Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 17
1.1 Агглютинационные латексные методы 21
1.2 Антигенные латексные диагностикумы 32
1.3 Антительные латексные диагностикумы 35
1.4 Реакция агглютинации латекса при диагностике вирусных заболеваний 56
1.5 Значение иммунологических тестов при диагностике туберкулеза 63
2 Собственные исследования 79
2.1 Материалы, методы и объемы исследований 79
2.2 Результаты исследований 86
2.2.1 Разработка латексного туберкулезного антигенного диагностикума для выявления противотуберкулезных антител (ЛТА) 86
2.2.1.1 Выбор латексного носителя 86
2.2.2 Выделение белковой фракции из микобактерий туберкулеза и изготовление диагностикума 89
2.2.2.1 Получение контрольного латексного препарата (КЛ) 91
2.2.2.2 Изучение способов стабилизации ЛТА 92
2.2.2.3 Изучение активности ЛТА в зависимости от сроков хранения 95
2.2.2.4 Определение биологической активности и специфичности ЛТА 97
2.2.3 Исследование эффективности РАЛ с сыворотками крови крупного рогатого скота с использованием ЛТА 104
2.2.4 Разработка латексного туберкулезного антительного диагностикума для выявления комплексных антигенов микобактерий туберкулеза (ЛТАТ) 123
2.2.4.1 Изготовление диагностикума и его стандартизация 123
2.2.5 Исследование эффективности выявления антигенов микобактерий туберкулеза с помощью ЛТАТ в биологическом материале 136
2.2.6 Разработка способа диагностики туберкулеза крупного рогатого скота с помощью внутрикожных проб на интактных морских свинках 150
2.2.7 Разработка латексного антительного диагностикума для обнаружения антигенов морбилливируса (ЛЧД) 157
2.2.7.1 Изготовление диагностикума ЛЧД 160
2.2.7.2 Стандартизация диагностикума 161
2.2.8 Клинические испытания ЛЧД 166
2.2.9 Разработка латексных диагностикумов, определяющих концентрацию иммуноглобулинов класса 0(ЛД-апії IgG), А( ЛД-anti IgA), М(ЛД-апй IgM) 171
2.2.9.1 Изготовление ЛД-anti IgG, ЛД-anti IgA, ЛД-anti IgM 172
2.2.10 Использование ЛД-anti IgG, ЛД-anti IgA и ЛД-anti IgM в клинической практике 181
3 Заключение 188
4 Выводы 207
5 Практические рекомендации 212
6 Список используемой литературы 214
7 Приложение 281
- Агглютинационные латексные методы
- Значение иммунологических тестов при диагностике туберкулеза
- Изготовление диагностикума и его стандартизация
- Использование ЛД-anti IgG, ЛД-anti IgA и ЛД-anti IgM в клинической практике
Агглютинационные латексные методы
Актуальность развития лабораторных экспресс-методов, обеспечивающих оперативность получения результатов особенно значимо при диагностике инфекционных болезней. При выявлении бактериальных или вирусных антигенов, а также специфических антител наиболее чувствительными являются ИФА, РИА и реакция агглютинации сенсибилизированных частиц латекса (РАЛ) (169, 246, 412).
Способность различных частиц (эритроцитов, каолина, окиси алюминия, желатина, бентонита, латекса, нитроцеллюлозы), сенсибилизированных специфическими лигандами, агглютинироваться в присутствии второго специфического компонента исследуемого материала была известна давно (79, 142, 319, 376). Используемые в серологической практике инертные частицы-адсорбенты должны отвечать четырем основным правилам:
1. Быть стабильными в солевом и буферном растворе, не проявляя какой-либо тенденции к спонтанной агглютинации
2. Иметь приблизительно одинаковую величину частиц и не осаждаться в короткие сроки
3. Быть серологически и химически инертными
4. Обладать способностью удерживать присоединенный лиганд.
