Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 20
1.1. Общие сведения о физиологии и метаболизме человеческих эритроцитов 20
1.1.1. Клеточный объем эритроцитов 22
1.1.2. Метаболизм эритроцитов
1.1.2.1. Энергетический метаболизм 29
1.1.2.2. Антиокислительный метаболизм 33
1.1.2.3. Метаболизм аденилатов 36
1.1.3. Связь между метаболизмом и
жизнеспособностью эритроцитов 40
1.2. Методы введения препаратов в эритроциты 42
1.2.1. Осмотические методы 42
1.2.1.1. Обратимый осмотический лизис 42
1.2.1.2. Ступенчатый лизис 43
1.2.1.3 Осмотический импульс 44
1.2.1.4. Гипотонический диализ 44
1.2.1.5. Ступенчатый диализ 48
1.2.1.6. Проточный диализ 48
1.2.2. Неосмотические методы 49
1.2.2.1. Электрический пробой клеточной мембраны 49
1.2.2.2. Лазерный удар 50
1.2.2.3. Химическая модификация клеточной мембраны 50
1.2.2.4. Использование проникающих пептидов 51
1.2.2.5. Присоединение препаратов к поверхности эритроцитов 52
1.2.2.6. Равновесное связывание с эритроцитами 53
1.3. Использование эритроцитов в качестве переносчиков биологически активных препаратов 54
1.3.1. Коррекция ферментопатий 55
1.3.2. Эритроцит как биореактор 58
1.3.3. Коррекция тромболитической активности 59
1.3.4. Использование эритроцитов в целях иммунизации 60
1.3.5. Выведение избытка железа из организма 60
1.3.6. Коррекция кислород-транспортной функции 61
1.3.7. Транспорт противоопухолевых препаратов 62
1.4. Использование эритроцитов в качестве переносчиков L-аспарагиназы 64
1.4.1. Общие сведения о препарате L-аспарагиназа 64
1.4.2. Аспарагиназа в эритроцитах 65
1.5. Использование эритроцитов в качестве переносчиков антрациклиновых антибиотиков 72
1.5.1. Общие сведения об антрациклиновых антибиотиках 72
1.5.2. Макромолекулярные и корпускулярные переносчики антрациклиновых антибиотиков 75
1.5.3. Введение антрациклиновых антибиотиков
в эритроциты 78
1.5.4. Повреждающее воздействие антрациклиновых антибиотиков на эритроциты 81
1.5.5. Противоопухолевая активность эритроцитов, нагруженных антрациклиновыми антибиоотиками 83
1.5.6. Использование нагруженных антрациклиновыми антибиотиками эритроцитов в ветеринарной
и медицинской практике 85
ГЛАВА 2. Регистрация атф в интактных эритроцитах человека с помощью введенной в клетки люциферазы 91
2.1. Введение 91
2.2. Материалы и методы 91
2.3. Результаты
2.3.1. Влияние люциферина на люминесценцию эритроцитов, нагруженных люциферазой 93
2.3.2. Распределение люциферина между инкубационной средой и эритроцитами 95
2.3.3. Кинетика люциферазной реакции в эритроцитах 98
2.3.4. Кинетика транспорта люциферина через мембрану эритроцитов 98
2.3.5. Зависимость люминесценции эритроцитов, нагруженных люциферазой, от температуры 102
2.3.6. Регистрация изменений концентрации АТФ
в эритроцитах с помощью введенной в них люциферазы 102
2.4. Обсуждение результатов 105
ГЛАВА 3. Эритроциты, нагруженные L-аспарагиназой 109
3.1. Введение 109
3.2. Транспорт аспарагина через мембрану человеческих эритроцитов и его разрушение введенной в эритроциты аспарагиназой
3.2.1. Введение 109
3.2.2. Материалы и методы 110
3.2.3. Результаты 113
3.2.4. Обсуждение результатов 117
3.3. Хранение эритроцитов, нагруженных аспарагиназой 119
3.3.1. Введение 119
3.3.2. Материалы и методы 119
3.3.3. Результаты 121
3.3.4. Обсуждение результатов 124
ГЛАВА 4. Лабораторные исследования эритроцитов в качестве переносчиков антрациклиновых антибиотиков 126
4.1. Связывание антрациклиновых антибиотиков
с эритроцитами in vitro 126
4.1.1. Введение 126
4.1.2. Материалы и методы 127
4.1.3. Результаты
4.1.3.1. Связывание даунорубицина с эритроцитами 132
4.1.3.2. Связывание доксорубицина с эритроцитами 139
4.1.3.3. Связывание антрациклиновых антибиотиков с эритроцитами, обработанными глютаровым альдегидом 142
4.1.4. Обсуждение результатов 147
4.2. Повреждение эритроцитов антрациклиновыми антибиотиками in vitro 149
4.2.1. Введение 149
4.2.2. Материалы и методы 150
4.2.3. Описание устройства для измерения деформируемости эритроцитов 151
4.2.4. Результаты
