический, клинический, бактериологический, биологический, патологоанатомическое вскрытие. В настоящее время наиболее чувствительным и специфичным признан метод, основанный на выявлении фрагментов генома возбудителя в биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции. Необходимо отметить, что этот метод позволяет обнаружить концентрацию возбудителя в несколько раз меньшую, чем при традиционном бактериологическом исследовании. Это часто приобретает определяющее значение при постановке диагноза, так как в гнойно-некротическом очаге присутствует ассоциация микроорганизмов, а
непосредственно возбудитель заболевания Fusobacterium necrophorum находится в небольшом количестве.
ПЦР является методом прямого тестирования, позволяет избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами, и интепритация его результатов не зависит от иммунологического состояния организма (U. Landegren et al., 1988; М.Ю. Аксенов, А.Л. Гинцбург, 1993; К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун, 2000; Ю.А. Алтухов, Е.А. Салменкова, 2002; И.Ф. Жимулёв, 2006).
Приступая к разработке диагностической тест-системы мы столкнулись с
тем, что в отечественной литературе не описано ни одного штамма
Fusobacterium. О.И. Соломаха и соавт. (2000) в своих работах так же отмечали
отсутствие эталонных штаммов-референтов подвидов Fusobacterium
necrophorum.
Развитие молекулярной биологии и генной инженерии дало возможность создать методы, позволяющие оценивать генетическое разнообразие, устанавливать степень родства и выявлять индивидуальные особенности организма при анализе ДНК.
В настоящее время во всем мире широкое распространение получила
технология полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выявления
генетического полиморфизма у разных групп организмов она широко используется с короткими в 10-15 нп праймерами со «случайной», произвольно выбранной последовательностью - RAPD-анализ (random amplified polymorphic DNA) (С.А. Булат и соавт. 1992; И.А. Шагинян, А.Л. Гинцбург, 1995; J.G.K. Williams et al., 1993).
Метод RAPD-маркеров позволяет получать большое число маркеров, рассеянных по всему геному, поэтому такие маркеры удобны для построения генетических карт (Ю.П. Алтухов, Е.А. Салменкова, 2002) или карт сцепления
с локусами количественных признаков, т.е. локусами хозяйственно важных свойств.
В нашей стране и за рубежом длительный поиск специфических препаратов в виде вакцин и гипериммунных сывороток не принес должного результата. В настоящее время имеются экспериментальные и принятые к применению вакцины против некробактериоза, которые в производственных условиях не всегда дают желаемый результат (А.А. Самоловов, СВ. Лопатин 2001; СВ. Лопатин, Т.М.Магерова, 2004).
А.С Донченко, А.А. Самоловов (1998) высказали мнение, что создание при некробактериозе высокоэффективных вакцин традиционными методами маловероятно. В то время под традиционными методами понималось следующее. Выделение изолята в данном регионе, изучение его свойств, приготовление вакцины из монокультуры и применение ее в этом регионе. При использовании ее в других регионах она не оказывала должного профилактического эффекта.
Ряд отечественных исследователей (О.И. Соломаха и соавт., 2000; О.И.
Соломаха, Л.В. Кириллов, 2001) сообщали, что в неудачах, которые долгое
время сопутствовали работе по созданию специфических средств
профилактики некробактериоза, имело немаловажное значение игнорирование авторами неоднородности эпизоотических штаммов Fusobacterium necrophorum. Цель и задачи исследований. Цель работы — изучить геномный полиморфизм Fusobacterium necrophorum и усовершенствовать диагностику некробактериоза животных путем оптимизации условий проведения и модификации гнездовой ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать RAPD-ПЦР и изучить геномный полиморфизм культур Fusobacterium necrophorum.
Усовершенствовать методику выделения геномной ДНК Fusobacterium necrophorum.
Оптимизировать условия проведения и модифицировать гнездовую ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum.
Научная новизна. Разработана RAPD-ПЦР и выявлено генетическое разнообразие культур Fusobacterium necrophorum. Усовершенствована методика выделения геномной ДНК и модифицирована диагностическая тест-система для выявления патогенных Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum. Оптимизированы условия проведения совмещенной гнездовой ПЦР.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как на основе разработанной RAPD-ПЦР проведено генетическое маркирование Fusobacterium necrophorum, оптимизированы условия проведения гнездовой ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum и разработана ее модификация путем совмещения двух реакций с наружными и внутренними праймерами в одной пробирке. Получен патент № 2203951 «Способ выявления Fusobacterium necrophorum в гнездовой ПЦР».