Развитие методов иммуноанализа белков, клеточных рецепторов и антигенов, а также фракционирования клеток является одной из актуальных проблем иммунологии, медицины, ветеринарии и биотехнологии. В последние годы в этой области все более широко используются полимерные дисперсные системы, в частности, латексы. Латексные микроносители, наполненные красителями или магнитными частицами, могут служить не только носителями биологических лигандов, но и выступать в качестве специфических меток, например, флуоресцентных, магнитных, окрашенных и т.п. Это дает возможность оптимизировать и повышать чувствительность некоторых видов иммунодиализа, создавать новые методы фракционирования биологических объектов. Латексы более стабильны и доступны по сравнению с биологическими носителями и могут успешно использоваться вместо них в различных иммунохимических исследованиях.
Наибольшее распространение получили методы диагностики, основанные на феномене латексагглютинации, которые с успехом используются в ветеринарии, растениеводстве, в медицине (164, 342, 372, 400). На современном этапе развития агглютинационных тестов диагностикумы представляют собой лиофилизированные или другим способом стабилизированные реагенты, пригодные для длительного хранения даже в отсутствии охлаждения. Основой реакции является взаимодействие антител, находящихся в связанном состоянии с микрочастицами, с антигеном. Значительно реже для связывания с микрочастицами используются антигенные препараты. В РАЛ микрочастицами являются частицы латекса - полимерные шарообразные образования, более или менее гомогенные по размеру (обычно с диаметром от 0,1 до 1,5 мкм) (164). Для приготовления латексных диагностикумов обычно микросферы сенсибилизируют цельной сывороткой или иммуноглобулиновой фракцией, (326, 350, 397), а также антигенными препаратами (247, 355, 382) с последующей блокировкой свободных сайтов связывания на латексных частицах бычьим сывороточным альбумином или глицином. Приготовленные таким образом реагенты отмывают и хранят при 4С. Диагностикумы достаточно стабильны и не теряют активности в течение длительного времени. Так, например, латексный реагент, приготовленный G.Kaldor с соавт. (355) был годен для работы через два года хранения. Некоторые авторы предлагают сухие латексные диагностикумы (42, 128), а также тесты с сухими диагностикумами, нанесенными на стрипы. При использовании микросферы регидратируются и в реакции используют или суспензию, или непосредственно стрипы (409).
Впервые предложенные серии латексных диагностикумов представляли собой белые суспензии, агглютинаты которых легко читались на черном фоне. В процессе развития РАЛ появились латексные диагностикумы, окрашенные в различные цвета. Так для тестирования стафилококков были предложены красные микросферы по методу Carr-Scarborough и черные (REMEL) (341). Фирмой REMEL также предложен черный латексный диагностикум для тестирования E.coli 0157:Н7. G.S.Hadfleld с соавт. (299) предложил новый метод приготовления поливалентных диагностикумов на основе различно окрашенных латексных частиц (красных, синих, зеленых) для выявления антигенов Salmonella различных серогрупп и антигенов стрептококков группы А. Латекс 24 ные частицы диаметром 2мкм каждого из цветов сенсибилизировали различными антителами, а затем диагностикумы смешивали в равных количества. Учет реакции осуществляли через 2 минуты по изменению окраски фона, вследствие удаления из реагента одного цвета (агглютината). Ю.В. Лукин, И.С. Павлова и С.К. Александер предлагают использовать для приготовления им-мунореагентов полиакролеиновыи латекс, окрашенный пиронином в розовый цвет (28, 130, 132, 167). Proulx с соавт. использовал для определения антител к вирусу иммунодефицита голубые микросферы, которые отличались большой стандартностью и стабильностью, чем ранее используемые эритроциты (382).
Реакция агглютинации латекса отвечает требованиям чувствительности, если соблюдаются определенные условия (341):
1. 100 агглютинатов (комочков) должны быть видимыми для определения результата реакции визуально
2. Каждый агглютинат должен быть размером приблизительно 50мкм
3. Для агглютинации микросфер (МСФ) необходимо наличие не менее 10 связей у вступающих в реакцию частиц
4. Объем исследуемой пробы должен быть не менее 10 мкл
Если одна частица имеет диаметр 1мкм, для образования одного види-мого агглютината необходимо 50 -10 микросфер. Таким образом, для видимой агглютинации частиц с антигенами или антителами требуется 10 5 микросфер х 100 агглютинатов х 10 связей микросфер.
