Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Исторический очерк развития представлений о лимфомах и эволюция гистологических классификаций неходжкинских лимфом 16
1.2 Онтогенетические основы морфологической диагностики лимфом 37
1.3 Методические основы иммуногистохимии и характеристика иммунологических маркеров, применяемых в морфологической диагностике лимфом 58
Глава 2. Материалы и методы исследований 83
2.1 Гистологические методы исследования биопсийного материала 83
2.2 Методика иммуногистохимического исследования биопсийного и операционного материала 85
2.3 Методы клинического обследования больных лимфомами 91
2.4 Методы математической обработки результатов исследования 92
Глава 3. Общая характеристика обследованной группы пациентов с неходжкинскими лимфомами 94
3.1 Общая клиническая характеристика больных неходжкинскими лимфомами 94
3.2 Анализ частоты встречаемости различных вариантов неходжкинских лимфом 112
Глава 4. Дифференциальная диагностика диффузных крупноклеточных лимфом 128
4.1 Морфология диффузных крупноклеточных В-кпеточных лимфом 129
4.2 Результаты иммуногистохимического анализа диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом 142
4.3 Морфология и иммунофенотип медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы 165
4.4 Морфология и иммунофенотип внутрисосудистой крупноклеточной В-клеточной лимфомы 169
4.5 Морфология и иммунофенотип лимфом Беркитта 172
4.6 Характеристика морфологических признаков и оптимизация иммуногистохимического исследования с целью дифференциальной диагностики крупноклеточных лимфом диффузного строения 181
Глава 5. Дифференциальная диагностика диффузных мелкоклеточных лимфом 187
5.1 Морфология и иммунофенотип В-клеточной лимфомы из малых лимфоцитов 189
5.2 Морфология и иммунофенотип лимфомы из клеток зоны мантии .209
5.3 Морфология и иммунофенотип лимфом маргинальной зоны 222
5.4 Морфология и иммунофенотип лимфоплазмоцитарной лимфомы...238
5.5 Морфология и иммунофенотип волосатоклеточного лейкоза 243
5.6 Морфология и иммунофенотип фолликулярных лимфом диффузного строения 247
5.7 Характеристика морфологических признаков и оптимизация иммуногистохимического исследования с целью дифференциальной диагностики диффузных лимфом из мелких клеток 250
Глава 6. Дифференциальная диагностика лимфом из клеток с властной морфологией 258
6.1 Морфология и иммунофенотип лимфом из клеток-предшественников В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов (В- и Т-лимфобластных лимфом) 259
6.2 Морфология и иммунофенотип NK-клеточной бластной лимфомы 279 6.3 Характеристика гистологических признаков лимфом из клеток с бластной морфологией и оптимизация иммуногистохимического исследования с целью дифференциальной диагностики 284
Глава 7. Дифференциальная диагностика лимфом полиморфноклеточного и анапластического строения 289
7.1 Морфология и иммунофенотип ангиоиммунобластной лимфомы 291
7.2 Морфология и иммунофенотип панникулитоподобной Т-клеточной лимфомы подкожной жировой клетчатки 308
7.3 Морфология и иммунофенотип экстранодалыюй МС/Т-клеточной лимфомы назального типа 313
7.4 Морфология и иммунофенотип Т-клеточной лимфомы типа энтеропатии 319
7.5 Морфология и иммунофенотип лимфомы из клеток с иммуно- фенотипом периферических Т-лимфоцитов, неуточненной 322
7.6 Морфология и иммунофенотип Т-клеточного пролимфоцитарного лейкоза 338
7.7 Морфологическая картина и иммунофенотип крупноклеточной анапластической лимфомы 341
7.8 Характеристика гистологических признаков лимфом полиморфноклеточного и анапластического строения и оптимизация иммуногистохимического исследования с целью дифференциальной диагностики 365
Глава 8. Дифференциальная диагностика опухолевых и гиперпластических процессов фолликулярного строения в лимфоидной ткани 377
8.1 Морфология и иммунофенотип фолликулярных лимфом 378
8.2 Характеристика морфологических признаков и оптимизация иммуногистохимического исследования с целью дифференциальной диагностики фолликулярных лимфом и фолликулярной гиперплазии лимфатических узлов 402
Заключение 409
Выводы 420
Практические рекомендации 423
Список литературы 425
Приложения 554
- Онтогенетические основы морфологической диагностики лимфом
- Методика иммуногистохимического исследования биопсийного и операционного материала
- Анализ частоты встречаемости различных вариантов неходжкинских лимфом
- Результаты иммуногистохимического анализа диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Лимфомы являются гетерогенной группой злокачественных опухолей лимфоидной ткани, которые традиционно делят на лимфому Ходжкина (лимфогранулематоз) и неходжюшские лимфомы [59, 141, 524, 687,810].
