Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Характеристика микобактерий туберкулеза 11
1.2. Реакции иммунного ответа при туберкулезной инфекции 12
1.3. Биохимический состав туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих 18
1.4. Биологические свойства туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и его стандартизация 25
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
2.1. Экспериментальные животные 36
2.2. Туберкулиновые препараты 37
2.3. Приготовление микобактериальных антигенов. Схемы иммунизации морских свинок. Оценка интенсивности развития иммунного ответа 38
2.4. Биохимические исследования 39
2.5. Биологические исследования 40
2.6. Математическая обработка результатов эксперимента 41
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 43
3.1. Изучение биохимических и иммунобиологических свойств ППД туберкулина для млекопитающих 43
3.2. Сравнительное изучение способов сенсибилизации морских свинок микобактериями для определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих 53
3.3. Подбор эталонной серии и стандартизация ППД туберкулина для млекопитающих 64
3.4. Оценка эффективности использования различных вариантов постановки кожной реакции ГЗТ при определении биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих 69
4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 78
ВЫВОДЫ 92
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 93
ПРИЛОЖЕНИЕ 115
- Биохимический состав туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих
- Биохимические исследования
- Сравнительное изучение способов сенсибилизации морских свинок микобактериями для определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время туберкулез является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний животных (Краснов В.А., Мурашкина Г.С., 1998; Додонов М.М., 2002) и наносит значительный экономический ущерб сельскому хозяйству (Авилов В.М., 1992; GonZalez Llamazares O.R. 1999; Кресс В.М., 2000; Paziak-Domanska, В. 2002; Непоклонов Е.А., 2003). Эффективность профилактических и противоэпизоотических мероприятий при туберкулезной инфекции в значительной степени определяется своевременностью постановки и точностью используемых диагностических тестов. Существует несколько методов диагностики туберкулеза -прижизненных и послеубойных (Петров А. А. и др., 1993; OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines,2004), которые используются для борьбы и своевременной профилактики распространения заболевания: пато-логоанатомический, аллергический; бактериологический, включающий в себя микроскопию, культуральные исследования, биопробу; ПЦР, ИФА. Эффективность данных методов различна (Коротяев А. И., 1998; Осипова Е. П.,2004). Наиболее широко применяющимся, массовым, прижизненным методом исследования на туберкулез, согласно данным Найманова А.Х. (2002), является аллергический метод. Это связано с тем, что туберкулиновая проба обладает высокой чувствительностью, кроме того, для нее не требуется наличия дорогостоящей аппаратуры и особых условий постановки (Amadori М., 2002). В то же время эффективность туберкулинового теста зависит от ряда факторов. Из них основными являются активность и специфичность. Активность при этом определяет оптимальную дозу туберкулина, используемую при диагностике туберкулеза (Шаров А. Н., Ерошенко Л. А., Косякин А. Н., 1996). В то же время показатель специфичности зависит от химического состава аллергена, который зависит от технологии изготовления препарата (Шаров А.Н., 1989).
На Курской биофабрике с 2001 года в процессе изготовления ППД туберкулина для млекопитающих используется метод мембранного фракцио-
нирования микобактериальных белков культуральной жидкости (согласно Патенту РФ №2113233,1997). Внедрение этой технологии привело к изменениям биохимических свойств аллергена. В связи с этим актуальным является сравнительное изучение биохимического состава туберкулина, а также оценка эффективности технологических процессов при изготовлении туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих,
В настоящее время среди исследователей нет окончательного мнения относительно оптимальной дозы туберкулина используемой при проведении аллергической диагностики туберкулеза. Это в определенной степени связано с большим количеством существовавших международных и европейских стандартов, которые в разное время были разработаны для тех или иных ту-беркулинов: стандарты для АТК (Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 15 докл., 1964; Фрадкин В.А.,1990), стандарт Зей-берт (Фрадкин В.А.,1990) и другие. В течение долгого периода времени (с 1970 года) в Российской Федерации использовали туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих, биологическая активность которого была определена относительно международного стандарта туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих- PPD-S (Шевырев Н.С., 1971). В 1986 году ВОЗ был представлен Первый Международный стандарт ППД туберкулина -PPD-Bovine (European Pharmacopoeia 4 th Edition 2002). Для оценки биологических свойств коммерческих серий туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих основополагающим является применение эталонов, соответствующих общепринятым международным стандартам, и использование регламентированных методов оценки качества туберкулиновых препаратов (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004). В связи с предстоящим вхождением России в ВТО и необходимостью гармонизации требований к ветеринарным препаратам с учетом международной нормативной документации, актуальным является проведение стандартизации туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно Первого Международного стандарта PPD-bovine.