4.2.4.1. Влияние даунорубицина и доксорубицина на выход гемоглобина из эритроцитов 157
4.2.4.2. Влияние даунорубицина и доксорубицина на выход калия из эритроцитов 158
4.2.4.3. Влияние даунорубицина на объем эритроцитов 158
4.2.4.4. Влияние даунорубицина и доксорубицина на деформируемость эритроцитов 159
4.2.4.5. Влияние даунорубицина и доксорубицина на концентрацию АТФ в эритроцитах 166
4.2.5. Обсуждение результатов 166
4.3. Противоопухолевая активность и токсичность эритроцитарной формы даунорубицина на мышиных моделях 169
4.3.1. Введение 169
4.3.2. Материалы и методы 171
4.3.3. Результаты 174
4.3.3.1. Противоопухолевая активность и токсичность нагруженных даунорубицином эритроцитов на мышах с асцитной опухолью Р388 174
4.3.3.2. Противоопухолевая активность и токсичность нагруженных даунорубицином эритроцитов на мышах с эритробластным лейкозом, индуцированным вирусом Раушера 174
4.3.4. Обсуждение результатов 180
ГЛАВА 5. Клинические исследования эритроцитов, нагруженных антрациклиновыми антибиотиками 182
5.1 Фармакокинетика и переносимость эритроцитарной формы даунорубицина у больных острыми лейкозами 182
5.1.1. Введение 182
5.1.2. Материалы и методы 183
5.1.3. Результаты 1 5.1.3.1. Связывание даунорубицина с эритроцитами больных острыми лейкозами 190
5.1.3.2. Влияние даунорубицина на деформируемость эритроцитов больных 193
5.1.3.3. Фармакокинетика даунорубицина в крови и плазме больных при введении стандартной и эритроцитарной форм антибиотика 193
5.1.3.4. Переносимость эритроцитарной формы даунорубицина у больных острыми лейкозами 205
5.1.4. Обсуждение результатов 209
5.2. Фармакокинетика и переносимость эритроцитарных форм доксорубицина у больных лимфопролиферативными заболеваниями 212
5.2.1. Введение 212
5.2.2. Материалы и методы 215
5.2.3. Результаты 222
5.2.3.1. Связывание доксорубицина с эритроцитами в крови больных 222
5.2.3.2. Фармакокинетика доксорубицина в крови и плазме больных при введении стандартной и эритроцитарной форм антибиотика 223
5.2.3.3. Переносимость эритроцитарной формы доксорубицина у больных лимфопролиферативными
заболеваниями 225
5.2.4. Обсуждение результатов 235
Заключение. Перспективы использования эритроцитов в качестве переносчиков биологически активных препаратов 237
Выводы 242
Список литературы
- Энергетический метаболизм
- Кинетика транспорта люциферина через мембрану эритроцитов
- Хранение эритроцитов, нагруженных аспарагиназой
- Описание устройства для измерения деформируемости эритроцитов
Энергетический метаболизм
Объем нормального человеческого эритроцита находится в пределах 80-9610-15 л [95]. Клеточный объем эритроцита является одним из ключевых факторов, определяющих функциональную полноценность и жизнеспособность этой клетки. Эритроцит окружен эластичной, но практически нерастяжимой мембраной и поддерживает дисковидную форму, необходимую для эффективного газообмена между клеткой и средой и для нормальной циркуляции в организме, за счет стабилизации (регуляции) клеточного объема. Проницаемость клеточной мембраны эритроцитов человека для белков, большинства внутриклеточных метаболитов и катионов металлов, таких как Na+, и K+, значительно меньше, чем для воды [95, 107]. Это позволяет эритроцитам поддерживать свой объем за счет осмотического баланса между клеткой и средой. Концентрация белков и метаболитов в эритроцитах выше, чем в плазме крови. Эта разница компенсируется неравновесным распределением ионов Na+ и К+ между клеткой и плазмой. В упрощенном виде это можно объяснить так. Концентрации ионов Na+ и K+ в плазме составляют 140 и 5 мМ, а в эритроцитах 10 и 100 мМ соответственно. Таким образом, суммарная концентрация ионов Na и K в плазме (145 мМ) оказывается выше, чем в эритроцитах (110 мМ). При суммарной концентрации белка (в основном гемоглобина) и метаболитов в эритроцитах равной 35 мМ суммарные концентрации растворенных веществ в клетках и среде оказываются одинаковыми (145 мМ), что обеспечивает осмотический баланс между клетками и средой [108-112].