В странах, где достоверная регистрация впервые выявленных случаев злокачественных опухолей позволяет сравнивать заболеваемость в прошлом и настоящем, отмечается ощутимый рост заболеваемости неходжкинскими лим- фомами [487, 661, 833]. С 70-х годов XX века в Соединенных Штатах Америки ежегодный прирост заболеваемости неходжкинскими лимфомами составляет 3— 4%. Долгосрочное популяционное исследование по программе SEER Национального института рака США обнаружило для всех полов и возрастных групп почти двухкратный рост заболеваемости лимфомами в Соединенных Штатах за последние 28 лет прошедшего столетия (с 10,2 на 100000/г в 1973 г. до 19,0 на 100000/г в 2000 г.) [258, 426]. Увеличение частоты новых случаев неходжкин- ских лимфом происходит в мужской и женской популяции, во всех возрастных и этнических группах; особенно быстрый рост заболеваемости отмечается у пожилых, в возрасте старше 75 лет [188, 468, 489, 848]. Такой прирост только отчасти объясняется увеличением продолжительности жизни, совершенствованием методов диагностики и эпидемией СПИДа — заболевания, ассоциированного с высоким риском развития опухолей иммунекомпетентной системы [103, 186, 1012]. Констатация устойчивой тенденции роста заболеваемости неходжкинскими лимфомами стала главным результатом изучения новейшей истории этого вида опухолей.
Наиболее впечатляющие результаты современной клинической онкологии связаны с лечением опухолей кроветворной и лимфоидной тканей. В большинстве случаев лимфом Ходжкина и неходжкинских лимфом с агрессивным клиническим течением принципиальной задачей терапии является излечение больного. Многие современные схемы комбинированного лечения лимфом специализированы, поскольку разрабатывались с учетом морфологического варианта и стадии опухолевого процесса [7, 28, 29, 42, 302, 303, 1094]. Широкое распространение получают методы рецепторно-опосредованной терапии лимфом [423, ИЗО].
Морфологический вариант неходжкинской лимфомы является важнейшим независимым фактором прогноза течения заболевания [14, 38, 64, 508, 791, 873], пятилетняя выживаемость в группе больных с лимфомой из клеток зоны мантии, Т-клеточными лимфомами с иммунофенотипом периферических лимфоцитов, Т-лимфобластными лимфомами оказывается менее 30%, а в группе фолликулярных лимфом, анапластических крупноклеточных лимфом и лимфом из клеток маргинальной зоны — более 70% [448].
Морфологическая диагностика лимфом остается одним из наиболее трудных разделов онкоморфологии [43]. Объективные причины трудностей диагностики обусловлены особенностями как лимфоидной ткани, так и опухолей, связанных с ней гистогенетически. Лимфоидная ткань имеет сложный гистогенез, выраженную морфологическую гетерогенность и характеризуется высокой функциональной динамичностью [3, 18, 19, 693, 841]. Лимфомы — опухоли лимфоидной ткани — не только несут на себе отпечаток этих особенностей, но и отличаются многообразием вариантов, близостью гистологического строения некоторых вариантов лимфом, морфологическим сходством нормальных и опухолевых клеток и сходством гистологических проявлений некоторых реактивных процессов и опухолей лимфоидной ткани [420, 434].
Многообразие морфологических вариантов неходжюшских лимфом и быстрое развитие методов экспериментальной иммунологии и молекулярной патологии привели к созданию последовательности быстро сменяющихся морфологических классификаций опухолей лимфоидной ткани [8, 123, 319, 451, 655, 688, 689, 690, 717, 791, 901], последней из которых стала классификация ВОЗ, опубликованная в 2001 году [532]. Она содержит описание эпидемиологических и клинических особенностей, гистологического строения, иммуно- фенотипа, молекулярно-генетических аномалий и факторов прогноза 40 форм неходжкинских лимфом и 5 вариантов лимфомы Ходжкина (лимфогранулематоза). Классификация была расширена и дополнена в 2005 г. в части, касающейся лимфом кожи [1124].
Определяющими признаками в классификации ВОЗ 2001 г. опухолей лимфоидной ткани стали клинические проявления (первичная локализация), цитологический состав и гистологическое строение, иммунофенотип клеток опухоли. Многие лимфомы характеризуются сходством строения, а иногда просто неразличимы при исследовании традиционных гистологических препаратов [1]. Проведение иммуногистохимического исследования признается обязательным компонентом морфологического диагноза лимфомы [452, 532].
Иммунофенотипические характеристики лимфом имеют популяционно- статистический характер, в литературных источниках частного и обобщающего содержания приводятся частоты выявления экспрессии того или иного антигена в однородной выборке лимфом [14, 72, 190, 198, 254, 602, 780, 1025, 1026]. Для различных лимфом, которые могут иметь значительное сходство гистологического строения, набор иммунологических признаков и частоты экспрессии существенно отличаются. Подбор соответствующей панели иммунологических маркеров определяется опытом исследователя, материально-техническими возможностями лаборатории, а не устоявшимися алгоритмами дифференциальной диагностики сходных явлений, как это принято в госпитальной клинической практике [1, 17, 40, 44].
