Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Применение твердофазных методов иммуно анализа для диагностики инфекционных заболеваний (Обзор литературы)
1.1. Общие принципы классификации иммунохимических методов 18
1.1.1. Основные принципы иммунохимического анализа 18
1.1.2. Типы образцов для иммунохимического анализа 20
1.1.3. Характеристики реагентов, используемых в иммуноанализе ... 22
1.1.4. Системы разделения реагентов, связавшихся и несвязавшихся в ходе иммунологической реакции 28
1.1.5. Системы детекции результатов иммунологического взаимодействия 36
1.1.5.1. Инструментальные методы детекции иммунологического связывания 36
1.1.5.2. Методы детекции результатов иммуноанализа с применением меченых биозондов 38
1.1.6. Форматы твердофазных иммунохимических тестов 50
1.1.6.1. Тесты, выполняемые в планшетах для иммунологических реакций 50
1.1.6.2. Иммунохимические тесты, выполняемые на плоских ,. подложках
1.1.6.3. Быстрые иммунохимические тесты, основанные на фильтрации 59
1.1.6.4. Иммунохимический анализ, выполняемый с , применением микрочастиц
1.1.6.5. Иммунохимический анализ, выполняемый на белковых , матрицах
1.1.6.6. Иммуносенсоры 71
1.2. Методы оценки результатов иммунодиагностических тестов 76
1.3. Стратегии применения иммунодиагностических тестов 78
1.3.1. Иммунодиагностическое обследование в специализированных клинических лабораториях 78
1.3.2. Иммунодиагностическое обследование, выполняемое в слабооснащенных медицинских учреждениях 79
1.3.3. Иммунодиагностическое обследование в кабинете врача и на дому
1.3.4. Специфическая индикация биологических угроз 83
1.4. Подходы к разработке новых иммунодиагностических тестов 89
1.5. Заключение 93
Глава 2. Материалы и методы 97
Глава 3. Разработка планшетного варианта иммуноанализа с визуальным учетом результатов на основе применения в качестве маркеров золей каталитически активных соединений металлов 107
3.1. Предпосылки создания иммунокаталитического теста 107
3.2. Железосодержащие золи 113
3.2.1. Получение железосодержащих золей 113
3.2.2. Оценка эффективности применения железосодержащих золей... 114
3.3. Золи серебра 121
3.3.1. Получение серебряных золей и исследование их структурно-дисперсных характеристик 121
3.3.2. Стабилизация серебряных золей 126
3.3.3. Проявление серебряных золей 129
3.3.4. Оценка эффективности применения серебряных золей 132
3.4. Кобальтсодержащие золи 135
3.4.1. Получение и свойства кобальтсодержащих иммунозолей 135
3.4.2. Проявление кобальтсодержащих иммунозолей 138
3.4.3. Оптимизация условий проведения анализа 148
3.4.4. Оценка эффективности применения кобальтсодержащих золей 156
Глава 4. Разработка и усовершенствование быстрых и простых тестов на пористых подложках с применением корпускулярных маркеров
4.1. Экспрессное иммунофильтрационное выявление антител и антигенов вируса Эбола с применением иммунозолей золота и усиления сигнала физическим проявлением 163
4.1.1. Задачи и условия экспериментов 163
4.1.2. Иммунофильтрационное выявление антител 166
4.1.3. Иммунофильтрационное выявление антигена 167
4.2. Прямое выявление антигенов Yersinia pestis в дот-иммуноанализе на белковых матрицах с обратной фазой с применением иммунозолей серебра 169
4.3. Прямое выявление специфических антител в дот-иммуноанализе с применением иммуносуспензий на основе углеродных маркеров 172
4.3.1. Задачи и условия экспериментов 172
4.3.2. Выявление антител к вирусу паротита с использованием маркеров на основе активированного угля и графитированной сажи 175
4.3.3. Выявление противобруцеллезных антител в сыворотке крови экспериментальных животных с использованием маркеров на основе активированного угля 180
4.3.4. Выявление антител к Treponema pallidum с использованием маркеров на основе норита 181
4.3.5. Выявление биотинилированных белков с применением
маркеров на основе угля, импрегнированного серебром 184
4.3.6. Сравнение чувствительности выявления IgG в ИФА и дот-
иммуноанализе с использованием маркеров на основе коллоидного
золота, активированного угля и угля, импрегнированного серебром... 186
Глава 5. Разработка технологических подходов к конструированию и применению белковых матриц для многопрофильного иммуноанализа с использованием каталитических маркеров 190
5.1. Предпосылки создания многопрофильного теста и постановка задачи 190
5.2. Выбор формата многопрофильного теста 192
5.3. Многопрофильный анализ антигенов 194
5.4. Многопрофильное выявление антител 200
5.4.1. Выбор и исследование свойств материалов для подложки 202
5.4.2. Отработка способов подготовки поверхности подложки 208
5.4.3. Подбор антигенов для изготовления матрицы 212
5.4.4. Выбор способа и условий иммобилизации антигенов на подложке 219
5.4.5. Отработка автоматизированного способа нанесения антигенов... 223
5.4.6. Выбор системы детекции 228
5.4.7. Оптимизация состава и условий применения физического проявителя 231
5.4.8. Оптимизация условий выполнения многопрофильного анализа 235
5.4.9. Испытания лабораторного образца теста для многопрофильного анализа антител 239
5.4.10. Разработка средств инструментального учета результатов теста 248
5.4.11. Разработка прототипа набора реагентов для многопрофильного анализа 255
Заключение 261
Выводы 264
Литература 266
- Характеристики реагентов, используемых в иммуноанализе
- Получение серебряных золей и исследование их структурно-дисперсных характеристик