В соответствие с осмотическим равновесием, увеличение концентрации непроникающих через мембрану веществ (например, ионов Na+ или K+) во внешней среде приводит к снижению объема эритроцитов и сжатию клеток вследствие выхода из них воды. Это приводит к увеличению внутриклеточной вязкости, что в свою очередь ухудшает деформируемость эритроцитов и их способность к циркуляции [100]. Уменьшение концентрации непроникающих веществ в среде (за счет ее разбавления водой) приводит к поступлению воды в клетки и к их набуханию, что также затрудняет циркуляцию эритроцитов по тканевым капиллярам. Вследствие нерастяжимости эритроцитарной мембраны максимальное увеличение объема эритроцита ограничено и составляет около 1,6 от нормального объема при достижении клеткой сферической формы [113, 114]. Дальнейшее уменьшение тоничности среды приводит к разрыву клеточной мембраны, то есть к так называемому осмотическому лизису эритроцитов (гемолизу). По-видимому, нормальные эритроциты человека лишены каких-либо механизмов, обеспечивающих стабилизацию клеточного объема при изменениях осмотичности среды. Это скорее всего говорит о том, что в организме осмотичность внешней среды (плазмы крови) практически постоянна.
Изменение объема эритроцита может происходить также при нарушении осмотического баланса связанного с изменениями распределения ионов Na+ и K+ между клеткой и средой вследствие повреждения клеточной мембраны, нарушения работы транспортной Na,K-АТФазы и т.п. Такая причина изменения объема эритроцита представляется физиологически более реальной, чем изменение тоничности плазмы в организме. Транспортная Na,K-АТФаза ингибируется различными природными препаратами, в том числе сердечными гликозидами строфантином G и строфантином К [115-118]. Окисление компонентов мембраны эритроцита приводит к образованию пор, через которые могут проходить анионы, катионы металлов и даже белки [119-121]. Значительное (в несколько раз) увеличение проницаемости мембраны эритроцитов и нарушение в них ионного баланса наблюдается при некоторых патологиях [122-130]. Увеличение проницаемости клеточной мембраны для катионов вызывают некоторые антибиотики, и другие мембранотропные вещества [111, 116, 117, 131, 132].
В норме отношение площади поверхности к объему поддерживается в эритроцитах с очень высокой точностью [113, 114, 133-135], что указывает на наличие эффективных механизмов стабилизации объема в этих клетках. До настоящего времени не удалось выделить какие-либо компоненты, которые могли бы функционировать как детекторы (сенсоры) непосредственно клеточного объема. В то же время, многие транспортные системы весьма чувствительны к изменениям концентраций ионов внутри и снаружи клетки и могут отслеживать изменения клеточного объема через изменения этих концентраций.