В течение последних трех десятилетий в отечественной онкогематоло- гии углубляется разрыв между постоянно возрастающей информативностью методов лучевой и эндоскопической диагностики и возможностями цитологического и гистологического анализа опухолей [37]. В подавляющем большинстве специализированных лечебных учреждений используются рутинные гистологические методы исследования, что не позволяет ни патоморфологам, ни гематологам получить информацию, соответствующую сегодняшнему уровню научных представлении в онкологии. Следствием отставания в методах морфологической диагностики являются неточная верификация лимфом [25], проблематичность решения ряда сложных вопросов дифференциальной диагностики, лежащих за пределами возможностей рутинных методов исследования, несоответствие гистологических диагнозов современным международным классификациям, предполагающим использование иммуногистохимических и молеку- лярно-генетических методов исследования, затруднение работы клиницистов по выделению групп риска на основании учета иммунофенотипических и молекул яр но-генетических характеристик опухолевых клеток, как этого требует повседневная практика [42].
В отечественной литературе дано фрагментарное описание некоторых морфологических вариантов неходжкинских лимфом, основанное на отдельных наблюдениях или небольших выборках [20, 24, 26, 27, 28, 32, 33, 35, 39, 48], но не представлен анализ частоты встречаемости основных морфологических вариантов лимфом, верифицированных в соответствии с одной из общепринятых ранее международных классификаций или классификацией ВОЗ 2001 года.
Опубликованные в специальной литературе данные содержат противоречивую информацию о частоте экспрессии практически каждого антигена, обнаружение которого имеет диагностическое значение [1071]. Недостаточно полно исследованы отличительные гистологические признаки и особенности иммунофенотипа опухолевых клеток неходжкинских лимфом, которые имеют выраженное сходство гистологического строения. Гистологический анализ и выбор панели иммунологических маркеров для верификации диагноза опухолей лимфоидной ткани в отечественной монографической литературе оказываются разобщенными [36, 40], а в периодической — часто опираются на индивидуальные подходы авторов и не содержат оценки информативности признаков, используемые в доказательной медицине [17, 24, 26, 32, 35, 39, 44].
Целью работы является оптимизация морфологической дифференциальной диагностики неходжкинских лимфом в группах опухолей лимфоидной ткани, имеющих выраженное сходство гистологического строения, на основе оценки диагностической информативности дифференциальных признаков и минимальной достаточности иммуногистохимического исследования.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать гистологическое строение и иммунофенотип опухолевых клеток в отдельных клинико-морфологических вариантах неходжкинских лимфом, выделенных в соответствии с классификацией ВОЗ 2001 года в обследованной группе больных.
Оценить относительную частоту выявления отдельных клинико-морфологических вариантов неходжкинских лимфом на основе результатов работы па- томорфологической лаборатории в Северо-Западном регионе России и провести сравнительный анализ с сопоставимыми данными из других регионов.
Дать клиническую характеристику больных различными клинико- морфологическими вариантами неходжкинских лимфом на основе данных первичного определения стадии опухолевого процесса и охарактеризовать особенности клинической картины отдельных видов лимфом.
Оценить чувствительность и специфичность гистологических и имму- нофенотипических признаков, отношения правдоподобия положительных и отрицательных результатов и другие характеристики диагностических тестов, использованных в иммуногистохимической дифференциальной диагностике при исследовании гистологически сходных вариантов неходжкинских лимфом.
Выявить комбинации гистологических и иммунофенотипических признаков, имеющие наибольшее дифференциально-диагностическое значение при морфологическом исследовании лимфом в группах, объединенных выраженным сходством гистологического строения.
На основании полученных показателей информативности дифференциально-диагностических признаков определить оптимальный объем и структуру иммуногистохимического исследования для каждой группы неходжкин- ских лимфом, объединенных сходством гистологического строения.
Научная новизна. Впервые на репрезентативном биопсийном и клиническом материале, полученном в результате исследования 1024 первичных больных неходжкинскими лимфомами и 61 пациента с реактивной лим- фаденопатией с помощью гистологического и иммуногистохимического методов выполнена идентификация опухолей лимфоидной ткани в соответствии с классификацией ВОЗ 2001 года, установлена частота выявления отдельных клинико-морфологических вариантов неходжкинских лимфом в обследованной выборке. В работе исследованы диагностические характеристики гистологических и иммуногистохимических признаков, позволяющ1гх дифференцировать гистологически сходные формы опухолей лимфоидной ткани. Методами анализа информативности диагностических признаков определены оптимальные по объему и структуре способы дифференциальной диагностики неходжкинских лимфом, имеющих сходство гистологического строения.
Основные положения, выносимые на защиту
На основании выявленных отличий в частотах встречаемости различного вида неходжкинских лимфом в выборке из 400 последовательных впервые диагностированных лимфом у пациентов, проживающих преимущественно в Северо-Западном регионе России, по сравнению с данными эпидемиологических исследований в других странах, следует ожидать значительного регионального разнообразия в относительной частоте возникновения морфологических вариантов неходжкинских лимфом в России — географически протяженной и этнически разнородной.
Гистологическое исследование неходжкинских лимфом в биопсийном и операционном материале дает возможность отнести лимфому к одной из групп опухолей с выраженными чертами морфологического сходства и позволяет сформулировать дифференциально-диагностическую гипотезу для проведения иммуногистохимического исследования, но не может иметь целью определение нозологического диагноза в соответствии с классификацией ВОЗ (2001 г.) опухолей лимфоидной ткани.
