Введение к работе
Актуальность проблемы. Большой интерес, проявляемый к ферментам, осуществляющим трансформацию липидных продуктов, играющим важную роль в процессах жизнедеятельности всех организмов, связан как с фундаментальными аспектами, так и с высокой потребностью многих областей промышленности и медицины в ферментах этого спектра действия, а также-в продуктах энзиматических превращений последних.
Быстрое развитие новых биотехнологий с использованием ферментов, трансформирующих липиды, связано с их широким применением в пищевой, кожевенной, парфюмерной, текстильной, хлебопекарной промнпшвнностях.в производстве моющих средств, медицине, очистке сточных вод и др.
Открытие простагландинов (ПГ) является одним из наиболее значительных событий 20 века, имеющих серьезное общебиологическое и прикладное значение. Получаемые отечественной химической промышленностью медицинские препараты ПГ-подобных веществ не обладают теми свойствами, которые присущи естественным биорегуляторам этого типа. Это определило необходимость разработки технологии ПГ о использованием ферментов микробного происхождения. Однако, несмотря на очевидную перспективность и большие потребности медицинских препаратов с простагландинло-добным действием, в настоящее время не существует производства последних посредством методов биотехнологии.
В этой связи большое значение и актуальность приобретают направ
ленный поиск високоактивних продуцентов, ПГ-синтетаз, изучение законо
мерностей и регуляции их синтеза, выделения ферментов и изучение их
свойств с целью создания технологии,пригодной для промышленной реали
зации. ,1 f,
Наряду с этой проблемой некоторые отрасли промышленности,в частности, гидролизное производство, кожевенная, меховая, жироперерабаты-вапдая промышленность испытывают недостаток ассортимента липолитичео-ких ферментов, катализирующих гидролитическое расщепление масел и жиров. Однако, несмотря на крупные успехи в этой области, производство липаз в настоящее время_в нашей стране не налажено.
В рвязи о этим большое значение и актуальность приобретает выбор продуцеіітов липаз, разработка условий их культивирования, изучение закономерностей их биосинтеза,оекреции о целью создания технологии,пригодной для промышленной реализации.
Для изучения механизма катализа с участием липаз, а также при организация различных биотекнологическкх производств, чрезвычайно важно иметь высокоочиденныв препараты липаз с определенной специфичностью. Для решения данных проблем актуальными являются исследования по пови-
- г -
шенио выхода изучаемых ферментов путем воздействия на Механизм естественной секреции, разработке методов и схем очистки ферментов до гомогенного состояния, изучение структуры фермента и его свойств. Успехи в получении высокоочищенных ферментных препаратов в значительной степени связаны с разработкой и внедрением в биотехнологическую практику высокоэффективных методов аффинной хроматографии на биоспецифических сорбентах. Это позволяет устранить многостадийнооть, и трудоемкость, увеличить выход очищенного фермента. '
Важность биохимических и физико-химических исследований диполп-тических ферментов связана также о особым типом катализируемых ими реакций. Липазы, являясь водорастворимыми белками, катализируют гидролиз или вгерификацию нерастворимых в-воде субстратов, функционируя на границе раздела лишщ-вода. Вследствие сложности физических условий протекания липолиза наши знания особенностей регуляции этих реакций существенно отстают от тех, которые известны для гомогенного ката лиза. Именно эти особенности липолитических ферментов, а такке расширение аспектов применения последних вызывают большой интерес в плане их иммобилизации на нерастворимых носителях.
Решение всех вышеперечисленных задач путем разработки новых прогрессивных или интенсификации уже существующих технологий для ферментов, осуществляющих трансформацию липидных продуктов, позволяет внести вклад в новые направления применения данных ферментов, а также улучшить экологическое состояние ряда производств. О важности и актуальности проблемы свидетельствует также в то, что данная работа является . частью исследований координируемой Государственным комитетом по высте му образованию международной программы "Прикладная биотехнология" (при каз № 613 от 22.06.94), и го, что часть ее выполнялась в рамках сотрудничества с Университетом Хоенхайм в Штутгарте (Германия).
Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в создании промышленной технологии получения препаратов ферментов,обладающих способностью трансформировать липидн, на обнове обобщения теорета ческих и практических исследований по особенностям механизма регуляции их биосинтеза и секреции этих ферментов, разработке высокоэффективных способов их выделения и очистки, способов иммобилизации изучения физико-химических и каталитических свойств, а также их примененш в различных отраслях промышленности.
