Введение к работе
Актуальность проблемы. За последние 40 лет синтетические фрагменты нуклеиновых кислот зарекомендовали себя как универсальные инструменты для исследований в области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Они широко применяются для диагностики генетических заболеваний и рака, для детекции патогенных вирусов и микроорганизмов, в функциональной ге-номике и нанотехнологии, а также для лечения некоторых заболеваний с помощью антисенс-терапии, что связано с их способностью образовывать комплексы с комплементарными фрагментами нуклеиновых кислот и регуляторными белками. Так, все большее внимание исследователей привлекают такие синтетические фрагменты РНК, как рибозимы, малые интерферирующие РНК (siRNA) и микро-РНК (miRNA). Однако использование в живых организмах природных олигонуклеотидов ограничено в основном из-за их нестабильности в биологических системах и жидкостях. Перспективным путем развития этого направления является использование для тех же целей аналогов нуклеиновых кислот, обладающих повышенной биологической стабильностью и улучшенным проникновением в живые клетки. Одним из способов решения этой задачи является введение в РНК химических модификаций по сахаро-фосфатному остову.
В связи с постоянно возрастающей потребностью во фрагментах РНК и их аналогах с заранее заданными свойствами, в последнее время много внимания уделяется разработке новых методов их химического синтеза. Как и в случае синтеза ДНК, в автоматическом химическом синтезе РНК для наращивания цепи олигонуклеотидов используются защищенные нуклеотидные мономеры. Однако по сравнению с ДНК, получение РНК-мономеров осложняется наличием дополнительной 2'-гидроксильной группы. Основная причина, тормозящая развитие химического синтеза фрагментов РНК, заключается в сложности подбора ортогональных защитных групп для 5'- и 2'-гидроксилов. Для решения проблемы синтеза РНК используются два подхода, один из которых заключается в разработке методов, аналогичных современным подходам к синтезу ДНК, а второй - в разработке специальных подходов к синтезу РНК. В обоих случаях возникает проблема подбора защитных групп, которые были бы совместимы с условиями синтеза, и которые можно было бы легко и количественно удалять в условиях, не приводящих к деградации целевого продукта. Кроме того, данная проблема включает не только подбор 5'- и 2'-ОН защитных групп, но также защитных групп гетероциклических оснований и фосфатного остатка.
В последнее время значительный прогресс был достигнут в синтезе РНК амидофосфитным методом, что привело к заметному увеличению эффективности синтеза и улучшению качества целевых продуктов. Однако в силу своих химических особенностей он не может быть использован для синтеза рада модифицированных олигонуклеотидов, в частности производных, содержащих сильные
электрофильные группировки, такие как азидная и N-оксидная группировки, в составе цепи, а также стереоспецифических фосфоротиоатных аналогов нуклеиновых кислот. Решение этих проблем возможно при использовании фосфотриэфирного метода, который является хорошо разработанным, альтернативным подходом к синтезу олигонуклеотидов.
Цель работы. Диссертация посвящена подбору защитных и модифицирующих групп для 2'-ОН функции рибонуклеотидов, удовлетворяющих требованиям фосфотриэфирного метода и обеспечивающих высокую эффективность автоматического синтеза РНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы впервые был синтезирован ряд рибонуклеотидных мономеров, содержащих различные 2'-0-защитные группы, количественно удаляемые в близких к нейтральным условиях, и продемонстрирована высокая эффективность синтеза природных олигорибонуклеотидов с их использованием. Кроме того, синтезирован ряд мономеров, содержащих 2'-0-модифицирующие группы, в том числе 2'-0-азидометильную (AZM) группу и 2'-0-метоксиметильную (MOM) группу. Исследования по ферментативному расщеплению 2'-0-модифицированных олигорибонуклеотидов, а также исследования термической стабильности дуплексов, образованных этими аналогами олигорибонуклеотидов с комплементарными НК, позволяют сделать вывод о возможности их применения для различных молекулярно-биологических исследований.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XXIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (158 ссылок). Работа изложена на 117 страницах, содержит 10 рисунков, 64 схемы и 4 таблицы.