3. В морфологической дифференциальной диагностике неходжкинских лимфом, характеризующихся сходством гистологического строения, наибольшее диагностическое значение следует придавать признакам, которые по своему происхождению являются гистогенетическими и патогенетическими.
Практическая значимость работы. В исследовании получены результаты, свидетельствующие о существенных различиях в относительных частотах выявления некоторых видов неходжкинских лимфом у пациентов, проживающих преимущественно в Северо-Западном регионе России, по сравнению с данными эпидемиологических исследований в других странах. Изучены гистологические признаки, иммунофенотипические характеристики неходжкинских лимфом, позволяющие дифференцировать их в группах опухолей сходного гистологического строения. Даны количественные оценки диагностической ценности гистологических и иммуногистохимических признаков отдельных форм неходжкинских лимфом для дифференциальной диагностики опухолей сходного гистологического строения. Для каждой группы неходжкинских лимфом со сходным гистологическим строением определен оптимальный состав панелей иммуногистохимических маркеров, позволяющих провести дифференциальную диагностику нозологических форм, образующих группу.
Реализация результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практическую деятельность Гематологического центра Главного военного клинического госпиталя имени академика Н. Н. Бурденко; 2 Центрального военного клинического госпиталя имени П. В. Мандрыка; 3 Центрального военного клинического госпиталя имени академика А. А. Вишневского; ГУЗ «Ленинградская областная клиническая больница»; ГУЗ «62 онкологическая больница», г. Москва; ГУЗ «Свердловское областное патологоанатомическое бюро»; ГУЗ «Свердловская областная клиническая больница №1»; ГУЗ «Клинический онкологический диспансер МЗ Республики Татарстан», г. Казань; Киевской городской онкологической больницы.
Научные положения, обоснованные в диссертации, используются в преподавании вопросов патологии опухолей лимфоидной ткани на кафедре патологической анатомии с курсом цитологии ГОУ ДПО СПб МАЛО и кафедре факультетской терапии ГОУ ВПО ВМедА имени С.М. Кирова.
Апробация работы. Материалы и результаты исследования докладывались на научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической онкологии», Санкт-Петербург, 1995 г.; Всеармейской научной конференции «Актуальные вопросы гематологии», Санкт-Петербург, 1995 г.; III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов, Санкт-Петербург, 1996 г.; научно-практической конференции «Диагностика и лечение злокачественных лимфом», Санкт-Петербург, 1997 г.; международной конференции «Диагностика, патогенез и лечение злокачественных лимфом», Санкт- Петербург, 1998 г.; научно-практической конференции «Гематологический диагноз в лаборатории», Санкт-Петербург, 1999 г.; на заседании Санкт- Петербургской ассоциации патологоанатомов, 1999 г.; научной конференции «Актуальные вопросы клинической патоморфологии», Санкт-Петербург, 2000 г.; гематологическом декаднике «Новое в гематологии и трансфузиологии», Москва, 2001 г.; Первом съезде гематологов России, Москва, 2002 г.; конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения лимфом», г. Екатеринбург, 2002 г.; научно-практической конференции с международным участием «Онкология - XXII», г. Киев, 2003 г.; V Всероссийской школе- семинаре «Иммуногистохимическая диагностика опухолей», г. Казань, 2004 г.; II Российской конференции с международным участием «Злокачественные лимфомы», Москва, 24-25 октября 2005 г.; Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы клинической патоморфологии», Санкт-Петербург, 17-18 ноября 2005 г.
По теме диссертации опубликовано 49 научных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 560 страницах машинописного текста, состоит из введения, 8 глав (включающих обзор литературы, характеристику методов исследования, результаты собственных наблюдений и их обсуждение), заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 64 таблицами и 62 рисунками. Библиографический указатель включает 1165 источников, из которых 48 отечественных и 1117 иностранных авторов.
Онтогенетические основы морфологической диагностики лимфом
Задачи диагностической онкоморфологии почти не изменились со времени, когда М. М. Рудневым в 1875 году было выполнено первое прижизненное диагностическое гистологическое исследование [31]. Накопление более чем 130-летнего опыта в этом разделе гистопатологии убеждает в важности четкого указания целей и задач, стоящих перед патоморфологом при исследовании операционного и биопсийного материала. Каждое исследование должно определить [15]: 1) является ли процесс опухолевым или неопухолевым; 2) является ли опухоль злокачественной или доброкачественной; 3) гистогенез опухоли; 4) гистологическую форму опухоли согласно современным классификациям; 5) степень злокачественности с учетом возможной гетерогенности опухоли; 6) функциональные особенности опухоли (пролиферативная активность, гормональная чувствительность и др.); 7) распространенность опухолевого процесса (мультицентрический, ин- вазивный рост, опухолевая эмболия, метастазирование); 8) фоновые изменения в пораженном органе; 9) реактивные изменения в пораженном органе; 10) проявления и степень выраженности терапевтического патоморфоза злокачественной опухоли в ходе лечения.