Поставленная цель достигалась решением следующих задач:
скрининг и селекция продуцентов ферментов, осуществляющих : трансформацию дипидов и их характеристика,
опродоланг.в локализации исапдуемых ферментов в клетках микро-
разработка технологии культивирования продуцентов и ее оптимизация,
изучение особенностей регуляции биосинтеза ферментов,трансфор-'язрущих липидн,
разработка технологии выделения ферментных препаратов разной степени очистки,
изучение физико-химических и каталитических свойств высокоочи-Йенных и гомогенных препаратов ферментов,
получение иммобилизованных препаратов исследуемых ферментов, изучение особенностей их фврментатішного катализа и использование для промышленных целей,:
разработка н внедрение эффективных режимов и технологий применения ферментов, трансформирувдих лігаидше продукты в пищевой,кожевенной,меховой промьшленностях.для производства СМО, звероводстве и медицине. ,
Научная новизна.
Впервые з стране найден продуцент фермента, осуществлякгцего трансформацию грахидоновой кислоти в простагландини и ПГ-подобные вещества микробного происхождения с высокой бпосинтетической активностью, не уступащей известным источникам животного происхождения данного фермента.
Впервые иммуноцятохимическнм методом показана локализация липо-ксигенаэы (ПГ-синтетазы) в зоне цитоплазматической мембраны,установлена прочная связь фермента со структурами мембран и клеточной стенки.
Изучены особенности регуляции биосинтеза ферментов, осуществляющих трансформации арахидоновой кислоты в простагландини. Впервые установлено, что образование внутриклеточной липоксигеназы (ПГ-синтетазы) актиномицетом Stieptomgeei sefietouc/es М8-2 контролируется основными источниками питания, которые составляют единый механизм регуляции биосинтеза этих ферментов- - метаболитную репрессию. Регуляторное воздействие рассматриваемого механизма проявляется на уровне транскрипции.
На основании подученных результатов и данных литературы составлена модель механизма, контролиругацого биосинтез ферментов, на примере протеаз и липоксигеназы (ПГ-синтетазн), для микроорганизмов, в частности, для S. spit&uu'des М8-2.
11а основании экспериментальных данных комплексных исследований разработаны условия культивирования культуры /Z&iZfytts 0^ «г 1414 в промышленных условиях с целыо получения липолитичвских ферментов.
Разработана технология выделения и очистки липазы, основанная
--4-.
на простых и эффективных методах, которые позволяют получить'препараты различной степени очистки в промышленных условиях. !
Впервые выделен и охарактеризован препарат гомогенной липазы. Показана субъвдиничная структура фермента. Всесторонне изучены физико-химические и каталитические свойства выделенной липазы.
Впервые проведеш' широкие комплексные исследования с привлечением химических и физических методов иммобилизации липаз. Подобраны в качестве сорбентов алюмосиликаты в цеолигнои форме с порами 60-80 А для эффективной иммобилизации данного фермента, повышающей их стабильность о отношении температуры, рН, улучшающей химические показатели.
Впервые разработаны в теоретически обоснованы научные основы применения указанных ферментных препаратов в различных областях народного хозяйства: в медицине для получения лекарственных препаратов,содержащих ПГ-подобные в-ва и ПГ, в звероводстве, при производртве синтетических моющих средств (СМО), пятновыводных средств, в меховой и кожевенной, пищевой отраслях промьшшенности.
Практическая значимость. Проведенные исследования явились фунда- . ментом для решения народнохозяйственных задач по эффективному использованию ферментов, осуществляющих трансформации липидных продуктов, в отраслях промышленности.
Разработана технология культивирования S. spiitioides М8-2 - продуцента ПГ-сиктетазы (А.с. J6 I4725QI от 1989 г.).
На основе предложенной модели механизма регуляции биосинтеза вне-
и внутриклеточных ферментов микроорганизмов разработана концепция фор
мирования и прогнозирования метаболизма продуцента в сторону надрав- .
ленного синтеза целевых ферментов. ,
По результатам оптимизации биосинтеза протеаз и дипоксигеназы(ПГ-
синтетазы) в процессе роста стрептомицета решены задачи комплексного
использования культуральной жидкости S. sojtetc«v ления первых в опытно-прадышлешшх условиях (А.с. № 579365 от 1977 г.,
А.с. » 973609 от 1982 г.).
Получен препарат ПГ-синтетазы в нативном к иммобилизованной на мембранах виде.
Показана возможность замены ПГ-синтетазы животного происхождения на фермент данного .спектра действия микробной природы при синтезе ПГ.
Экспериментально доказана перспективность и реальность разработки ' получения ПГ с использованием микробных ферментов, а также применение ПГ группы 111 и Пїї?2оі в звероводстве.
В результате лабораторных, стендових и опытно-промышленных исследований разработана'технология получения липазы культурой Я. 0tyH&& 1414. Составлен и утверэден лабораторний .технологический регламент ,ио
которому наработаны опытные париш фермента в ферментном цехе Голпцин-ского института фитопатологии (положительное решеїшо на авторскую заявку от 2.09.93).