Основным компонентом системы стабилизации объема в эритроцитах человека является, по-видимому, транспортная Na,K-АТФаза (Рис. 1.2). В стационарном состоянии на каждую потребленную молекулу АТФ этот трансмембранный фермент переносит три иона Na+ из клетки в среду и два иона K+ из среды в клетку, компенсируя тем самым пассивные трансмембранные потоки этих ионов. Транспортная Na,K-АТФаза активируется ионами Na+ внутри клетки и ионами K+ снаружи. При повреждении клеточной мембраны ее проницаемость возрастает, что приводит к увеличению пассивных потоков ионов в соответствии с градиентами концентрации (Na из среды в клетку и K из клетки в среду). В результате, концентрация Na в клетках и концентрация K в среде возрастают, что приводит к активации транспортной Na,K-АТФазы и, в конечном итоге, к компенсации возросших пассивных трансмембранных потоков ионов. В принципе, осмотическую стабилизацию объема клетки можно обеспечить с помощью только одного иона (скажем Na+) с небольшой разницей концентраций между клеткой и средой. Однако такая стабилизация будет практически нечувствительна к повреждениям клеточной мембраны. Действительно, даже очень сильное увеличение проницаемости мембраны в этом случае не сможет привести к значительному увеличению концентрации Na в клетке (просто потому, что разница между внутриклеточной и внеклеточной концентрацией иона в этом случае должна быть мала) и, следовательно, к адекватной активации ионного насоса, поддерживающего градиент Na. В результате, даже при небольшом повреждении клеточной мембраны объем клетки может сильно увеличиться, что приведет к ее разрушению. Наличие двух встречных градиентов ионов (Na+ и K+) с большой разницей между внутриклеточными и экстраклеточными концентрациями для каждого иона и небольшой разницей для суммы концентраций ионов в среде и в клетке придает клетке высокую чувствительность к повреждению мембраны. В этом случае увеличение проницаемости мембраны будет приводить к сильному увеличению концентрации Na в клетке, поскольку исходно эта концентрация маленькая, и к адекватной активации Na,K-АТФазы. Предположим, что внутриклеточная концентрация Na равна 10 мМ, а суммарная концентрация ионов в клетке равна 110 мМ. При двукратном увеличении проницаемости мембраны поток Na в клетку также увеличится вдвое и концентрация Na в клетке начнет возрастать, приводя к активации Na,K-АТФазы. При линейной зависимости скорости Na,K-АТФазы от концентрации Na, двукратное увеличение концентрации Na (с 10 до 20 мМ) приведет к двукратному увеличению скорости Na,K-АТФазы и, соответственно к компенсации возросшего потока Na в клетку. В результате в клетке установится новое стационарное состояние с двукратно увеличенным пассивным потоком Na в клетку, с эквивалентной, также двукратно увеличенной по сравнению с нормой скоростью удаления Na из клетки Na,K-АТФазой, и с двукратно увеличенной концентрацией Na.
Кинетика транспорта люциферина через мембрану эритроцитов
Аналогично нашим результатам, накопление аспарагиновой кислоты наблюдалось в эритроцитах грызунов, нагруженных аспарагиназой, после добавления к ним аспарагина [293]. При этом аспарагиновая кислота также не обнаруживалась в инкубационной среде. В этой же работе было показано, что нагруженные аспарагиназой эритроциты мышей и крыс имеют нормальное время жизни в кровотоке. Уровень аспарагиназы в эритроцитах мышей составлял около 80% от исходного через 7 дней после введения животным и около 40% через 14 дней. При внутривенном введении мышам 50 МЕ аспарагиназы в эритроцитах, аспарагин не обнаруживался в плазме крови до 14 дней. При введении такой же дозы аспарагиназы в виде раствора, уровень аспарагина в плазме снижался всего на 2-3 дня. Также, на мышиной модели была продемонстрирована высокая противоопухолевая активность эритроцитов, нагруженных аспарагиназой. При введении мышам клеток лимфомы 6C3HED животные погибали в среднем через 18 дней. После однократного введения животным 25 МЕ аспарагиназы в виде раствора продолжительность их жизни увеличивалась в среднем до 29 дней. После однократного введения такой же дозы аспарагиназы в эритроцитах большинство животных выживало дольше 60 дней, что рассматривается авторами как полное выздоровление.