Применение методов сравнительной гистологии (в узком смысле) позволяет в некоторых случаях, учитывая нормальное гистологическое строение тканей и органов, их эмбриогенез, результаты экспериментов с культурами тканей, установить гистогенез опухоли. После того, как В. Fischer-Wasels показал относительную гистогенетическую ценность критериев гистологического сходства опухолей и нормальных тканей, принцип «гистология опухоли не есть ее гистогенез» резко ограничил возможности гистогенетического анализа опухолей на основе методологии традиционной онкоморфологии. «Для целей изучения опухолей необходимо подчеркнуть, — писал ученый, — что сама по себе гистологическая структура мало или совсем ничего не говорит о гистогенезе опухолей» (цитируется по [12]). Одним из наиболее крупных достижений в области исследования гистогенеза лимфоидной ткани были работы А. А. Максимова, выполненные в 1922-1923 гг. на основе изучения тканевых культур [726].
Выделить лимфомы в изолированную группу и связать их происхождение с гистогенезом лимфоидной ткани оказалось сложной и не до конца разрешенной задачей. В самом общем смысле гистогенез лимфом понятен по определению: лимфома — злокачественная опухоль иммунной системы, или, более точно, опухоль лимфоидных клеток и клеток-предшественников лимфо- поэза. Главная идея гистогенетического анализа лимфом, которая не изменилась за несколько последних десятилетий, заключается в поиске для каждой лимфоидной опухоли прототипа среди репертуара лимфоцитов разных стадий дифференцировки. Первоначальные исследования учитывали размеры опухолевых и неопухолевых клеток (лимфоциты, лимфобласты, ретикулярные клетки), тканевое устройство (диффузный, узловой, фолликулярный рост). Постепенно добавлялись цитологические детали, имеющие гистогенетическое значение (расщепленное ядро), и, что более существенно, представление о дихотомической дифференцировке иммунной системы и существовании центральных и периферических органов иммуногенеза. Основной объем знаний о линейной принадлежности (В-, Т-, NK-клетки), дифференцировке и функциональных особенностях клеток лимфоидных органов и опухолей лимфоидной ткани был получен с помощью методов иммунофенотипирования и анализа мутаций генов, для В-лимфоцитов в первую очередь - генов иммуноглобулинов, для Т-клеток — генов Т-клеточного рецептора, а также анализа уровня экспрессии множества генов с помощью технологии микрочипов.
В соответствии с линейным устройством иммунной системы лимфомы разделяют на В- и Т-клеточные опухоли, небольшая часть опухолей имеет фенотип естественных киллеров (1ЯК-клеточные). С помощью анализа цитологических свойств и иммунофенотипа опухолевых клеток подавляющее большинство лимфом в каждой линейной группе ставят в соответствии с одним из двух этапов дифференцировки лимфоидных клеток. Первый этап состоит из последовательности антиген-независимых трансформаций стволовой лимфоидной клетки в функционально зрелые лимфоидные клетки, этому этапу соответствуют лимфобластные лимфомы или лимфомы из клеток-предшественников. Второй этап дифференцировки зрелые лимфоидные клетки проходят под воздействием специфической антигенной стимуляции или неспецифического воздействия, например цитокинов.
Основными генетическими повреждениями, приводящими к возникновению лимфом, как и других опухолей, являются инактивация генов- супрессоров опухолевого роста и активация протоонкогенов. Для возникновения опухоли необходима инактивация обеих копий гена-супрессора, чаще одна копия утрачивается в результате делеции, а другая подвергается мутации. Активация протоонкогенов в большинстве случаев лимфом наступает в результате транслокации, которая приводит к изменению его экспрессии и не затрагивает структуру протоонкогена. Другим механизмом активации является возникновение в результате транслокации химерного гена, экспрессия которого приводит к синтезу химерного белка с онкогенными свойствами.
Методика иммуногистохимического исследования биопсийного и операционного материала
Для иммуногистохимического исследования выбирали блок, ориентируясь на результаты исследования препаратов, окрашенных гематоксилин- эозином и азур П-эозином. В 316 случаях опухолевая ткань исследовалась в составе 23 «тканевых матриц» [382, 610, 981, 1084], в которых были собраны 324 фрагмента ткани. Для каждой из 23 матриц были подобраны лимфомы из групп, характеризующихся сходством гистологического строения (диффузная пролиферация бластных клеток, диффузная пролиферация крупных лимфоид- ньтх клеток, диффузная пролиферация мелких лимфоидных клеток). Это позволило применить для исследования каждой тканевой матрицы набор иммунологических маркеров, соответствующий задаче дифференциальной диагностики.
Срезы изготовляли толщиной 3-4 мкм, наклеивали на чистые тонкие предметные стекла. Чтобы срезы не отлипали от стекла в ходе дальнейшей обработки, предметные стекла предварительно покрывали 0,01% водным раствором Ь-полилизина. Иммуногистохимическое исследование состояло из следующих этапов, содержание которых имело критическое влияние на качество иммуногистохимических препаратов. 1. Ингибирование эндогенной пероксидазы.
Эта стадия обеспечивала специфичность гистохимической реакции с хромогеном, используемым для выявления меченного пероксидазой комплекса антител в месте локализации антигена. Используется раствор перекиси водорода в метаноле, истощающий активность эндогенных тканевых пероксидаз и ка- талаз, чтобы реакция с хромогеном выявляла только пероксидазную метку комплекса антител. 2. Демаскирование антигенов.