Цель и задачи исследований. Целью работы было изучение биохимических и биологических свойств туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, а также сравнительное изучение методов контроля качества туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и его стандартизация.
Исходя из поставленной цели, для ее решения были определены следующие задачи:
Провести изучение биохимического состава и иммунобиологических характеристик фракций туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, полученных по промышленной технологии, с использованием метода мембранного фракционирования и без применения мембранной технологии.
Изучить эффективность различных методов сенсибилизации морских свинок живыми и инактивированными микобактериями туберкулеза бычьего вида и определить способ сенсибилизации морских свинок термо-инактивированными микобактериями для достижения оптимального уровня кожной реакции ГЗТ при определении биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих.
Провести сравнительные исследования по подбору эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и установить эквивалент ее биологической активности относительно Первого Международного стандарта PPD-bovtne (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004).
Оценить эффективность использования различных вариантов постановки кожной реакции ГЗТ на лабораторных животных и больном туберкулезом крупном рогатом скоте при определении биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.
Научная новизна работы. В сравнительном аспекте изучен биохимический состав и иммунобиологические свойства вариантов фракций туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих полученных при исполь-
зовании мембран с разной номинальной отсекаемой молекулярной массой. Впервые проведен сравнительный анализ чувствительности разных методов сенсибилизации морских свинок при определении биологической активности ППД туберкулина (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004). Впервые выявлена статистическая закономерность увеличения вариации кожной реакции ГЗТ при снижении дозы туберкулина как у крупного рогатого скота больного туберкулезом (доза 3250 ME PPD-bovine -32%; 650 ME PPD-bovine -42,69%) так и у морских свинок, сенсибилизированных мико-бактериями туберкулеза бычьего вида (доза 20 ME PPD-bovine - 12,66 %; 2 ME PPD-bovine- 21,55 %).
Практическая значимость работы и пути ее реализации. По результатам исследования для проведения контроля биологической активности производственных серий утверждена эталонная серия туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих -ЗА (письмо ВГНКИ №444/1.3 от 13.03.02). В соответствии с международными требованиями проведено определение биологической активности эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно Первого международного стандарта PPD-bovine. Результаты исследований включены в нормативно-техническую документацию по контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих - СТО 00482909-0001-2004.
Основные положения, выносимые на защиту. Полученные результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
Результаты изучения биохимических и иммунобиологических характеристик фракций туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих, полученных с использованием мембранной технологии.
Результаты сравнительных исследований эффективности различных методов сенсибилизации морских свинок микобактериями туберкулеза при определении величины биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих.
3. Результаты исследования по подбору эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и стандартизация эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих относительно Первого Международного эталона PPD- bovine.
4. Результаты оценки эффективности применения различных вариантов постановки кожной реакции ГЗТ при определении величины биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих.
Апробация результатов работы. Основные положения диссерта
ции доложены на заседании кафедры биотехнологии, фармакологии и вете-
~ ринарно-санитарной экспертизы КГСХА им. профессора И.И.Иванова
15.02.2001; конференции молодых ученых КГСХА им. профессора
Л И.И.Иванова: 10.05.2003, 20.11.2004; на международной научно-
практической конференции: «Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва» 28.05.2003, Феодосия; международной научно-практической конференции: «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее» 23.09.2004, Щелково.
По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей.
