Введение к работе
Актуальность темы. Микроорганизмы из семейства Chlamydiaceae являются облигатными внутриклеточными бактериями, которые вызывают ряд заболеваний людей и животных, известных под общими названиями «хламидийные инфекции» или «хламидиозы». Возбудителями хламидийных инфекций свиней считаются четыре вида хламидий: Chlamydophila (Ср.) psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia (С.) suis.
Хламидийные инфекции являются одной из наиболее актуальных проблем современного промышленного животноводства, в том числе и свиноводства (Четвертных В. А. и др., 1998). Методам диагностики, профилактики и борьбы с хламидийными инфекциями свиней уделяется много внимания, но, несмотря на это, они остаются широко распространенными и наносят значительный экономический ущерб (Самуйленко А.Я. и др., 2003). Ущерб складывается главным образом из недополучения приплода в результате абортов у свиноматок во второй половине супоросности, мертворождения или рождения нежизнеспособного приплода, снижения привесов у молодняка и преждевременной выбраковки животных (БортничукВ.А., 1991). Из-за невозможности раннего диагностирования хламидийных инфекций и, как следствие, отсутствия своевременного проведения специфических профилактических и оздоровительных мероприятий, трудно найти свиноводческое хозяйство, где не было бы данных заболеваний (Равилов А.З., ХазиповН.З., 1982; Шаткин А.А., 1984; Andersen А.А., 1996). Особенностью хламидийных инфекций, значительно усложняющей эпизоотический надзор за ними, является часто хроническое, со стертой клинической картиной, или латентное их течение (Караваев Ю.Д. и др., 2003). Следовательно, в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по профилактике и борьбе с данными заболеваниями большое значение имеет раннее и достоверное обнаружение их возбудителей при разных формах развития инфекционного процесса.
Каждый из возбудителей хламидийных инфекций свиней характеризуется своим спектром вызываемых заболеваний. Чаще всего С. suis вызывает энтерит и конъюнктивит. Ср. abortus обычно связывают с абортами и рождением слабого или нежизнеспособного потомства у свиноматок, а также полиартритами, которые чаще диагностируют у откормочных поросят. Ср. psittaci, как правило, обнаруживают в легких свиней больных пневмонией, редко — в маточной слизи абортировавших свиноматок. Установлена взаимосвязь Ср. pecorum со многими заболеваниями: энцефаломиелитом, пневмонией, артритом, конъюнктивитом, энтеритом, заболеваниями мочевых путей, метритом, нарушениями плодовитости и др. Кроме того, они имеют разный зоонозный потенциал, в частности Ср. pecorum может передаваться от свиней людям, а другие виды — нет. По этой причине в диагностике хламидийных инфекций большое значение приобретает идентификация вида(ов) хламидий, персистирующих у свиней и разработки мероприятий по борьбе с данными заболеваниями в хозяйстве.
В связи с этим существует необходимость в методе лабораторной диагностики, позволяющем выявлять и дифференцировать виды возбудителей хламидийных инфекций свиней. С этой целью был разработан целый ряд лабораторных методов прямого и косвенного выявления хламидий (Гаффаров Х.З. и др., 2000). Из них в ветеринарной практике нашли применение следующие методы: микроскопия, культуральный, серологический и молекулярно-генетический. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Сейчас наиболее перспективным методом прямой диагностики хламидийных инфекций считается молекулярно-генетический метод, а именно его наиболее популярная разновидность— полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Метод ПЦР выгодно отличается от других методов высокой специфичностью, позволяя идентифицировать возбудителя с точностью до вида и даже сероварианта, и высокой чувствительностью, позволяя обнаружить ничтожно малые количества возбудителей хламидийных инфекций (1-10 клеток) в образцах клинического материала. Кроме того, характеризуется простотой и удобством проведения анализа и дает возможность поставить диагноз в короткие сроки (4-6 часов). Немаловажным фактором является умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость проведения анализа.
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время известны ПЦР-тест-системы для семейственноспецифической детекции возбудителей хламидийных инфекций, а также для детекции и идентификации одного-двух видов хламидий. ПЦР-тест-системы для детекции и идентификации всех видов хламидий, патогенных для свиней, не разработаны. Данный факт послужил основанием для разработки ПЦР-тест-системы для детекции всех патогенных для свиней хламидий (Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus, Chlamydia suis) и дифференциации их между собой.
Цель и задачи. Цель данной работы — изучить распространенность хламидийных инфекций свиней в репродуктивных свиноводческих хозяйствах Белгородской области и усовершенствовать лабораторную диагностику хламидийных инфекций свиней с использованием полимеразной цепной реакции.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
Изучить распространенность хламидийных инфекций в свиноводческих хозяйствах Белгородской области.
-
Разработать схему ПЦР-амплификации фрагментов гена ompl, обеспечивающих возможность детекции и идентификации всех видов хламидий патогенных для свиней.
-
Сконструировать праймеры для ПЦР-амплификации семейственно- и видоспецифических фрагментов гена ompl согласно разработанной схеме.
-
Разработать гнездовую ПЦР-тест-систему для детекции и идентификации всех видов хламидий патогенных для свиней в образцах клинического материала с использованием электрофоретического анализа продуктов амплификации.
5. Оценить чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-тест-системы при тестировании клинических образцов, отобранных от свиноматок из неблагополучных по хламидийным инфекциям хозяйств, в сравнении с коммерчески доступными ПЦР- и ИФА-тест-системами.
Научная новизна. Изучена распространенность хламидийных инфекций в репродуктивных свиноводческих хозяйствах Белгородской области.