Усилить интенсивность иммуногистохимических реакций удавалось обработкой парафиновых срезов протеолитическими ферментами и высокой температурой. Тепловую обработку срезов проводили в бытовой кастрюле- скороварке в течение 4 мин при температуре 105С.
Для улучшения иммунологической реактивности некоторых антигенов (С021, иммуноглобулинов и др.) использовали протеолитическую обработку срезов. Продолжительность обработки протеазами зависела от длительности фиксации ткани и природы исследуемого антигена и подбиралась в каждом случае опытным путем. 3. Обработка нормальной (неспецифической) сывороткой.
Неспецифическое окрашивание уменьшали предварительной обработкой срезов неиммунной сывороткой животного, донора вторых антител. Сыворотка блокировала большинство участков неспецифического связывания, не мешая специфическому взаимодействию первичных антител с антигеном. Вместо сыворотки в некоторых случаях использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА). В этих же целях рабочие растворы антител готовили на 1% растворе БСА или нормальной сыворотки. Перед нанесением первичных антител избыток сыворотки удаляли, но срезы не промывали. 4. Разведение антител.
Для получения оптимального окрашивания и предотвращения неспецифического связывания с тканевыми структурами первичных антител использовали концентрации антител, выбранные при предварительном титровании. Рабочие оптимальные разведения, при которых достигалось сильное специфическое окрашивание при минимальном окрашивании фона, определяли для каждого антитела в серии пробных титрований. 5. Инкубация срезов с антителами.
Для предотвращения испарения антител экспозицию проводили в атмосфере влажной камеры. Инкубация с первичными антителами проводилась при температуре 4С в течение 18 часов. 6. Промывания.
Для предотвращения образования комплексов антиген-антитело, которые могли бы оседать на срезе и усиливать фоновое окрашивание, перед инкубацией в новом иммунном слое удаляли все следы несвязавшихся антител. Это достигалось тщательными промываниями срезов между инкубациями в буферных растворах с помощью лабораторного миксера (вортекс). 7. Визуализация результатов реакции с помощью хромогена.
Комплекс антиген-антитело выявлялся гистохимической реакцией,
включающей хромоген, которым в исследовании служил 3,3-диаминобензи- динтетрахлорида (ДАБ). Во время инкубации срезов с комплексом стрептави- дин/биотин/пероксидаза хрена (бАВС) молекулы пероксидазы связывались с комплексом антиген-антитело посредством биотинилированных вторичных антител. Затем срезы инкубировали в свежеприготовленном растворе ДАБ и перекиси водорода в буфере. При этом молекулы пероксидазы катализировали разложение перекиси водорода до воды и кислорода. Кислород окислял ДАБ, который осаждался в местах локализации антигена в виде гранул коричневого цвета. 8. Контрольные реакции.
Каждое иммуногистохимическое исследование проводилось с постановкой положительного и отрицательного контролей, чтобы исключить вероятность получения ложнонегативных и ложнопозитивных результатов.
Отрицательный контроль исключал неспецифическое окрашивание. При этом на контрольный (параллельный) срез наносилась либо неиммунная сыворотка, полученная от того же донора, что и первичные антитела, либо буфер (без первичного антитела).
Положительный контроль подтверждал специфичность поставленной иммуногистохимической реакции с данным антителом. Чаще всего в качестве положительного контроля использовались структуры самой исследуемой ткани («внутренний» контроль), которые содержли исследуемый антиген, при этом была исключена вариабельность обработки, фиксации и окрашивания ткани. Если в ткани биоптата исследуемый антиген мог отсутствовать, то использовали «внешний» контроль —- срез ткани, в котором интересующий антиген заведомо присутствовал. Содержание антигена в контрольной ткани было низким или средним, чтобы можно было оценивать чувствительность метода. Контрольный срез обрабатывался точно так же, как и изучаемый, одновременно с ним.
Анализ частоты встречаемости различных вариантов неходжкинских лимфом
Сопоставление результатов обнаруживает значительные отличия в частоте обнаружения некоторых морфологических вариантов неходжкинских лимфом в Северо-Западном регионе России. В-клеточные лимфомы составили 79,6%, а Т-клеточные — 20,4% в выборке из 377 неходжкинских лимфом. В- клеточная лимфоцитарная лимфома обнаруживалась, по данным ЛОПАБ, в 17% случаев — чаще, чем во всех других регионах. Это отличие не может быть результатом особенностей врачебной практики при обследовании пациентов, поскольку в гематологических стационарах региона диагноз хронического лим- фолейкоза, установленный при исследовании пунктата костного мозга, не сопровождается, как правило, биопсией увеличенного лимфатического узла. Такой же подход к обследованию больных В-клеточным лимфоцитарным лейкозом в Ванкувере стал объяснением низкой частоты обнаружения В- лимфоцитарной лимфомы в выборке (1%) [72].