На основании результатов генетических исследований подтверждена принадлежность культур № 8 и № 12 к подвиду necrophorum. Культуры депонированы как штаммы Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum под номерами В-1075 и В-1076 от 08.09.2005. На одну из них получен патент № 2347806 «Штамм бактерий Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum для изготовления диагностических и профилактических препаратов против некробактериоза животных».
Апробация полученных результатов. Материалы диссертационной работы доложены на заседаниях Ученого совета ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (г. Новосибирск, 2003-2009), международной научно-практической конференции
«Современное состояние и актуальные проблемы развития ветеринарной науки и практики» (г. Алмааты, 2005), научно-практической конференции, посвященной 45-ю ГНЦ НИИ ветеринарии Восточной Сибири СО РАСХН «Состояние и перспективы ветеринарного благополучия Восточной Сибири» (Чита, 15-16 сент. 2008г), 8-й межрегиональной научно-практической конференции «Патология продуктивных и непродуктивных животных, рыб и птиц» (г. Омск, 2009).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 6 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Доклады Россельхозакадемии», «Ветеринарная патология»).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 10 таблицами. Список литературы включает 208 источников, в том числе 110 зарубежных.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Усовершенствованная методика выделения геномной ДНК Fusobacterium
necrophorum.
Результаты исследований по разработке RAPD-ПЦР и изучению геномного полиморфизма Fusobacterium necrophorum.
Результаты исследований по оптимизации условий проведения и модификации гнездовой ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum.
Диагностика некробактериоза
Диагноз на некробактериоз ставят на основании клинических, эпизоотологических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований.
Лабораторное исследование на некробактериоз включает микроскопию мазков из патологического материала, посевы на питательные среды и заражение лабораторных животных (Методические указания по лабораторной диагностике некробактериоза, 1987). Для бактериологического и биологического исследований отбирают пробы патологического материала, в которых при микроскопическом исследовании обнаруживают бактерии, морфологически сходные с возбудителем. В случае их отсутствия составляют от одного животного одну общую пробу.
Лабораторные методы диагностики имеют свои минусы. Так, из очагов поражения, наряду с F. necrophorum, обладающей вирулентностью, выделяют и не вирулентные, находящися в рубце, а также атипичные формы F.necrophorum, которые никогда не вызывают заболевание (T.Shinjo, S.Miyazato, 1981; T.Shinjo, S.Miyazato, H.Kiyoyama, 1988; T.Shinjo, K.Hiraiwa, S.Miyazato, 1990). По морфологическим признакам все очень схожи (А.Г.Маслухина, 1974).
Одновременно выделяется сопутствующая микрофлора: не идентифицированные анаэробы, морфологически подобны возбудителю некробактриоза крупного рогатого скота, а также стафилококки, стрептококки, микрококки, синегнойная и кишечная палочки и другие микроорганизмы. Поэтому выделить возбудителя заболевания сложно. Кроме того, при постановке биопробы нами было выяснено, что белые мыши, наряду с возбудителем некробактериоза, также чувствительны и к сопутствующим анаэробам (И.М.Голосов,1969; Д.А.Хузин,2002). В целом на постановку диагноза затрачивается 12-15 суток, а в случае значительного обсеменения биологических образцов вульгарной микрофлорой этот период увеличивается.
Многие исследователи (А.Г. Ревнивых, 1940; Е.П. Пушменков, 1941; И.В.Захаров, 1949; Е.В.Козловский, 1972; А.А.Пилипенко, 1974; H.Werner, 1972) делали попытки типизировать культуры F.necrophorum по их серологическим особенностям, но ни один из методов не нашел широкого практического применения.
В настоящее время наиболее чувствительными и специфичными признаны методы, основанные на выявлении фрагментов генома возбудителя в биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции. Необходимо отметить, что этот метод дает возможность обнаружить возбудителя при очень низких его концентрациях. Это часто приобретает определяющее значение при постановке диагноза, так как в пораженном участке помимо возбудителя заболевания F. necrophorum находятся в большом количестве различные ассоциации микроорганизмов. Поэтому выявление генома возбудителя в исследуемом материале с помощью методов ДНК-технологий сокращает сроки диагностических исследований до 1-2 рабочих дней.
Высокая чувствительность ПЦР достигается при работе с чистой бактериальной культурой и с очищенной нуклеиновой кислотой, но при работе с клиническим материалом есть свои особенности. В этом случае необходимо обращать внимание на методику приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул.