Полученные данные положены в основу разработанного опытно-промышленного регламента производства Липоризина ГЗХ, внедрегаю технологии которого осуществлено на Бордском химическом и Прнволяском биохимическом заводах. Разработаны п утверздеш технические условия на опытные партии Липоризина ГЗХ
На основании изучения свойств промышленных препаратов Лшюризпн ГЗХ внявлеїш висоїсая липолитпчесхая активность, рН-стабильность и тер-мостабильность препаратов, хорошая совместность и стабильность их в сочетании с основными компонентами CMC. Это позволило выработать рекомендации при разработке эцзиысодержщих рецептур CMC, обладащих высокой эффективностью при удалении загрязнения (на 25-30$).
Разработаны и рекомендованы условия использования Липоризина ГЗХ в составе чистяпцос препаратов. Получен высокий эффект мойки я обезжиривания загрязненной шерстяной ткани.
Показана эффективность использования мохщих средств с Липорлзиноч ГЗХ в своем состава в рыбоперерабатывающей прогаилешгостн для мойки коптильных подносов, позволившая сократить энергозатраты и улучшить экологическую обстановку предприятия.
Разработали условия использоваївія Липоризина ГЗХ в технологии обезжиривания >вчш з ншевой основы.
Полученные результаты создали предпосылки для разработки новых направлений по применению липолптических ферментов з пищевой промышленности, а именно колбасном производстве при обработке кишечного сырья. Предложена конкурентоспособная новая технология обработки кишечного сырья. Гистологическими исследованиями тканей кишечного сырья, обработанного традиционный и ферментативним способами, поісазана оффек-тивность последнего. На разработанную технологию получен патент.приобретенный Воронеясклм мясокомбинатом (патент 5tl # І833І45 A3).
Теоретические положения данной работы используются в учебных курсах "Биохимические основы биосинтеза биологически активных вацеств" и "Биохимия масличного сырья",.читаемых автором. Методические приемы,отработанные в процессе научных исследований, систематизированы,изданы отдельными сборниками п используются в учебном процессе.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и об-суадались на слодуицях съездах, симпозиумах, конгрессах.,конференциях и коллоквиумах: Республиканская научно-теоретическая конференция молодых ученых микробиологов (Ташкент,1976,1978), 6-я, 7-я конференции молодых ученых Латвийской республики отд.ШОЛ (Рига,1977,1980),7-й съезд
Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата,1985), совещание "Ферменты микроорганизмов" (Москва,1985), Международный симпозиум по хроматографии (Будапешт,1986), Всесоюзная конферонция "Методы получе-ішя и анализа биохимреактивов" (Рига, 1982,1987), УІ, УП Дунайский симпозиум по хроматографии (София,1987; Лейпциг, 1989), Всесоюзная конференция "Микроорганизмы продуценты стимуляторов и ингибиторов роста растений и животных" (Ташкент,1989), совещание "Применение хроматографии в шпдевой и микробиологической промышленноотях и медицине"(Москва, 1990), Всесоюзная научно-техническая конференция "Совершенствование технологических процессов новых видов пищевой продукции и добавок,ис-пользование вторичного сырья пищевых ресурсов" (Киев,1991),научно-практическая конференция ученых в реленин социально-экономических проблем страны (Ташкент,1991), совещшше "Прикладная биотехнология на пороге 21 века" (Москва,1995), Медцународная конференция "Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК" (Москва,1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 59 работ в отечественных и зарубежных журналах, в материалах Международных и Всесоюзних съездов, конференций, симпозиумов и конгрессов. Получено 4 авторских свидетельств и патентов и I заявка на выдачу патента имеет положительное решение Госкомизобретений.
Основные полояеїшя, выносимые на защиту:
скрининг и повышение синтетической способности путем естественной изменчивости и регуляции биосинтеза микроорганизмов -продуцентов ферментов, осуществляющих трансформацию липидов, а именно липоксигена-зы (ПГ-синтетазы), липазы;
технология культивирования продуцентов ферментов данного спектра действия, внедрение предлагаемых технологий в промышленность;
технология выделения и очистки (получение ферментных препаратов с различной степенью очистки - ТЗХ, ГІ0Х-Т25Х) препаратов ферментов. Характеристика их свойств, субстратной и позиционной специфичности» Получение гомогенной липазы R. о\уьае 1414,изучение.структуры фермента:
реализация новых биотехнологических процессов и разработка новых технологий с использованием выделенных ферментов (синтез ПГ и их применение в звероводстве, гидролиз липидов в меховой и кожевенной промышленности, при изготовлении колбасных изделий, при производстве CMC и пягновыводных средств).
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения,обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, а также изложения результатов и их обсуадеюгя, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения нормативно-технической документации и актов испытания. Ниже представлена структурная схог.а направлений научных исследований.