Позже, аспарагиназа была успешно введена в эритроциты собак [294]. Использование диализного метода позволило ввести в эритроциты до 530 МЕ/мл аспарагиназы при эффективности введения около 30% и сохранении около 54% от исходного количества клеток. Нагруженные аспарагиназой эритроциты были стабильны in vitro в течение 18 ч как при 4оС, так и при 37оС. При введении нагруженных аспарагиназой эритроцитов животным время полужизни аспарагиназы в кровотоке составляло 6,5 дней. Интересно отметить, что у собак большее количество нагруженных аспарагиназой эритроцитов оказывалось в кровотоке при внутрибрюшинном введении, по сравнению с внутривенным введением [295].
Длительная циркуляция аспарагиназы в эритроцитах в организме мышей и более высокая эффективность снижения аспарагина в плазме крови при введении нагруженных аспарагиназой эритроцитов по сравнению с раствором аспарагиназы были подтверждены еще в одной работе [296]. Там же описано введение аспарагиназы в человеческие эритроциты методом проточного диализа, измерены гематологические параметры нагруженных аспарагиназой эритроцитов, проведена оптимизация условий заполнения человеческих эритроцитов аспарагиназой.
В последующей работе этой группы авторов нагруженные аспарагиназой гомологичные эритроциты были введены 5 пациентам c неходжкинской лимфосаркомой [297]. Эта работа по-видимому является первой публикацией, описывающей введение нагруженных аспарагиназой эритроцитов людям. Аспарагиназа вводилась в эритроциты методом проточного диализа. Доза аспарагиназы, введенная пациентам в эритроцитах варьировала в пределах 30 и 60 МЕ на килограмм веса тела. Было показана, высокая посттрансфузионная приживаемость эритроцитов носителей (78±3%) и нормальное время их полужизни в кровотоке (26±6 дней). Посттрансфузионноя сохранность аспарагиназы была несколько меньше (41-69%), а время полужизни в кровотоке находилось в пределах от 15 до 44 дней. Аспарагин в плазме крови оставался ниже предела регистрации в течение 5-28 дней.
В дальнейшем, число пациентов было увеличено до 30, а доза аспарагиназы была увеличена до 100, 150 и 200 МЕ на килограмм веса тела [68, 69, 298]. В этих работах 24-х часовая приживаемость эритроцитов носителей составляла в среднем 75±10% от исходного количества введенных эритроцитов, а активность аспарагиназы 47±14% от введенной дозы. Далее, число эритроцитов, нагруженных аспарагиназой, и активность аспарагиназы в крови снижались экспоненциально практически с одинаковой скоростью. Среднее время полужизни составляло 28±6 и 29±10 дней, соответственно, для эритроцитов и аспарагиназной активности. Время, за которое аспарагин удалялся из плазмы крови, зависело от активности аспарагиназы в крови через 24 часа после введения. Максимальная продолжительность удаления аспарагина из плазмы около 50 дней достигалась при 24-часовой активности аспарагиназы в крови в пределах 1,25-2.0 МЕ/мл. Авторы отмечают, что препарат эритроцитов, нагруженных аспарагиназой, хорошо переносился пациентами [68]. Не было зарегистрировано признаков серьезной токсичности. Особенно отмечается то, что введение нагруженных аспарагиназой эритроцитов не вызывало у пациентов неблагоприятных иммунных реакций.
Была продемонстрирована возможность введения аспарагиназы в эритроциты барана и мыши с помощью проникающего пептида – низкомолекулярного протамина [231]. Эффективность включения аспарагиназы в эритроциты была довольно низкой и составляла около 4%. Нагруженные аспарагиназой эритроциты практически не отличались от интактных по морфологии и гематологическим параметрам. Нагруженные аспарагиназой с помощью низкомолекулярного протамина мышиные эритроциты обеспечивали более длительное присутствие аспарагиназы в крови после введения животным (время полужизни активности 4,5±0,5 дня) по сравнению с эритроцитами, нагруженными аспарагиназой путем обратимого осмотического лизиса (время полужизни активности 2,4±0,7 дня). Продемонстрирована противоопухолевая активность эритроцитов, нагруженных аспарагиназой с помощью низкомолекулярного протамина. Однократное введение аспарагиназы в эритроцитах в дозе 8 МЕ на мышь увеличивало время жизни животных с имплантированной лимфомой L5178Y на 44%.