Значение иммунологических тестов при диагностике туберкулеза
Неблагоприятная эпидемиологическая и социальная обстановка в Российской Федерации вызвала увеличение заболеваемости туберкулезом, как среди населения, так и среди сельскохозяйственных животных (156, 209, 21, 22, 101, 231, 159, 68, 73, 107, 160, 210, 158, 133, 78). Государственными и ведомственными ветеринарными службами Российской Федерации постоянно осуществляется оперативное слежение за эпизоотической ситуацией в регионах России, анализ и выявление причин появления и распространения туберкулеза, совершенствуются схемы и методы индикации обнаружения возбудителя на основе достижений иммунологии, молекулярной биологии, генетической инженерии: методы рестрикционного анализа, молекулярной гибридизации, геномной дактилоскопии (21, 36, 232, 234).
Способы быстрого выявления штаммов микобактерий туберкулеза чрезвычайно важны для раннего установления диагноза, выбора лечения и предупреждения распространения заболевания (122, 221, 178, 14, 215, 224, 212, 23, 88). Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза предполагают использовать как классические способы (аллергический, бактериологический, культурально-биохимический, микроскопия мазков и т.д.) так и другие, применяемые в практике противотуберкулезной службы (люминесцентная микроскопия, ИФА, видовая идентификация возбудителя методом ГЖХ, ПЦР, тонкослойная хроматография) (16,91,174,177, 90,191,126,123,152). Метод микроскопического исследования кислотоустойчивых мазков с окраской аурамином О или по Цилю-Нильсену позволяет быстро получить результаты, но не обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Частота выявления микобактерий при микроскопии мокроты составляет 27-75%о, а плевральной жидкости - до 2% у больных с подтвержденным диагнозом туберкулеза (С.Л.Арсенин с соавт. 17).
Культуральные исследования более информативны, но дают ответ о наличии туберкулезной инфекции лишь через 2-8 недель (207, 83, 166, 17). Бактериологический метод по своей разрешающей возможности стоит на третьем месте (30 - 35%) после флюорографии (50 - 55%) и ИФА (80 - 85%) (А.В.Карпов, 99). Усовершенствованные бактериологические методы (автоматические анализаторы бактериологических культур «MB/Bact», «ВАСТЕС 960», «ВАСТЕС 460», фирмы «ORGANON TECNIKA» и «BECTON DICKINSON», США) ввиду высокой стоимости подобного оборудования на данном этапе недоступны для большинства медицинских учреждений России (С.Л.Арсенин с соавт. 17; Е.М.Белиловский, 25; А.Сосновская, 193).
С 1995-1996г.г. в России в лабораторной диагностике заболеваний стали применяться молекулярно-биологические методы, с помощью которых выявляются специфические фрагменты нуклеиновых кислот инфекционных возбудителей (ДІЖ и РНК) (И.Ф.Копылова с соавт. 108; С.Н.Радюк с соавт. 179; D.M.Collins с соавт. 267; P.M.Hawkey 305; W.P.Bieger с соавт. 251). Поли-меразная цепная реакция (ГЩР), лигазная цепная реакция (ЛЦР), молекулярная гибридизация позволили усовершенствовать диагностику туберкулеза, но положительный результат этих высокочувствительных методов является основанием только для дальнейшего диагностического поиска туберкулеза, а не для окончательного диагноза (А.Н.Шаров с соавт. 229, 228). Применение метода ПЦР чревато получением большого количества ложноположительных результатов, обусловленных как техническими погрешностями, так и особенностями самого метода. Кроме того, метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микобактерий. В связи с этим ПЦР-диагностику представляется целесообразно использовать в противотуберкулезной практике только как дополнительный экспресс-метод для получения ориентировочных результатов при обязательном параллельном применении классических методов диагностики туберкулеза. Также следует принимать во внимание относительно высокую стоимость проведения ПЦР (С.Е.Борисов, 30; Е.М.Скрягина с соавт. 189). Кроме того, вышеперечисленные методы молекулярной гибридизации не отличаются массовой доступностью для любой лаборатории. Поэтому существование таких высокочувствительных методов, наряду с использованием аллергических способов (туберкулиновые тесты) не исключает развитие не менее чувствительных иммунологических методов, которые могут быть незаменимы при скрининговых мероприятиях.