Другой заметной особенностью обследованной группы пациентов — жителей Северо-Запада России — оказалась низкая частота обнаружения фолликулярных лимфом. Доля в 11% больше соответствует «азиатскому» типу распределения (Гонконг — 8%, Тайвань — 6%, Япония — 9%, Индия — 12,6% [781], Малайзия — 10% [848]), чем «европейско-американскому» (Омаха — 32%, Ванкувер — 31%, Лондон — 28%, Southampton, UK — 19% [1032], Вюрц- бург/Геттинген — 18%, Локарно/Беллинзона — 11%, р 0,00001). Доля диффузных В-клеточных крупноклеточных лимфом в странах Восточной Азии, как полагают, высока за счет меньшей частоты обнаружения фолликулярных лимфом. В Северо-Западном регионе России, где фолликулярных лимфом также немного, диффузных В-клеточных крупноклеточных лимфом оказалось не больше, чем в регионах, где фолликулярные лимфомы встречаются чаще других. Незанятая «ниша» в В-клеточных лимфомах оказалась заполненной лимфоцитарной лимфомой, но не Т-клеточными лимфомами.
Довольно редкой опухолью в выборке ЛОПАБ оказалась экстранодаль- ная лимфома маргинальной зоны (2,1%), во всех других выборках, за исключением Лондона и Кейптауна, этот вариант лимфомы встречался значительно чаще.
Существует устойчивое мнение о том, что лимфомы с иммунофеноти- пом зрелых Т- и ЫК-клеток чаще встречаются в Азии [532]. Но, если учесть, что заболеваемость (количество новых случаев на 100 ООО населения в год) не- ходжкинскими лимфомами на «Западе» в 3-4 раза выше, чем на «Востоке», то обнаруживается, что заболеваемость Т-клеточными лимфомами в различных географических зонах не имеет выраженных отличий, а существенно отличается заболеваемость В-клеточными опухолями — неходжкинскими лимфомами в Северной Америке и Европе больше за счет В-клеточных. Причины таких различий остаются неизвестными [699].
Относительная частота выявления лимфом с иммунофенотипом периферических Т-лимфоцитов, неуточненных в разных странах лежит в пределах от 1,5 до 18,3% [934]. В выборке ЛОПАБ она составила 6,4%; это меньше, чем на Тайване и в Японии (р=0,1812), и заметно больше, чем в Северной Америке (Омаха — 3%, Ванкувер — 1%, р 0,005). Различие с континентальной Европой незначительно (Вюрцбург/Геттинген — 4%, Лион — 4%, Локарно/Беллин- зона — 6%, р=0,18). Т/О-клеточных анапластических крупноклеточных лимфом было выявлено по частоте больше чем во всех остальных сравниваемых регионах (4,2%, р 0,02). Большая относительная частота анапластических крупноклеточных лимфом (4,3%) была отмечена в Индии [781].
Пятнадцать клинико-анатомических форм Т/МС-клеточных опухолей, представленных в классификации ВОЗ, условно разделены на первично диссе- минированные (лейкемические), кожные, прочие экстранодальные, преимущественно нодальные лимфомы и опухоли неясного гистогенеза [535]. Данные эпидемиологических исследований демонстрируют значительные колебания в частоте выявления Т/ЫК-клеточных лимфом в разных географических зонах, которые тесно связаны с этническим составом населения, а также с наличием очагов эндемических заболеваний. Если в странах Западной Европы и США средняя частота выявления всех вариантов ТЖК-клеточных лимфом колеблется от 1,5 до 8% [72, 260, 934], то в Азии она значительно выше и достигает 10-33,1% [72, 216, 254, 1132]. Многими авторами это расценивается не как свидетельство абсолютного роста числа Т/ЫК-клеточных лимфом, а как относительное увеличение вследствие низкой частоты выявления фолликулярных лимфом в этих регионах [72, 216, 984]. Данный факт, однако, не противоречит доказанному повышению частоты выявления отдельных форм Т/ЫК-клеточных лимфом в определенных регионах. Так, в Японии, странах Карибского бассейна и Центральной Африке, зонах эндемического распространения НТЪУ-1, отмечается высокая частота выявления Т-клеточной лимфомы/лейкоза взрослых, вызванной этим онкоретровирусом [702, 760]. В отдельных изолированных эндемических областях на этот редкий тип лимфомы приходится до 52% среди всех прочих лимфом [1132], в то время как в других регионах частота выявления
Результаты иммуногистохимического анализа диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом
В-клеточная природа 8 из 8 тестированных лимфом была подтверждена моноклональным характером экспрессии легких цепей иммуноглобулинов, дополнившей позитивную экспрессию основных диагностических пан-В- клеточных антигенов С020 и СБ79а. Цитоплазматическая локализация окрашенного продукта реакции легче выявлялась в клетках с обильной цитоплазмой, например, иммунобластах, мембранное окрашивание было более сложным для интерпретации, поэтому данный тест использовался лишь как дополнительный.