Хранение эритроцитов, нагруженных аспарагиназой
Кинетика связывания даунорубицина c эритроцитами практически не зависит от его начальной концентрации в среде при концентрациях, меньших, чем 1 мг/мл. При больших начальных концентрациях даунорубицина связывание его замедляется с ростом концентрации (Рис. 4.5А). В некоторых экспериментах увеличение начальной концентрации даунорубицина от 1 до 5 мг/мл приводило к уменьшению доли связавшегося за 1 час даунорубицина в 2 - 3 раза. При этом максимальное связывание антибиотика с эритроцитами практически не зависит от его концентрации и составляет около 80% при гематокрите около 30% (Рис. 4.4А, 4.5А). С увеличением концентрации даунорубицина от 1 до 5 мг/мл значительно возрастает скорость выхода гемоглобина из эритроцитов (Рис. 4.5В).
Максимальное количество связанного с эритроцитами даунорубицина существенно зависит от гематокрита суспензии. Как видно из рисунка 4.6А, увеличение гематокрита суспензии приводит к более полному связыванию даунорубицина за одно и то же время инкубации. С другой стороны, уменьшение гематокрита суспензии позволяет при той же начальной концентрации даунорубицина в среде получить значительно большие концентрации даунорубицина в эритроцитах (Рис 4.6В).
Связывание доксорубицина с эритроцитами. Аналогичные результаты были получены с доксорубицином. В ходе инкубации человеческих эритроцитов в изотонической среде, содержащей доксорубицин, его концентрация в среде снижается, в то время как общее содержание доксорубицина в суспензии остается неизменным, что говорит о связывании доксорубицина эритроцитами. Связывание доксорубицина эритроцитами существенно зависит от температуры и рН инкубационной среды (Рис. 4.7). Уменьшение температуры, так же как и уменьшение рН, приводит к снижению начальной скорости связывания доксорубицина с эритроцитами. Кроме того, уменьшение рН приводит к уменьшению максимального связывания доксорубицина с эритроцитами. Зависимость кинетики связывания доксорубицина с эритроцитами от температуры качественно не меняется при изменении рН от 6,5 до 7,0. Однако, как показали наши предварительные эксперименты, при рН 7,5 и температуре ниже 30оС доксорубицин может выпадать в осадок в связи с резким снижением его растворимости в воде. Это, в свою очередь, приводит к агрегации эритроцитов. По этой причине зависимость связывания доксорубицина от температуры при рН 7,5 не исследовалась.
Кинетика связывания доксорубицина с человеческими эритроцитами не зависит от его начальной концентрации в инкубационной среде в диапазоне концентраций от 0,07 до 0,4 мг/мл (Рис. 4.8А). При рН 7,0, 37оС и гематокрите суспензии 50% начальная скорость связывания доксорубицина с эритроцитами составляет около 15% в минуту. Максимальное связывание доксорубицина достигается примерно в течение часа и составляет 80-85% от начального содержания антибиотика в среде. Таким образом, максимальное количество доксорубицина, которое могут связать эритроциты, пропорционально его начальной концентрации в среде (Рис. 4.8В).
Естественно, кинетика связывания доксорубицина с эритроцитами зависит от соотношения объемов клеток и среды в суспензии. Как видно из рисунка 4.9, более полное связывание доксорубицина достигается при более высоком значении гематокрита. С другой стороны, при низких значениях гематокрита доксорубицин накапливается в эритроцитах быстрее и при той же начальной концентрации доксорубицина в среде могут быть достигнуты гораздо более высокие его концентрации в клетках.
Выход гемоглобина из эритроцитов в ходе инкубации с доксорубицином был незначителен и составлял за час 0,5-1,0% от общего содержания гемоглобина в суспензии.
Связывание антрациклиновых антибиотиков с эритроцитами, обработанными глютаровым альдегидом. Эритроциты обработанные глютаровым альдегидом сохраняют способность связывать антрациклиновые антибиотики. Более того, эритроциты обработанные глютаровым альдегидом связывают антрациклиновые антибиотики значительно быстрее, чем интактные эритроциты. В таблице 4.1 сравнивается поглощение даунорубицина из инкубационной среды интактными и обработанными глютаровым альдегидом человеческими эритроцитами. В таблице суммированы результаты полученные на эритроцитах пяти различных доноров. Как видно из таблицы 4.1, интактные эритроциты связывают около 70% добавленного в среду даунорубицина в течение 30 мин, что хорошо согласуется с представленными выше данными, в то время как обработанные глютаровым альдегидом эритроциты связывают около 85% добавленного в среду антибиотика всего за 5 мин. В отличие от интактных эритроцитов, эритроциты обработанные глютаровым альдегидом связывают даунорубицин независимо от его начальной концентрации и даже при низких температурах.