Разработан новый способ видовой дифференциальной диагностики хламидийных инфекций свиней, вызываемых CMamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum, CMamydophila abortus и CMamydia suis (подана заявка на патент). Диагностика осуществляется путем применения двухступенчатой (гнездовой) полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, комплементарных участкам гена отр-1.
На основе этого способа разработана и укомплектована высокочувствительная и высокоспецифичная ПНР-тест-система «Хлами-суис» с детекцией в агарозном геле (ФГБОУ ВПО БелГСХА имени В.Я. Горина) (зарегистрирована как секрет производства («ноу-хау»), охраняемого в режиме конфиденциальности, в региональном Депозитарии «ноу-хау» Белгородской области). Подтверждена ее высокая чувствительность и специфичность по сравнению с коммерчески доступными ПНР- и ИФА-тест-системами.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в разработке нового способа диагностики хламидийных инфекций свиней и создании на основе этого способа высокочувствительной и высокоспецифичной ПЦР-тест-системы «Хлами-суис» для выявления ДНК Chlamydophila psittaci, CMamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и CMamydia suis.
Разработанная ПЦР-тест-система «Хлами-суис» имеет большую практическую значимость, потому что она позволяет усовершенствовать схему мониторинга хламидийных инфекций на свиноводческих предприятиях. Данная тест-система дает возможность диагностировать хламидийные инфекции на всех стадиях развития инфекционного процесса, в том числе на ранних, а также выявлять животных с хроническим и латентным течением, что необходимо для проведения своевременных мер борьбы и профилактики хламидийных инфекций в хозяйстве. Идентификация хламидий до вида необходима для назначения специфических профилактических мероприятий. Таким образом, своевременная видовая диагностика хламидийных инфекций свиней и соответствующие специфические профилактические и оздоровительные мероприятия позволят уменьшить экономический ущерб, который складывается из недополучения приплода, снижения привесов молодняка, преждевременной выбраковки и т.п.
На основе полученных результатов исследований разработаны и утверждены следующие нормативно-технические документы:
- Временная инструкция по применению тест-системы «Хлами-суис» для выявления ДНК возбудителей хламидийных инфекций свиней (CMamydophila psittaci, CMamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и CMamydia suis) методом полимеразной цепной реакции;
- Технические условия на тест-систему «Хлами-суис» для выявления
ДНК возбудителей хламидийных инфекций свиней (Chlamydophila psittaci,
Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Chlamydia suis) методом
полимеразной цепной реакции.
Полученные результаты исследований послужили основой для разработки методических рекомендаций «Выявление возбудителей хламидиозов свиней методом полимеразной цепной реакции» (гриф Учебно-методического объединения высших учебных заведений Российской Федерации по образованию в области зоотехнии и ветеринарии от 04 апреля 2012 г. № 63-51). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО БелГСХА имени В.Я. Горина и на кафедре эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО КГСХА имени профессора И.И. Иванова.
Основные положения диссертационной работы внедрены в ветеринарную практику свиноводческих хозяйств ООО «Белгранкорм» — «Томаровская свинина» и «Шебекинская свинина».
Положения, выносимые на защиту:
-
Распространенность хламидийных инфекций в свиноводческих хозяйствах Белгородской области.
-
Схема ПЦР-амплификации фрагментов гена ompl, обеспечивающих возможность обнаружения всех видов хламидий патогенных для свиней и дифференцирования их между собой.
-
Подбор праймеров для ПЦР-амплификации семейственно- и видоспецифических фрагментов гена ompl согласно разработанной схеме.
-
Разработка гнездовой ПЦР-тест-системы для детекции и идентификации всех видов хламидий патогенных для свиней в образцах клинического материала с использованием электрофоретического анализа продуктов амплификации.
-
Сравнение чувствительности и специфичности разработанной ПЦР-тест-системы с коммерчески доступными ПЦР- и ИФА-тест-системами при тестировании клинических образцов, отобранных от свиноматок из неблагополучных по хламидийным инфекциям хозяйств.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 8 работ, в том числе 2 в издании, включенном ВАК Минобрнауки РФ в «Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора или кандидата наук».
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:
- конкурсном отборе по программе «Участник Молодежного Научно-
Инновационного Конкурса - 2009» (грант на выполнение НИОКР по договору
№ 14 с ООО «Плазмика») (Белгород, 2009);
- Международной студенческой научно-практической конференции
«Модернизация аграрного производства: наука и практика» (Курск, 2010);
- II (Майский, 2010) и III (Ставрополь, 2010) этапах Всероссийского
конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых
ученых высших учебных заведений Минсельхоза России в номинации
«Ветеринарные науки» (для аспирантов и молодых ученых в возрасте до 25
лет);
- Международной научно-практической конференции студентов,
аспирантов и молодых ученых «Модернизация АПК в контексте обеспечения
продовольственной безопасности государства» (Курск, 2010);
Белгородском областном конкурсе научных молодежных работ «Молодежь Белгородской области» (Белгород, 2011);
Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвященной 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиологии и отдела охраны полезной энтомофауны (Москва, 2011);
- конкурсном отборе по программе «Участник Молодежного Научно-
Инновационного Конкурса-2011» (грант на выполнение НИОКР по договору
№ 24 с ООО «Плазмика») (Старый Оскол, 2011);
- XVII Международной научно-производственной конференции
«Проблемы и перспективы инновационного развития животноводства»
(Майский, 2013).
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 162 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и список литературы (всего 289 источников, в том числе 229 иностранных и 17 ссылок на сайты в Интернете). Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 12 рисунками. В приложении даны документы, подтверждающие научно-практическую значимость работы.