Биохимический состав туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих
Туберкулиновые препараты, полученные по стандартной общепринятой технологии, характеризуются сложным биохимическим составом (Лянда - Геллер Б.А., 1963; Труфанов В. А,, 1971; Малахов А. Г., 1973; Литвинов В.И.,1989; Савицкая О.А., 2004). При этом известно, что количественные и качественные соотношения биохимических компонентов существенным образом влияют на иммунобиологические свойства туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих (Campos-Neto А.,2001). Гетерогенный биохимический состав туберкулиновых препаратов явился основанием того, что на протяжении длительного периода времени между разными учеными возникали дискуссии о том, какой компонент аллергена ответственен за развитие кожной реакции ГЗТ, при введении последнего в организм больного животного, и возможно ли его выделить. Так, Роберт Кох (1891) полагал, что активным компонентом туберкулина является белок, который можно осадить спиртом. В настоящее время большинство исследователей, таких, как Boras Z. (2002); Attiyah R. А. (2003); Kobayashi К. (2003), также считают, что биологическая активность туберкулиновых препаратов связана с белковыми соединениями. Между тем имеются и другие данные, свидетельствующие о том, что не только белки способны вызывать кожную реакцию ГЗТ, но и другие компоненты туберкулинов. Например, работами Daniel Т.М. (1975) было показано, что некоторые полисахариды способны индуцировать развитие кожной реакции ГЗТ у сенсибилизированных морских свинок и животных, больных туберкулезом.
Некоторые исследователи изучали общий состав аллергена. Так, согласно экспериментальным данным Шевырева Н. С, (1971) туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих, полученный с использованием М. bovis, в технологии которого предусматривалось осаждение туберкулопротеина трихлоруксусной кислотой, а переосаждение сернокислым аммонием, представлял собой смесь следующих веществ: белковые соединения- 73,4 -90%, полисахаридов- 4-5%, нуклеиновых кислот-1-2%, липидов - до 11%. Туберкулин, приготовленный Affronti L. F. et al. (1985), с использованием М. tuberculosis, технология которого включала осаждение туберкулопротеина сернокислым аммонием имел следующий состав: белковые соединения- 74%, полисахариды- 12%, нуклеиновые кислоты- 14%, Более ранними исследованиями Seibert F. В. (1941) была предпринята попытка систематизировать сведения о химических компонентах туберкулина. Вещества, входящие в состав ППД туберкулина, она разделила на биологически активную и биологически неактивную части:
1. Биологически активная часть препарата состоит из нескольких белковых фракций и включает в себя туберкулопротеины: А, В, С.
2. Биологически неактивная часть препарата представлена углеводами, липидами, нуклеиновыми кислотами.
Лазовская А.Л. (1962; 1964) исследовала три туберкулиновые фракции, выделенные Зейберт, и на основании проведенных исследований пришла к выводу, что туберкулопротеины в свою очередь, также являются сложными соединениями, в состав которых кроме белковых соединений, входят еще углеводы и липиды.
Углеводы в туберкулине, изготовленном по технологии Зейберт, со-гласно данным исследований Daniel Т.М. et al. (1975, 1977) представлены двумя полисахаридами: Д - арабино - Д - маннана и Д - арабино - Д - галокта-на.
Некоторые авторы, принимая во внимание преимущественно белковый состав туберкулиновых препаратов, изучали их аминокислотный состав. Так Иванов М.М. и др. (1972) определили аминокислотный состав отечественного туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих. В аллергене было обнаружено 18 аминокислот, среди которых преобладали: глютамино-вая и аспарагиновая кислоты, аланин, лейцин и аргинин. При этом, в препарате отсутствовали серосодержащие аминокислоты. Это связано с тем, что данные аминокислоты разрушались в процессе подготовки проб (Досон Р., 1991). Исследованием Галкина Н.И. (1978) показано, что в туберкулине для млекопитающих в большом количестве содержатся: глютаминовая и аспарагиновая кислоты, аланин, лейцин, но снижено содержание фенилаланина, тирозина, гистидина. Другие исследователи изучали аминокислотный состав микобактериальных аллергенов, полученных из атипичных микобактерий с целью последующего сравнения с туберкулином очищенным (ППД) для млекопитающих. Так Шаров А. Н. и др. (1996) изучая микобактериальный аллерген, полученный из атипичных микобактерии, выявили, что данный препарат в большом количестве содержит глютаминовую и аспарагиновую аминокислоты (4,44-15,81%), а также пролин (4,68-7,60%). В препарате из атипичных микобактерии не обнаружено метионина, триптофана, цистеиновой кислоты и цистина. Авторы сделали вывод, что в целом по аминокислотному составу диагностикум, изготовленный из атипичных микобактерии и препарат, полученный из патогенных микобактерии бычьего вида, существенно не различаются между собой.
