Введение к работе
з
Актуальность темы. В современных условиях при непрерывном повышении загрязнения окружающей среды вопросы гигаены сырого молока и контроля его качества становятся приоритетными. Поэтому к высококачествеююму молоку может быть отнесено лишь то молоко, которое соответствует предъявляемым к нему требованиям не только по пищевой ценности и органолептическим показателям, но прежде всего по безопасности потребления.
Среди микроорганизмов — возбудителей пищевых отравлений ведущее место по частоте выделения занимает золотистый стафилококк. Стафилококковые отравления при употреблении разнообразных пищевых продуктов, например, молочных, мясных, кондитерских, кулинарных изделий, являются результатом нарушения технологических режимов получения сырья, его переработки и реализации готовой продукции (Карташова В.М.Д980; Демидова Л.Д.,1995; Komine К., 2000).
Особенностью интоксикаций стафилококковой природы является то, что они возникают в результате воздействия на организм энтеротоксинов, а не живых микробных клеток. Другими словами, термическая обработка продуктов убивает стафилококк, но не разрушает его токсины, и отравление наступает даже после длительного проваривания и прожаривания пищи. Это обстоятельство затрудняет выявление причин вспышек микробиологическими методами, заставляя прибегать к методам обнаружения энтеротоксинов (Карташова В.М.,1980; Флуер Ф.С.,1991; Burdova 0..1994; Korpysa W., 2002).
Большое негативное влияние на развитие молочного животноводства и повышение его продуктивности оказывают заболевания животных, среди которых наибольшее значение имеет мастит коров, приводящий к недополучению большого количества молока и преждевременной выбраковке. Важную роль в этиологии мастита играют стафилококки. Наличие в молоке (молозиве) значительного количества токсигенных стафилококков приводит к тому, что новорожденные телята инфицируются и в тяжелой форме страдают энтеритами стафи-
лококковой этиологии, от чего часто погибают (Adesiyun А.Р., 1995; Garcia M.L., 1980; Kuroishi Т., 2002).
Для эффективной оценки роли стафилококков в возникновении пищевых отравлений самого факта выделения культуры стафилококков, даже коагулазопозитивных, недостаточно, тем более, что в пищевых продуктах, содержащих патогенные дозы энтеротоксина, жизнеспособные микробные клетки могут и не выявляться. Поэтому в процессе биологической диагностики стафилококковых пищевых отравлений необходимо преследовать двойную цель: найти энтеротоксигенные стафилококки и выявить энтеротоксин. Оба патогена надо исследовать на всех этапах эпидемической цепи и тогда определение стафилококков позволит конкретно выяснить источник и механизм развития токсикоза, а нахождение энтеротоксина в продукте и в материале от потерпевших -окончательно подтвердить диагноз пищевой стафилококковой интоксикации.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка иммуноферментной тест-системы для индикации стафилококкового энтеротоксина типа С в сыром молоке.
В задачи исследований входило:
1. Определить уровень контаминации молока и секрета вымени лактирую-щих коров с различным состоянием молочной железы золотистыми, в том числе энтеротоксигенными, стафилококками.
Определить типы энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, выделенных из молока и секрета вымени лактирующих коров и отобрать наиболее токсигенные штаммы для последующей иммунизации, выделить и очистить энтеротоксин типа С S.aureus.
Провести гипериммунизацию кроликов с целью получения антиэнтеро-токсических сывороток, выделить и очистить иммуноглобулины к энтероток-сину типа С золотистого стафилококка.
Создать иммуиоферментную тест-систему к энтеротоксину типа С золо-
тистого стафилококка, изучить ее чувствительность и специфичность.
5. Разработать методику индикации энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке и определить ее эффективность.
Научная новизна. Получены данные, характеризующие высокий
уровень контаминации молока и секрета вымени коров энтеротоксигенными золотистыми стафилококками в зависимости от функционального состояния молочной железы. Определен спектр типов энтеротоксинов у золотистого стафилококка и выявлен энтеротоксин типа С как наиболее часто встречающийся в сыром молоке и секрете вымени здоровых и больных маститом коров.
Подобрана оптимальная плотная среда и способ культивирования для накопления стафилококкового энтеротоксина типа С. Получен в виде гомогенного белка очищенный концентрат энтеротоксина типа С. Установлена наиболее эффективная схема иммунизации кроликов, которая позволила за короткий срок с меньшими затратами энтеротоксина и без гибели подопытных животных получить высокоактивные гипериммунные сыворотки к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка.
Получены очищенные иммуноглобулины, которые были использованы для разработки тест-системы на основе ИФА для определения энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке, отработаны основные параметры тест-системы, от которых зависят чувствительность и специфичность проводимой реакции.
Разработан доступный способ пробоподготовки для ИФА с целью снижения фонового влияния компонентов сырого молока на чувствительность тест-системы.
Практическая ценность работы.
На основании результатов исследований совместно с Шурдуба Н.А. и Сотниковой В.М. разработаны «Методические рекомендации по разработке иммуноферментной тест-системы для индикации и идентификации
энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, сыром молоке и молочных продуктах» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30 сентября 2009 г.)
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
16-м Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2008 г.);
VI и VII Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007,2008 гг.);
Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008 г.);
расширенном заседании лаборатории санитарии молока ВНИИВСГЭ (2009 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных статьей, в том числе одна в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 стр. компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 163 источника (42 отечественных и 121 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 10 таблицами и 15 рисунками.