Иммунологические исследования - одно из наиболее широко развивающихся направлений современной лабораторной диагностики (В.В.Меньшиков, 145, 147, 102). Вопросы исследования механизмов и путей реализации системы иммунологического надзора, обеспечивающего сохранение постоянства видов и индивидуумов, потребовали новых методических приемов и создания оригинальных методов исследования. Методы, используемые в современной классической и экспериментальной иммунологии для решения различных задач, начиная от выделения антител и антигенов, иммунокомпетентных клеток и кончая определением их специфичности подробно описаны в известной литературе (172, 173, 84, 219, 149, 143, 72).
Постоянно существует проблема унификации иммунологических исследований на туберкулез, совершенствование качества и эффективности тест-систем по таким аспектам, как специфичность и чувствительность метода, т.е. необходимо постоянное совершенствование существующих и создание новых тест-систем для диагностики туберкулеза, используемых в противоэпизоотиче-ских мероприятиях (222, 218, 82). Иммунодиагностике в эпизоотическом процессе при туберкулезе уделяется большое внимание. С применением серологической и аллергической диагностики (по сравнению с бактериологической) удается выявить в неблагополучном очаге во много раз большее количество инфицированных животных. Иммунодиагностика весьма ценна тем, что является специфическим массовым методом обследования поголовья, без которого трудно получить подлинную информацию об эпизоотической ситуации хозяйства и района. Выявление источника инфекции - это основа профилактики и санации окружающей среды (105).
Изготовление диагностикума и его стандартизация
При получении латексного антительного диагностикума ЛТАТ в качестве носителя применяли розовый полиакролеиновый латекс АКРОЛАР-к (размеры частиц 1,8мкм), поверхность которого сенсибилизировали специфическими антителами.
Для получения антител к микобактериям бычьего вида (штамм Vallee) использовали кроликов породы шиншилла весом 3-3,5 кг. Иммунизацию животных проводили тремя разными материалами. Для каждой брали по 3 кролика. Для приготовления I серии иммунного материала, убитого 2% фенолом, влажную бактериальную массу в количестве 5,0 г помещали в коллодиевые пистоны и замораживали при -40С в течение 18 часов. С помощью бактериального пресса (аппаратура ГНИИЭМ) микробную массу разрушали при давлении 25 атм. и температуре -40С. Полученный препарат микобактерий отмывали 2 раза изотоническим раствором хлорида натрия с последующим центрифугированием при 1500g 30 мин. Осадок бактериальных стенок помещали во флаконы и хранили в морозильной камере. Для серий II и III материал для иммунизации получен путем разрушения убитых 2% фенолом бактериальных клеток на ультразвуковом дезинтеграторе (УЗДН-2Т) при частоте 22 кГц с водяным охлаждением. Для дезинтеграции применяли режим прерывистых циклов: 8 циклов по 2 минуты непрерывного озвучивания суспензии бактериальных клеток с 2-х минутной паузой. Суспензия клеток, которая подвергалась обработке на дезинтеграторе составляла 20 г на 100 мл 0,015М трис-глицинового буфера с рН 8,4- 8,6 (для II серии) и 20 г на 100 мл 0,01М фосфатного буфера с рН 7,4-7,6 (для серии III). Материал для иммунизации кроликов серии II представлял собой стенки бактериальных клеток, полученных из дезинтеграта путем осаждения с помощью центрифугирования при 6000g 20 минут с охлаждением и отмывкой полученного осадка 2 раза 0,01М фосфатным буфером с рН 7,4-7,6. Иммунный материал III серии - дезинтеграт без разделения твердой и жидкой фазы сониката.
Антигенный материал вводили кроликам внутрикожно по 100 мг (вес влажного материала) в неполном адъюванте Фройнда 0,8 мл с 7-ми дневным интервалом пятикратно. Кровь от кроликов брали через 7-8 дней после последней инъекции иммунного материала в количестве 30-40 мл и обрабатывали общепринятым методом. Активность полученных сывороток определяли путем постановки РАЛ с изготовленным нами латексным антигенным туберкулезным диагностикумом (ЛТА). Данные представлены в табл. 14 и на рис.5.