Открытие гетерогенности биохимического состава туберкулиновых препаратов явилось основанием для последующих работ, по очистке их от балластных компонентов. Так Линниковой М.А. и др. (1960; 1963) предпринимались многочисленные попытки выделения более чистой белковой фракции, которая была бы более активной и специфичной по сравнению с туберкулином, полученным по стандартной технологии. Данные работы не увенчались большим успехом. Исследованиями Daniel Т. М. et aL, (1978) было показано, что при разделении межвидовых и видовых специфичных белковых микобактериальных компонентов туберкулина возникают определенные трудности, связанные с схожестью их биохимических свойств.
Биохимические исследования
Полисахариды в туберкулине очищенном (ППД) для млекопитающих, а также туберкулиновых препаратах определяли методом Хагедорна- Иенсе-на (Шамахмудов Ш.Ш.,1966).
Определение нуклеиновых кислот проводили по методу М. А. Губер-ниева, И. Г. Ковырева (Асатиани В. С, 1956).
Количественное содержание липидов в образцах определяли согласно методике Aronson (Модель Л.М.,1958).
Определение сухого остатка, органических и неорганических соединений проводили весовым методом (Физико- химические методы контроля ингредиентов питательных сред и биопрепаратов, 1970).
Определение концентрации туберкулопротеина проводили по методу Кьельдаля (ГОСТ 16739-88). Для проведения гель - хроматографии туберкулинов использовали колонку размером 1,05 х 40 см, заполненную ультрагелем АсА 44 (фирма LKB) или сефадексом G-150 (фирма pharmacia). Исследуемые препараты наносили в количестве 3 мл. Концентрация белка исследуемого образца составляла 5- 10 мг/мл. Элюцию проводили со скоростью 12 мл/ч 0,15 М раствором NaCl забуференный фосфатным буфером до рН 7,1- 7,2, калибровку колонки проводили, используя в качестве молекулярных маркеров трипсин с молекулярной массой 24 КДА (Himedia, No 2-0990 use before Dec 2006), кристаллического бычьего альбумина димера с молекулярной массой 134 КДА (Sigma ехр. 02\05) и мономера с молекулярной массой 67 КДА (Sigma ехр. 02\05) (Остерман Л.А.,1985).
Аминокислоты в образцах определяли на аминокислотном анализаторе HITACHI KLA-3B по методике, предложенной фирмой - изготовителем. Для калибровки аминокислотного анализатора использовали стандарт фирмы Sigma (Amino Acid Standard ехр. 09\06).
2.5. Биологические исследования Определение биологической активности туберкулиновых препаратов проводили на сенсибилизированных морских свинках, при этом разведения туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и туберкулиновых препаратов проводили на растворителе микобактериальных аллергенов серия №6 изготовлена 24.01.2001 (изготовлен согласно ТУ 46-21-37-80 утв. 15.11.1980) годен до 24.01.2006. Разведения делали с таким расчетом, чтобы в 0,1 мл содержалось 20 ME (PPD- bovine) и 2 ME (PPD-bovine). Указанные разведения инъецировали по правилу полного латинского квадрата. Учет результатов проводили через 24 часа, определяли средний диаметр кожной реакции. Расчет биологической активности проводили согласно методике МЭБ (Фрадкин В. А., 1990).
Сравнение туберкулиновых препаратов осуществляли на больном туберкулезом крупном рогатом скоте. Для этого разведения туберкулина очи щенного (ППД) для млекопитающих проводили на растворителе микобакте-риальных аллергенов серия №6 изготовлена 24.01 2001 (произведен согласно ТУ 46-21-37-80 утверждены, 15.11.1980) годен до 24.01.2006. Разведения делали с таким расчетом, чтобы в 0,2 мл раствора содержалось: 4000 ME (PPD-bovine), 3250 ME (PPD- bovine), 2000 ME (PPD- bovine), 650 ME (PPD-bovine), степень утолщения кожной складки в месте инокуляции аллергена определяли с помощью кутиметра через 72 часа (ГОСТ 16739-88).
Специфичность вариантов туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и туберкулиновых препаратов оценивали на морских свинках, сенсибилизированных М. avium 2282 согласно методике (OIE) Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004.
Математическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым статистическим методам, определяли средние арифметические значения, отклонение от среднего арифметического значения, вариацию средних арифметических значений. Достоверность различия между изучаемыми признаками определяли по критерию Стьюдента. Двухфакторные равномерные пропорциональные комплексы экспериментальных данных оценивали методом дисперсионного анализа (Лакин Г.Ф.,1990). Величину ошибки результатов биологической активности туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих и туберкулиновых препаратов оценивали по методике OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004.