СБ23, рецептор иммуноглобулина Е низкой аффинности, экспрессируется преимущественно в Б-позитивных В-лимфоцитах и фолликулярных дендритических клетках. М. Са1апптс1 и соавт. обнаружили этот антиген в 15% нодальных крупноклеточных лимфом и в 9% — при экстранодальной локализации [170]. Биологическое значение появления данного антигена в крупноклеточных лимфомах неясно. I. ЫпдегоЛ и соавт. в своей работе использовали экспрессию С023 как доказательство того, что нормальная клетка-предшественник этого варианта лимфомы относится к прегерминогенной/ранней герми- ногенной стадии дифференцировки В-лимфоцитов. Данные этой работы свидетельствуют, что положительная экспрессия С023 является благоприятным прогностическим признаком [670]. С другой стороны, экспрессия С023 индуцируется в клеточных линиях В-лимфоцитов, трансформированных вирусом
Эпштейна-Барр, и отражает активированное состояние этих клеток. Среди изученных наблюдений CD23 был выявлен в 6 из 39 тестированных биопсий (15,4%), что совпадает с литературными данными. Мембранное окрашивание определялось в 20-60% клеток в 5 наблюдениях и в 1 — в более 61% опухолевых клеток. С023-позитивные случаи описанной серии диффузных крупноклеточных лимфом не имели коэкспрессии CD5, т. е. они не могут быть отнесены к крупноклеточной трансформации хронического лимфолейкоза (синдром Рихтера). Отсутствие CD5, маркера Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов [314] противоречит происхождению этих лимфом из клеток прегерминогенной стадии дифференцировки. Морфологически опухолевые клетки имели морфологию центробластов, а иммунологически не имели никаких признаков активированного фенотипа. Скорее всего, группа С023-позитивных крупноклеточных лимфом гетерогенна и может включать в себя не только гистогенетические варианты, описанные в литературе, но и другие.
Большинство Т-клеточных антигенов (CD2, CD3, CD7, CD4, CD8, CD56) и белков цитотоксических гранул (TIA-1, гранзим В), тестированных в диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфомах, не окрашивали опухолевые клетки (рис. 4.4в и 4.11г). Исключение составляли CD5, CD45RO и CD57 (см. таблицу 4.5).
Было выявлено 4 С05-позитивные лимфомы, что составило 8,3% от числа тестированных к этому антигену опухолей. Опухолевые клетки, количество которых варьировало между 21 и 60% в разных случаях (2+), имели морфологию типичных центробластов, их иммунофенотип был: CD20+, CD79a+, CD5+, CD23-, CD30-, то есть не имел других аберрантных черт. CD5 - это антиген, который экспрессируется преимущественно в Т-клетках, начиная с ранних стадий внутритимического развития, и в В1 субпопуляции В-лимфоцитов [594].
По данным литературы, около 5-10% диффузных крупноклеточных лимфом имеют экспрессию CD5, среди них встречаются случаи синдрома Рихтера, но большинство относятся к опухолям, развивающимся de novo [619, 719]. Клинически такие опухоли отличаются большей агрессивностью и более низкой выживаемостью больных по сравнению с прочими вариантами диффузных крупноклеточных лимфом, хотя отрицательное прогностическое значение признается не всеми исследователями [865]. По данным литературы, среди CD5- позитивных лимфом преобладают типичные центробластные лимфомы, особенностью строения которых является интрасинусоидная или интраваскулярная локализация части опухолевых клеток [1138], имеются также описания CD5- позитивных случаев среди лимфом, богатых Т-лимфоцитами [213]. Иммунофе- нотип таких лимфом: CD3-, CD5+, CD10-, CDllb-, CD21-, CD23-, CD30-, цик- лин D1- [719, 1138]. Анализ перестройки генов иммуноглобулинов продемонстрировал гистогенетическую близость опухолевых клеток и В1 субпопуляции лимфоцитов [764, 1045]. Выявленные в данной работе С05-позитивные лимфомы не имели существенных клинических особенностей, их морфологические и иммуногистохимические характеристики, в основном, совпадали с описанными в литературе, за исключением отсутствия интраваскулярного типа роста.
Другим Т-клеточным маркером, экспрессия которого была зафиксирована в опухолевых В-клетках, был антиген CD45RO — ассоциированная с Т- лимфоцитами низкомолекулярная изоформа общелейкоцитарного антигена (LCA/CD45). Антитело UCHL1, имеющее специфичность к данному антиге , реагирует не только с разными субпопуляциями Т-лимфоцитов, но и с гра11уло- цитами и моноцитами, то есть имеет линейно не рестриктированный тип экспрессии. Среди тестированных к CD45RO случаев позитивными оказались 11 из ИЗ (9,7%) наблюдений, большая часть которых относилась к лимфомам с центробластной/иммунобластной морфологией (10 наблюдений). Во всех CD45RO-no3iiTHBHbix случаях, включая один относящийся к лимфомам с обилием Т-лимфоцитов, окрашивание было отчетливо связано с опухолевыми клетками, а не с реактивным Т-клеточным компонентом. Экспрессия CD45RO описана в клеточных культурах, выделенных из диффузных крупноклеточных лимфом, после воздействия на клетки интерлейкином 4 [894] и в крупноклеточных лимфомах, развивающихся у больных СПИДом [291]. Причина данного феномена не ясна, но может быть связана с активированным состоянием опухолевых клеток.