Активность сывороток от кроликов колебалась в пределах титров 1:16 до 1:512. Из сывороток кроликов с титрами не ниже 1:64 выделяли фракцию иммуноглобулинов методом высаливания 50% раствором сульфата аммония, а концентрацию белка в иммуноглобулиновых препаратах определяли на спектрофотометре по методу Варбурга. Полученные фракции гамма-глобулинов использовали для получения латексных антительных диагностикумов. Полиак-ролеиновый латекс (АКРОЛАР-к, марка ПЗ-Б2) суспендировали в 0,01М фосфатном буфере (рН 7,4-7,6) до концентрации 0,2%. К полученной суспензии постепенно добавляли раствор гамма-глобулина из расчета 100-70 мкг на 1 мл 0,2% суспензии латекса. Смесь инкубировали в течение 3-х часов при комнатной температуре, периодически помешивая. Сенсибилизированный латекс осаждали центрифугированием при 3000 об/мин. и отмывали от несвязавшегося гамма-глобулина 0,01М фосфатным буфером (рН 7,4 - 7,6). Свободные альдегидные группы латекса блокировали 1% раствором глицина в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,4 - 7,6) в течение ЗОмин. при комнатной температуре. Полученный коньюгат отмывали 0,01М фосфатным буфером (рН 7,4-7,6), а затем деионизированной водой (рН 7,6) с использованием центрифугирования. Готовый латексный антительный диагностикум суспендировали в стабилизирующем растворе (7% водный раствор сахарозы) до концентрации 0,4%, разливали по ампулам и лиофильно высушивали в условиях вакуума в сублимационной камере LZ-9 (завод Фригера, ЧССР).
Контрольный латексный препарат (КЛ) готовили с использованием нормальных антител из гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови здорового кролика по вышеописанному способу. Аналогично получали лиофильно высушенный КЛ.
Активность латексных антительных диагностикумов (ЛТАТ), полученных при использовании трех серий иммуноглобулинов из иммунных сывороток к M.bovis (nrr.Vallee), исследовалась в сравнительном анализе в РАЛ с антигенным препаратом, представляющим собой соникат из M.bovis с концентрацией белка 2мг/мл. РАЛ ставили по принципу, описанному в главе «Материалы и методы» в разводящей жидкости с 1% водным раствором глицина (рН 8,6). Данные сравнительного анализа представлены в табл. 15 и на рис.6.
Наибольшая активность наблюдалась у I серии ЛТАТ, поэтому для стандартизации ЛТАТ использовали препарат I серии.
Для проведения стандартизации ЛТАТ в отношении его активности и специфичности использовали музейные образцы штаммов H37Ra(M.tuberculosis), Vallee, BCG (M.bovis), №.5 и №2 (M.avium), и по штамму видов: M.fortuitum, M.smegmatis, M.kansasii, M.phlei, Nocardia asteroides, Nocardia brasilensis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и Escherichia coli.
Культуры из микобактерий и нокардий, выращенные на среде Левен-штейна-Иенсена, гомогенизировали в разводящем растворе (1% водный раствор глицина, рН 8,6-8,8). Подобным образом готовили суспензии клеток St.aureus, Ent.faecalis и E.coli, выращенных на мясо-пептонном агаре. Исходная концентрация бактериальных клеток составляла по стандарту мутности 1,5 мг/мл. Суспензию указанных выше штаммов титровали в иммунологическом планшете, используя разводящий раствор, до разведения 1:256 в объеме 50 мкл в лунке. К каждому разведению добавляли равное количество ЛТАТ. Параллельно исследуемый материал испытывали с контрольным латексом. Полученные данные представлены в табл. 16.