Сравнительное изучение способов сенсибилизации морских свинок микобактериями для определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих
В производственном цикле изготовления и контроля туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих одним из основных этапов является определение величины биологической активности на сенсибилизированных морских свинках. При сенсибилизации морских свинок, в разных странах мира, используют как суспензии живых, так и суспензии инактивированных микобактерий (Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 36 докл., 1988). В России ГОСТ 16739- 88, при тестировании туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих предусмотрено использовать аттенуированные микобактерий штамма BCG-1. При этом, не смотря на то, что данные микобактерий являются ослабленными, все же сохраняется опасность реверсии патогенных свойств последних, поэтому наиболее оптимальным являются варианты, предусматривающие использование морских свинок, сенсибилизированных инактивированными микобактериями (OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2004).
Экспериментальных животных сенсибилизировали тремя штаммами микобактерий: 1. BCG-1 (авирулентные); 2. №8 -88 (инактивированный нагреванием); 3. AN-5 (инактивированный нагреванием). Сенсибилизацию штаммами 8-88 и AN-5 осуществляли в двух вариантах: 1-внутрикожно, и 2-внутримышечно. Сенсибилизацию штаммом BCG-1 проводили только внут-рикожно. Через месяц после сенсибилизации животным вводили туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих в двух дозах: 20 и 2 ME (PPD-bovine), а через 24 часа проводили учет реакции. Результаты исследований представлены
По результатам проведенных исследований установлено, что величина кожной реакции зависит от способов введения антигенов. При этом максимальные значения величины кожных реакций ГЗТ были получены при использовании микобактерий штаммов: BCG-1 (сенсибилизация внутрикожно) и AN-5 (сенсибилизация внутримышечно).
Известно, что дозы туберкулина: 100 и 10 ME (PPD-S) характеризуются логарифмической зависимостью (Безгин В.М.,1990), а при пересчете по Первому Международному стандарту PPD-bovine соответствуют 20 и 2 ME. Зависимость между дозой и уровнем иммунного ответа исследованных вариантов сенсибилизации морских свинок представлена на рисунке 2.
При анализе графика видно, что средние значения на две дозы у двух способов сенсибилизации: BCG-1 (внутрикожно) и AN-5 (внутримышечно) выше, чем у остальных, что свидетельствует о высоком уровне иммунного ответа. Кроме того, показатели средних значений у животных, сенсибилизированных BCG-1 внутрикожно и AN-5 внутримышечно, практически параллельны друг другу, что подтверждает равнозначность методов сенсибилизации.
Для дальнейшей статистической обработки экспериментальных данных использовали метод дисперсионного анализа. Изучаемые способы сенсибилизации морских свинок представили в виде факторов: А и В.
По результатам проведенных исследований, представленных в таблице следует, что величина кожной реакции ГЗТ значимо отличалась в зависимости от способа введения микобактерий: Рэксп (8,58) Бтабл (4,75), что свидетельствует о достоверном влиянии способа введения микобактериальных антигенов на уровень аллергической реакции. При этом штамм вводимых микобактерий достоверно не влиял на величину кожной реакции ГЗТ (Рэксп 2,41 Ртабл4,75).
Дальнейшим этапом статистического анализа являлся расчет чувствительности методов сенсибилизации по показателю - тангенс угла наклона (tga). Следует отметить, что чем больше числовой показатель tga, тем выше чувствительность метода. Проводили определение tga, по каждому животному отдельно согласно формуле: tga= (d20- d2) I (Log 20- Log2), а после определяли средние арифметические значения и коэффициенты отклонений от средних с целью получения статистически достоверных результатов. Расчетные данные тангенса угла наклона по изучаемым методам сенсибилизации морских свинок представлены в таблице 7.
Из представленных данных анализа видно, что достоверно, наиболее чувствительным является метод введения микобактерий внутримышечно, с использованием штамма 8-88 (tga = 12,34±1,9) и метод введения микобактерий внутримышечно, с использованием штамма AN-5 (tga = 9,84±0,34), а также метод введения, предусматривающий использование микобактерий штамма BCG-1 (tga= 10,4±1Д). Достоверно менее чувствительными вариантами оказались методы сенсибилизации микобактериями AN-5 (внутрикож-но) и 8-88 (внутрикожно).