Похожие результаты были получены при взаимодействии обработанных глютаровым альдегидом эритроцитов с доксорубицином. В таблице 4.2 представлены репрезентативные результаты одного из двух экспериментов, показывающие, что обработанные глютаровым альдегидом эритроциты связывают доксорубицин быстрее, чем интактные. Однако, эта разница заметно меньше, чем в случае даунорубицина.
Так же как и в случае интактных эритроцитов, связывание антрациклиновых антибиотиков с обработанными глютаровым альдегидом эритроцитами является обратимым. Замена инкубационной среды на свежую, не содержащую антибиотиков среду приводит к частичному выходу антибиотиков из клеток в среду. Выход антибиотиков завершается в течение 5 мин и далее, в течение часа концентрация антибиотиков в среде практически не меняется. Результаты двух независимых экспериментов, демонстрирующих выход даунорубицина из эритроцитов, обработанных глютаровым альдегидом и затем нагруженных даунорубицином представлены в таблице 4.3. Как видно из таблицы, после нескольких последовательных замен инкубационной среды значительное количество даунорубицина продолжает накапливаться в среде благодаря выходу антибиотика из эритроцитов.
Описание устройства для измерения деформируемости эритроцитов
Важно отметить, что обработка эритроцитов даунорубицином в ходе приготовления его эритроцитарной формы не влияет на такой важный реологический параметр эритроцитов, как их деформируемость.
При введении пациентам эритроцитарной формы даунорубицина пиковые концентрации антибиотика в крови и плазме уменьшаются, а время его выведения из кровотока увеличивается по сравнению со стандартной формой. При этом площадь под фармакокинетической кривой значительно возрастает. В литературе отмечается, что снижение пиковых концентраций антрациклиновых антибиотиков приводит к уменьшению их токсичности, а увеличение площади под фармакокинетической кривой улучшает их противоопухолевую активность [363-365]. Именно такие изменения в фармакокинетике даунорубицина наблюдаются при введении его эритроцитарной формы. При этом действительно наблюдается значительно лучшая переносимость эритроцитарной формы даунорубицина по сравнению с раствором антибиотика. В связи с этим можно ожидать, что увеличение площади под фармакокинетической кривой при введении больным эритроцитарной формы даунорубицина, должно приводить к повышению его терапевтической эффективности. Надо отметить, что лучшая переносимость ЭФДО открывает возможности для повышения дозы антибиотика, что также должно повысит его терапевтическую эффективность.
Интересно отметить, что хотя в экспериментах in vitro основная доля даунорубицина, добавленного в суспензию эритроцитов или в кровь связывается с эритроцитами, в ходе циркуляции в кровотоке in vivo даунорубицин распределяется между эритроцитами и плазмой более-менее равномерно. В результате, все фармакокинетические параметры оказываются практически одинаковыми для крови и плазмы.
Простота приготовления эритроцитарной формы даунорубицина в клинических условиях, фармакокинетические характеристики, позволяюшие надеяться на увеличение противоопухолевой активности, а также лучшая переносимость пациентами эритроцитарной формы по сравнению с раствором антибиотика, указывают на перспективность дальнейших клинических испытаний эритроцитов, нагруженных даунорубицином. Антрациклиновый антибиотик доксорубицин входит в число наиболее эффективных современных противоопухолевых препаратов [85]. Он проявляет противоопухолевую активность в отношении большего числа злокачественных новообразований, чем описанный выше даунорубицин, и широко используется в современной клинической практике при лечении солидных опухолей, таких как рак груди, легких и яичников, сарком мягких тканей и агрессивных лимфом [84, 85]. В то же время, подобно другим противоопухолевым препаратам, доксорубицин обладает высокой токсичностью, что ограничивает его применение в клинике. Специфическим токсическим эффектом, характерным для доксорубицина и других антрациклиновых антибиотиков, является высокая кардиотоксичность [84, 86, 304]. Среди неспецифических токсических эффектов антрациклиновых антибиотиков можно отметить тошноту, рвоту, головную боль, повреждение слизистых оболочек (стоматит), подавление кроветворения (миелосуппрессия) и другие эффекты, характерные для цитостатических препаратов [301, 302]. Снижение токсичности антрациклиновых антибиотиков при сохранении их противоопухолевой активности является актуальной задачей современной медицины и фармакологии. Одним из путей решения этой задачи является использование переносчиков для транспорта антрациклиновых антибиотиков в организме. Литературные данные и результаты наших исследований, изложенные в предыдущих разделах, показывают, что эритроциты являются перспективными переносчиками для доксорубицина.