В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроба, а точнее строением его клеточной оболочки. Для экстракции ДНК используют два основных метода. В одном случае используют классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. Здесь достигается хорошая очистка ДНК, особенно от ингибиторов Tag-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особо заметные при работе с небольшими по объему образцами с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании нуклеосорбентов. Эта методика занимает меньше времени и более проста в исполнении, но не всегда может быть применена.
Для проведения молекулярного анализа ДНК, прежде всего нужно выделить ее из биологического образца в чистом виде. С этой целью необходимо подобрать оптимальные методы выделения, позволяющие получить достаточное количество нуклеиновых кислот максимально очищенных от белков.
Суммарная ДНК, выделяемая из клинических образцов, представляет собой смесь геномной и митохондриальной ДНК с минимальным содержанием белков. Получить чистую геномную ДНК можно только одним способом: выделением ядер и высвобождением из них ДНК (H.G. Khorana et al., 1976; В. Т.В.Чан, 1999). Для выделения геномной ДНК разрушают плазматическую и ядерную мембраны и освобождаются от клеточных белков. Для депротеинизации ДНК используют два метода: обработка белков протеазами (проназой или протеиназой К) в присутствии детергентов (например, додецилсульфата); денатурация и экстракция органическими растворителями (фенолом и хлороформом). Значение этих агентов в том, что они денатурируют белки, делая их нерастворимыми (СЕ. Бреслер, 1973; А. Корнберг, 1977; В. Т.-В. Чан, 1999; В.И. Семенихин и др., 2000).
После экстракции ДНК из водных растворов осаждают добавлением этанола или изопропанола (А.С. Краев и др., 1980; К. Кайзер, Н. Мюррей, 1988).
В отечественной литературе отсутствуют публикации по выделению геномной ДНК F. necrophorum.
Постановка полимеразной цепной реакции
К ДНК-технологиям относят все реакции, в основе которых находится полимеразная цепная реакция. Принцип метода ПЦР (Polymerase chain reaction (PCR)) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", США) в 1983г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практической ветеринарии и здравоохранении (диагностика инфекционных заболеваний, генотипирование, определение устойчивости к химиопрепаратам).
В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. Открытие Taq-полимеразы из термофильных бактерий Thermus aquaticus, оптимум работы которой находится в области 70-72С, позволило автоматизировать процесс синтеза ДНК in vitro, так как фермент-катализатор реакции не инактивировался при денатурации ДНК нагреванием. Прогревание Taq-полимеразы в течение 40 мин при температуре 95С снижает активность фермента всего в два раза. О принципах и возможных вариантах полимеразной цепной реакции в своих публикациях сообщают U. Landegren et al. (1988), А.Б. Вартапетян (1991), М.Ю. Аксенов, А.Л. Гинцбург (1993), К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун (2000), Ю.А. Алтухов, Е.А. Салменкова (2002), И.Ф. Жимулёв (2006), H.N. Erlich (1993).
Чувствительность метода настолько высока, что позволяет выявить 10-100 копий ДНК искомого микроорганизма и помогает поставить точный диагноз. Традиционным иммуннологическим и микробиологическим методам для детекции микроорганизма необходимо наличие, по крайней мере 10-10J клеток (Р. Сайки, У. Гиленстен, Г. Эрлих 1990; А.Б. Вартапетян 1991; С.А. Булат, 1992; И.Ф. Жимулёв, 2006; W. Bloch 1991). Чувствительность и специфичность ПЦР выше, чем у микробиологических методов. При постановке диагноза на некробактериоз с использованием микробиологических методов необходимо от 12 до 15 дней, а при сильном обсеменении биообразца сопутствующими микроорганизмами срок постановки диагноза увеличивается. При использовании ПЦР ответ можно получить в течение 1-2 рабочих дней.
Для микробиологических методов необходимо, чтобы в клиническом образце имелись жизнеспособные микроорганизмы. Отсюда повышенные требования к хранению и транспортировке клинических образцов. ПЦР выявляет в образце не только живые, но и уже погибшие микроорганизмы, и даже отдельные фрагменты ДНК, оставшиеся после их разрушения. Поэтому для ПЦР требования к хранению и транспортировке образцов не столь строги. ПЦР является методом прямого тестирования, позволяет избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами, и интепритация его результатов не зависит от иммунологического состояния организма.
В основе метода ПЦР лежит природный процесс — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента Taq-полимераза.
Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах. 1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95С. 2 этап: Присоединение праймеров, то есть гибридизация с матрицей (отжиг). Температура проведения отжига зависит от длины затравки и содержания в ней GC-nap. Температуру отжига рассчитывают, исходя из состава праймеров: на нуклеотиды А, Т приходится 2С, на С, G - 4С (Р. Сайки и др., 1990; W. Rychlin et al., 1990). Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой чаще располагаются в интервале 50-65С. 3 этап: Достраивание цепей ДНК (синтез). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5 -конца к 3 -концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат дезоксирибо-нуклеотидтрифосфаты (dNTP). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72С. (Т. Андо, 1982; R.K. Saiki et al., 1988).
Таким образом, ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (амплификация) катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. В отчественной литературе до настоящего времени отсутствовали публикации по применению полимеразной цепной реакции для диагностики некробактериоза.
Одной из распространенных модификаций метода ПЦР является использование двух пар праймеров, одна из которых способна амплифицировать внутренний участок ампликона, полученного после первого раунда амплификации с внешней парой праймеров (И.А. Шагинян, А.Л. Гинцбург, 1995; К. Mullis et al., 1986).
Существует несколько вариантов применения гнездовой ПЦР в лабораторной диагностике. В одном из них вначале проводится амплификация (15-30 циклов) с внешней парой праймеров, при этом амплифицируется основной фрагмент ДНК. Далее часть содержимого переносится в новую пробирку, содержащую реакционную смесь, в состав которой входит пара праймеров, узнающая последовательности, лежащие внутри основного ампликона. Второй раунд амплификации (реамплификации) также составляет 15-30 циклов. Во втором варианте температуру отжига внутренней пары праймеров подбирают с таким расчетом, чтобы при проведении первого раунда амплификации они не участвовали в реакции. Обычно температура отжига праймеров в этом варианте на 10-15С ниже, чем для внешней пары праймеров. Программа амплификации состоит из двух блоков. Это обеспечивает эффективное участие внутренней пары праймеров во втором раунде амплификации (К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун, 2000).
Изучение геномного полиморфизма F. necrophorum subsp. necrophorum с помощью RAPD-PCR-анализа
Нами была усовершенствована методика выделения ДНК из культур F. necrophorum с помощью цетриламмония бромид (СТАВ). В начале работы была опробована схема выделения ДНК с использованием 2% СТАВ, при выполнении которой осадок бактерий ресуспендировали в 500 мкл 2,0% СТАВ, перемешивали и инкубировали при 65С в течение 1 часа. Затем обрабатывали смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1) и осаждали этанолом. Полученная ДНК при электрофорезе в 1% геле агарозы была видна в виде полосы, но не подвергалась гидролизу эндонуклеазами. Тогда мы увеличили концентрацию СТАВ с 2% вначале до 5%, затем до 10%, а экспозицию увеличили до 2,5 часов при +65С. В этом варианте ДНК выделяли в большом количестве, но она так же не рестриктировалась. В процессе экспериментов повысили температуру с +65С до +80С, а экспозицию довели до 1 часа и выделение геномной ДНК из культур F. necrophorum с помощью 10% СТАВ провели следующим образом: 1. а) Фрагмент соскоба с пораженного участка копыт или других тканей (50-100 мкг) растирали в ступке со стеклянным порошком (25-50 мкг), добавляли 300-500 мкл физиологического раствора, перемешивали и 100-300 мкл взвеси переносили в пробирку объемом 1,5 мл с крышкой. б) В случае выделения из бактериальной культуры клетки осаждали в бляшку центрифугированием 8 мин при 5000 об/мин. Среду удаляли, а клетки в объеме 50 мкл переносили в пробирку на 1,5 мл с крышкой. 2. 100-300 мкл биологического образца или 50 мкл культуры добавляли к 500 мкл подогретого до +80С 10% СТАВ, перемешивали и инкубировали при +80С в течение 1 часа. 3. Затем охлаждали до КТ и добавляли 0,5 объема (300-400 мкл) смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешивали 2-3 раза в течение 1-2 мин и центрифугировали в течение 10 мин при 13000 об/мин. 4. Водную фазу переносили в другую пробирку и к ней приливали 300 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивали 1 мин и центрифугировали 6 мин при 13000 об/мин. Водную фазу переносили в другую пробирку. 