Введение к работе
Актуальность темы. Копытная гниль овец - это известная с 18-го
столетия инфекционная болезнь, которая с тех времен и по сей день
продолжает наносить ущерб овцеводческой отрасли во всём мире (Abbott
K.A.,2005;BullerP.,2010).
Из-за культуральных особенностей Dichelobacter nodosus стандартная бактериологическая методика идентификации возбудителя представляет собой трудный, длительный и не всегда эффективный процесс. В австралийских лабораториях процент проб патологического материала из которых удается выделить первичные культуры D.nodosus, составляет всего 25-65% (Graham В., 2003).
Развитие молекулярных методик существенно облегчило и ускорило (с 3 - 4 недель до одного дня) лабораторную диагностику D.nodosus. Выявление и идентификацию D.nodosus проводят по гену 16S pPHK. (La Fontaine S., 1993). Главное преимущество молекулярных методик, в том числе ГЩР - чувствительность, специфичность, устранение от трудоемких, длительных и не всегда успешных процедур выделения возбудителя (Petti С.А., 2006; Woo Р.С., 2008).
В настоящее время, все 10 известных серологических групп возбудителя можно идентифицировать с помощью ГЩР - амплификации гена фимбриальной субъединицы FimA (Dhungyel О.Р., 2002; Wani S.A., 2006; Zhou Н., 2001).
Для России актуальность разработки молекулярно-генетических методик несомненна. Российские лаборатории не обладают возможностями для проведения бактериологического и серологического исследования D.nodosus, болезнь часто проходит под диагнозом некробактериоз. Современных методов диагностики копытной гнили овец в нашей стране нет.
Таким образом, усовершенствование диагностики копытной гнили овец с использованием молекулярно-генетических методов является своевременным и необходимым.
Цель работы: биологическая и молекулярно - генетическая характеристика штаммов D.nodosus и разработка методик ПЦР для осуществления видовой идентификации и типирования возбудителя копытной гнили овец.
Задачи исследований:
Разработать методику ПЦР - анализа на основе амплификации гена 16S рРНК Dichelobacter nodosus для видовой идентификации возбудителя из культуры.
Разработать методику ПЦР - анализа на основе амплификации гена fimA для типирования штаммов возбудителя.
Охарактеризовать молекулярно - генетически штаммы Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко в сравнении с основными биологическими свойствами этих культур.
Разработать способы подготовки проб патологического материала для проведения ПЦР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.
Оценить корреляцию данных филогенетического анализа Dichelobacter nodosus по гену fimA и серологического метода РА (реакция агглютинации).
Научная новизна.
Охарактеризованы биологические и молекулярно - генетические свойства 17 штаммов Dichelobacter nodosus.
Проведена видовая идентификация реактивированных штаммов Dichelobacter nodosus по гену 16S рРНК и их типирование по тону fimA.
Разработана новая методика пробоподготовки патологического материала, позволяющая выявлять и идентифицировать Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований на основе ПЦР -амплификации фрагмента гена 16S рРНК.
Предложен новый фрагмент гена fimA, на основе которого проведен филогенетический анализ 15-ти штаммов D.nodosus и обнаружена корреляция генотипов с серотипами возбудителя.
Практическая значимость.
Охарактеризован молекулярно - генетически производственный штамм 1111 82/90 Dichelobacter nodosus, применяемый для производства вакцины «Овикон».
Проведена реактивация штаммов D.nodosus после 20-ти летнего хранения в лиофилизированном виде, изучена их жизнеспособность, сохранение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств.
Разработана методика ПЦР, позволяющая с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК с высокой специфичностью и чувствительностью осуществлять видовую идентификацию возбудителя - D. nodosus в лабораторных условиях без предварительного культивирования.
Разработаны «Методические указания по идентификации возбудителя копытной гнили овец с помощью амплификациии фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР», утвержденные Научно - методическим советом МГАВМиБ 1 апреля 2011 г. и предназначенные для использования в научно -исследовательских учреждениях, проводящих работы по изучению D. nodosus и молекулярной диагностике копытной гнили овец, а также для диагностических (или производственных) ветеринарных лабораторий.
Личный вклад соискателя.
Личный вклад соискателя заключается в организации и проведении бактериологических, молекулярно-генетических исследований, а также анализе и обобщении результатов работы.
Апробация работы.
Материалы работы доложены на Международной научно практической конференции по современным методам диагностики, профилактики и терапии заразных и незаразных болезней животных (г. Ставрополь, 2009 г.), Международной научно - практической конференции,
посвященной 90-летию МГАВМиБ (г. Москва, 2009 г.) Результаты работы включены в годовые отчеты по НИР кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней МГАВМиБ в 2008-2010 гг.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе в 3-х изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка использованной литературы, включающего 228 источников (в т.ч. 188 иностранных). Работа содержит 12 таблиц и 23 рисунка.
Основные положения выносимые на защиту:
Методика видовой идентификации Dichelobacter nodosus с помощью амплификации фрагмента гена 16S рРНК методом ГЩР в культуре или патологическом материале.
Методика типирования штаммов Dichelobacter nodosus с помощью амплификациии фрагмента гена fimA.
Реактивация и исследование биологических и молекулярно генетических свойств штаммов Dichelobacter nodosus из коллекции ВИЭВ им. Я.И.Коваленко.
Разработка способа подготовки проб патологического материала для проведения ГЩР на основе амплификации гена 16S рРНК для выявления и идентификации Dichelobacter nodosus без проведения культуральных исследований.
Филогенетический анализ штаммов Dichelobacter nodosus на основе нуклеотидной последовательности вариабельного фрагмента гена fimA и сравнение с результатами серологического метода РА.