В экспериментах in vitro была продемонстрирована возможность направленной доставки доксорубицина в клетки-мишени с помощью эритроцитов, покрытых специфичными антителами [335].
При внутривенном введении мышам эритроцитов, нагруженных доксорубицином и обработанных глютаровым альдегидом, основная доля находящегося в них антибиотика оказывалась в печени, а также в легких [48, 333]. Поскольку печень и легкие подвержены метастазированию при онкологических заболеваниях, преимущественная доставка противоопухолевых препаратов в эти органы имеет важное практическое значение. Действительно, эффективность нагруженных доксорубицином и обработанных глютаровым альдегидом эритроцитов в подавлении метастазов в печени и в легких у мышей оказалась более чем в десять раз выше по сравнению с раствором антибиотикоа [94, 333, 334]. Надо отметить, однако, что токсичность таких эритроцитов тоже возрастала в 3,5-3,9 раза по сравнению с раствором антибиотика. Результирующий эффект при этом оказывался положительным, поскольку отношение токсичной дозы к эффективной дозе увеличивалось от значения 1,8 для раствора антибиотика до значения 4,2 для эритроцитарной формы.
В литературе описано три случая лечения лимфосаркомы у собак с использованием эритроцитов, нагруженных доксорубицином за счет связывания антибиотика клетками, с последующей его иммобилизацией путем обработки глютаровым альдегидом [91]. Фармакокинетические исследования показали, что введение таких эритроцитов собакам приводило к значительному снижению пиковой концентрации антибиотика в плазме и увеличению времени его циркуляции (по сравнению со свободным антибиотиком) [91, 337, 338]. Концентрация доксорубицина в плазме не опускалась ниже 10% от пикового значения в течение шести дней наблюдения. Во всех трех случаях наблюдалась высокая противоопухолевая активность нагруженных доксорубицином эритроцитов, минимальная острая токсичность и отсутствие признаков кардиотоксичности. Однако в дальнейшем у всех животных развилась тяжелая миелосупрессия, которая в конечном итоге привела к их гибели.
Эритроциты, нагруженные доксорубицином за счет связывания антибиотика клетками с последующей обработкой глютаровым альдегидом, были использованы также для лечения пациента с резистентным к химиотерапии рефрактерным колоректальным раком, имеющим метастазы в печени [92, 93]. Авторы отмечают, что объективного ответа на лечение не наблюдалось, однако повторные ультразвуковые обследования печени отметили стабилизацию состояния пациента. Через две недели после шестого введения эритроцитарной формы доксорубицина у пациента развилась панцитопения и через шесть дней он скончался от септического шока.
Причиной повышенной токсичности эритроцитов, нагруженных доксорубицином и развития летальной миелосупрессии в описанных случаях может быть модификация доксорубицина в процессе его иммобилизации в эритроцитах с помощью глютарового альдегида. Как уже отмечалось в обзоре литературы, даже небольшие изменения в химической структуре антрациклиновых антибиотиков существенно влияют на спектр их противоопухолевой активности, токсичность и т.п. Поэтому вполне вероятно, что модификация доксорубицина в процессе его взаимодействия с глютаровым альдегида могла существенно повлиять на его свойства, в том числе увеличить его токсичность. Таким образом, вопрос о безопасности и целесообразности использования в клинической практике эритроцитов с доксорубицином, иммобилизованным в них с помощью глютарового альдегида, нуждается в дальнейших лабораторных исследованиях.