Использование ЛД-anti IgG, ЛД-anti IgA и ЛД-anti IgM в клинической практике
Весьма важным является знание концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови на разных стадиях состояния животных и человека. Основную массу сывороточных иммуноглобулинов составляют IgG - 70-80%, IgA -10-15%, IgM - 5-10%. Иммуноглобулинов класса Е и D очень мало - около 0,2% (172). По данным Института им. Гамалея у взрослых людей среднее содержание IgG соответствовало 11,2 мг/мл, IgA - 1,78 мг/мл, IgM - 1,21 мг/мл.
Разработанные нами диагностикумы были направлены на выявление IgG, IgA и IgM, учитывая, что при некоторых патологических расстройствах наблюдаются их значительные отклонения от нормальных уровней.
С большими трудностями сопряжена диагностика внутриутробных инфекций у детей, особенно вирусных (93, 217, 180, 12, 76). Синтез IgM у новорожденных неинтенсивен и уровень их у здоровых лиц имеет очень низкое значение, а определение концентрации иммуноглобулинов этого класса у новорожденных очень важно. Известно, что плацента матери не пропускает в организм плода с током крови IgM, ввиду большого размера этой молекулы (93). Концентрация IgM в пуповинной крови обычно составляет 0,3-0,55 мг/мл (93, 13) Поэтому появление определенного количества IgM в крови новорожденного может свидетельствовать как о небольшом антигенном раздражении иммунной системы плода (IgM= 0,7-1,0мг/мл), так и о внутриутробном инфицировании (IgM=l,0-1.5 мг/мл) Уровень IgM у детей зависит от возраста и обычно соответствует до 1 года 0,39-1,29 мг/мл; 1-3 года - 0,46-1,51 мг/мл; 3-7 лет - 0,54-1,47 мг/мл; 7-16 лет - 0,53-1,44 мг/мл (13). Латексный диагностикум для выявления IgM (ЛД-anti IgM) был апробирован в плане клинического применения при исследовании сывороток новорожденных (родильный дом №1 г. Нижний Новгород) от 153 лиц. Данные исследования 20 сывороток приведены в табл. 28.
Как следует из представленных результатов, с помощью метода Манчини IgM удалось выявить только в 45% случаев, в то время как методом РАЛ IgM в различных количествах определяется в 100% проб. Показано, что иммуноглобулины класса М присутствуют в крови здоровых новорожденных в титре не выше 1:1280 (0,45 мг/мл по Манчини). Исключение в данной группе проб представляет сыворотка №20, в которой концентрация IgM составляет 1:5120. Высокое содержание IgM в одном случае подтверждается при исследовании сыворотки по способу Манчини (2 мг/мл). Появление IgM в такой концентрации в сыворотке крови новорожденного говорит или о нарушении проницаемости плацента матери, или о внутриутробном инфицировании.
Апробацию набора диагностикумов ЛД-anti IgG, ЛД-anti IgA и ЛД-anti IgM проводили на базе клиники НИИ эпидемиологии и микробиологии (г. Нижний Новгород), областной детской больницы (г. Нижний Новгород), противотуберкулезного диспансера (г. Нижний Новгород) и станции переливания крови (г. Нижний Новгород). Было исследовано 230 сывороток крови. Для проведения сравнительного анализа концентрацию иммуноглобулинов определяли двумя способами: в РАЛ и по методу Манчини. Данные по изучению 50 сывороток приведены в табл. 29.
Показано, что РАЛ выявляет иммуноглобулины класса G, А и М в границах, соответствующих значениям, используемым в клинической практике для оценки изменений их концентрации. Преимуществом РАЛ в данном случае является экспрессное определение значительных отклонений содержания иммуноглобулинов от средней нормы, что имеет важное клиническое значение.
Таким образом показано, что РАЛ вполне пригодна и информативна для определения концентрации иммуноглобулинов трех основных классов G, А и М в сыворотках крови у лиц различного возраста и состояния здоровья. Предлагаемый тест прост в исполнении, доступен для любой лаборатории, позволяет исследовать сыворотку крови в динамике ex tempore и, что особенно важно, для экспрессного выявления внутриутробной инфекции у новорожденных.
По результатам исследования получено положительное решение: Способ количественного определения иммуноглобулинов класса М: п.р. по заявке № 2001104693/14 (004705) РФ, МПК 7 G 01 № 33/53.