5. К водной фазе прибавляли 50 мкл объема ЗМ ацетата натрия рН 4,8 и 1000 мкл этанола, перемешивали и помещали на 1 час или на ночь при -20С. 6. Пробу центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин, осадок промывали 70% этанолом и высушивали при наклонном положении пробирки при +37С в течение 25-30 мин и растворяли в 30-50 мкл 10 мМ ТЕ-буфера рН 8,0 или автоклавированной бидистиллированной воды. ДНК в этом варианте выделения была в 1% агарозе в виде четкой полосы. Пробные постановки ПЦР прошли успешно и этот вариант выделения ДНК из культур F. necrophorum с применением 10% СТАВ применяли в последующей работе. Выделенная ДНК хранилась при -18С в течение восьми месяцев (срок наблюдения) и оставалась пригодной для анализа. Проверку чистоты выделения ДНК осуществляли по Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984). С этой целью были использованы культуры № 8 и № 12 Fusobacterium necrophorum. Бактериальные клетки осаждали в бляшку центрифугированием в течение 8 мин при 6000 об/мин. Среду удаляли, а клетки ресуспендировали в 500 мкл 0,9% NaCl и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 6 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 300 мкл 0,9% NaCl. Далее ДНК выделяли по усовершенствованной методике с помощью 10% СТАВ. Делали два замера плотности раствора ДНК каждой пробы на спектрофотометре марки СФ-26 при длине волн D260 нм и D280 нм в кювете на 300 мкл.
Отношение величины D, измеренной при 260, к величине D, измеренной при 280 нм (D260/D280), позволяет говорить о чистоте нуклеиновой кислоты. Чистые препараты ДНК имеют отношение D260/D280 равное 1,75-1,80. Полученный нами результат по культуре № 8 равен 1,70, а по культуре № 12 - 1,79. В случае, если препарат содержит примесь белка, то D260/D280 значительно меньше указанных выше значений. При анализе ДНК-паттернов, для установления уровней родства, очень важен выбор олигонуклеотидных праймеров, которые давали бы наиболее информативные картины геномного полиморфизма F. necrophorum. «Произвольные» праймеры длиной в 10 н.п. со случайной нуклеотидной последовательностью выбирали, взяв за основу нуклеотидную последовательность лейкотоксина F. necrophorum штамма А25 в 12699 н.п. Из проанализированных 50 олигонуклеотидов были выбраны и синте зированы следующие десятинуклеотидные праймеры: № 13 - саа acg teg д, № 16 - дас сде ttg t, № 18 - адд tga сед t, № 20 - аде сад еда а, № 21 - ttc еда асе с, № 023 - tea еда tgc а, № 002 - agt get acg t, № 27 - сад gee ctt с, № 28 - сад cac сса с, № 36 - сед саа gee t, № 38 - дед дед дде с, № 44 - ggt etc gtg д, № 48 - tea age сде с, № 50 - cct саа дес д. ПЦР с пробой ДНК проводили в объеме 25,0 мкл. Для постановки реакции вносили в пробирку объемом 0,5 мл следующие компоненты реакционной смеси: 10хбуферрН8,8 - 2,5 мкл 2,5 мМ dNTPs - 3,0 мкл праймер №.... - 3,0 мкл вода дистиллированная - 14,5 мкл. Taq-полимераза - 0,5 мкл исследуемая ДНК - 1,5-2,0 мкл На поверхность наносили 1-2 капли стерильного вазелинового масла. ПЦР проводили в следующем режиме: прогревание реакционной смеси при 95С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94С 0,3 мин, отжиг при 36С 0,5 мин и синтез при 72С 0,7 мин - 30 циклов и один цикл (досинтез) при 72 в течение 1,5 мин. Продукты реакции визуализировали путем электрофореза в 1%-ом геле агарозы с бромистым этидием. После проведения полимеразной цепной реакции и сравнения полученных паттернов выявили, что не все сконструированные нами праймеры были пригодны для внутривидовой дифференциации изолятов F. necrophorum. Малоинформативными олигонуклеотидами оказались № 13, 16, 20, 21, 023, 002, 27, 44, 48, 50. Результаты генотипирования с оставшимися праймерами приведены в таблице 1. Анализ величин индексов подобия при попарном сравнении выделенных на территории Западной Сибири изолятов, относящихся к патогенному виду Fusobacterium necrophorum, показал, что наиболее пригодными для генотипирования были праймеры № 18, 28, 36 и 38 (рисунки 1)
Генетическая характеристика культур Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum
На основании результатов микробиологических исследований, проведенных на белых мышах биопроб и изучения генетических дистанций культур F. necrophorum были выбраны совместно с сотрудниками ФГУ ФЦТРБ (г. Казань) для дальнейшей генетической характеристики по генам белка оболочки, гемагглютинина, ДНК-гиразы, спейсера и транспозона две культуры (№ 8 и № 12). С помощью ПЦР наработали фрагменты вышеназванных генов. Затем провели очистку от белков и повысили концентрацию ампликонов путем нескольких переосаждений фенол-хлороформом по следующей схеме: 1) к 300 мкл каждого ампликона добавили 150 мкл смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешали и центрифугировали 6-8 минут при 13000 об/мин. 2) водную фазу перенесли в другую пробирку и к ней прилили 75 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), встряхнули и центрифугировали 6-8 минут при 13000 об/мин. Водную фазу перенесли в другую пробирку. 3) в водную фазу вносли 1/10 часть от ее объема ЗМ ацетата натрия рН 4,8 и 2 объема этанола, перемешали и поместили на 2 часа или на ночь при —18С. 4) пробу центрифугировали 10-12 мин при 13 тыс. об/мин, этанол удалили и к осадку добавили 100 мкл 70% этанола, центрифугировали 1-2 мин при 13 тыс. об/мин, осадок высушили и растворили в 30 мкл автоклавированнои бидистиллированной воды или 10 мМ ТЕ-буфере рН 8,0. Секвенирование проводили совместно с сотрудниками лаборатории фармакогеномики ИХБиФМ СО РАН на атоматическом секвенаторе по двум цепочкам ДНК. Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов проводили методами выравнивания и BLAST algoritm с другими опубликованными последовательностями. Определили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность культуры 12 (рисунок 11) совпадает с нуклеотидной последовательностью шт. FnSI (Австралия) F. necrophorum subsp. necrophorum и № 8 и AY241175. Рассматриваемая нуклеотидная последовательность (рисунок 12) межгенной вставки 16S-IS-23S лейкотоксина культуры № 12 совпадала с нуклеотидной последовательностью № 8 (DQ417657 [gi:89891993] 16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer and 23 S ribosomal RNA gene и штаммов F. necrophorum subsp. necrophorum: Fn 48 (AF410959), JCM3716 (AF410965) и F. necrophorum subsp, funduliforme: Fn 513 (AF410961) и JCM3717 (AF410967). Далее определили, что нуклеотидная последовательность гена гроВ (белка оболочки) культуры № 12 (рисунок 13) совпадала с последовательностями ДНК культур № 8 и № 27 и штаммов F. necrophorum subsp. necrophorum NCTC10576 (AY372007), Fnl (AY370663), ATCC25286, AF527637) и F. necrophorum subsp. funduliforme Fn45 (AY370665). Нуклеотидная последовательность исследуемого фрагмента гена ompH (ген гемагглютинина) штамма № 12 (рисунок 14) совпадала с соответствующими последовательностями культур № 8 и № 27 и штаммов F. necrophorum subsp. necrophorum. Ген гемагглютинина отсутствует у F. necrophorum subsp. funduliforme и Fusobacterium nucleatum.
Нуклеотидная последовательность исследуемого фрагмента гена ДНК-гиразы (DNA gyrase В protein, topoisomerase II) штамма № 12 (рисунок 15) совпадала с № 8 и № 27 и i7. necrophorum subsp. necrophorum шт. ATCC25286 (AF527637), на 30% с F. necrophorum subsp. funduliforme шт. АТСС 51357 в районе 3 -конца и с центральной областью Fusobacterium nucleatum шт. АТСС25586. На основании данных, полученных при генотипировании изолятов, выбраны № 8 и № 12, как наиболее характерные представители Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum. Принадлежность последних к подвиду necrophorum подтверждена установлением нуклеотидной последовательности генов транспозона, белка оболочки, топоизомеразы II (ДНК-гиразы), гемагглютинина и межгенной вставки лейкотоксина (16S-IS-23S). Эти два изолята депонированы по заявке ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и ФГУ ФЦТРБ (г. Казань) в ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» НИИ «Коллекции культур микроорганизмов». Изолят № 8 депонирован как штамм Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum 8TS630501 за № 1705 от 08 сентября 2005 г. Регистрационный номер В-1075, а изолят № 12 депонирован как штамм Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum 12TSK630501 за № 1805 от 08 сентября 2005 г. Регистрационный номер В-1076.