- Выявление антител к вирусу паротита с использованием маркеров на основе активированного угля и графитированной сажи
- Выбор и исследование свойств материалов для подложки
Введение к работе
Актуальность проблемы. Около 70 % всех регистрируемых болезней человека имеют инфекционную этиологию. В России ежегодно регистрируется до 35 млн. случаев инфекционных заболеваний, а прямые и косвенные потери от них составляют около 15 млрд. руб. (Воробьев А.А., 2002; Шевченко Ю.Л., 2002). Контроль распространения инфекций становится все более трудным при сегодняшних темпах и масштабах миграции. В последние годы реальной угрозой считается возможность преднамеренного использования микробиологических агентов в террористических целях (Щербаков Г.Я., 2002; Park R., 2003). Эффективная борьба с инфекционными заболеваниями требует быстрой и достоверной диагностики. Большинство инфекционных заболеваний имеет сходную клиническую манифестацию и для правильной постановки диагноза необходимы лабораторные методы, среди которых важное место занимает иммунохимический анализ. Эти тесты обладают высокой чувствительностью и специфичностью и позволяют быстро установить видовую, а в ряде случаев и штаммовую принадлежность возбудителя (Егоров A.M. и др., 1991). В настоящее время сохраняется потребность в разработке новых иммунохимических методов. Это объясняется, с одной стороны, разнообразием задач, решаемых с помощью таких средств диагностики, а с другой стороны, неудовлетворенностью пользователей техническими и/или эксплуатационными характеристиками тестов в той или иной ситуации. Развитие методик иммуноанализа необходимо для решения следующих задач: расширения круга определяемых соединений; повышения чувствительности и специфичности; обеспечения способности к одновременному анализу ряда аналитов в одном тесте; упрощения операций и сокращения времени проведения анализа; разработки портативных форматов, не требующих дополнительных реагентов; снижения стоимости тестирования; увеличения стабильности и сроков хранения диагностических наборов; снижения или устранения риска для пользователя и окружающей среды; совершенствования технологии производства тест-систем (Taylor R.F., 2006).
Первыми сталкиваются с инфекционными заболеваниями работники первичных звеньев системы здравоохранения, и от их действий зависит как здоровье пациента, так и дальнейшее распространение болезни. Решение должно быть принято быстро, а транспортирование образцов для исследования в специализированную лабораторию отнимает много времени, а иногда просто невозможно. Первичные учреждения здравоохранения не всегда имеют базу для выполнения сложных анализов и нуждаются в оснащении надежными, но простыми и недорогими бесприборными диагностическими тестами. В России с ее огромной территорией и отдаленностью населенных пунктов такие тесты особенно необходимы. Однако они производятся только по лицензиям зарубежных фирм, имеют ограниченный ассортимент и дороги.
Разнообразные задачи по иммунодиагностике инфекционных заболеваний и индикации биологических агентов не могут быть решены с
помощью какого-либо одного универсального метода. Более того, набор разнообразных тестов необходим, поскольку параллельное исследование с использованием нескольких независимых методик значительно повышает достоверность полученных результатов (Kartalov Е.Р., 2006).
Таким образом, актуально создание комплекса методов для обеспечения иммунохимического тестирования в слабооснащенных медицинских учреждениях или во внелабораторных условиях, что позволит сделать диагностику более своевременной и доступной, а санитарно-эпидемиологический контроль более оперативным и эффективным.
Цель исследования. Разработка технологических подходов к созданию и применению бесприборных методов твердофазного иммунохимического анализа на основе высоко дисперсных корпускулярных маркеров.
Задачи исследования:
оценить возможность применения в иммунохимическом анализе неорганических катализаторов как маркеров, альтернативных ферментным препаратам;
разработать технологию получения и применения каталитических маркеров, обеспечивающую надежный визуальный учет результатов иммуноанализа в микротитровальных планшетах;
провести комплекс исследований по разработке высокодисперсных корпускулярных маркеров и применению их в быстрых и простых методах иммуноанализа:
золей серебра, как каталитического маркера, альтернативного коллоидному золоту;
высокодисперсного активированного угля, как цветного маркера, обладающего универсальными адсорбционными свойствами;
измельченного угля, импрегнированного серебром, как комбинированного маркера, сочетающего свойства цветной и каталитической метки;
разработать технологические подходы к изготовлению белковых матриц и выполнению на них многопрофильного дот-иммуноанализа с использованием каталитических маркеров;
создать прототип автономного набора для многопрофильного анализа, позволяющего выполнять исследования во внелабораторных условиях.
Научная новизна. Впервые предложено и экспериментально обосновано применение золей неорганических катализаторов в качестве маркеров иммунохимического анализа, альтернативных ферментным меткам (Патент РФ № 2092853, приоритет от 12.10.1992). Разработан метод планшетного иммуноанализа с использованием в качестве маркера кобальтсодержащих золей, обеспечивающий надежный визуальный учет результатов.
Отработана технология получения и применения высокодисперсного активированного угля как цветного маркера в дот-иммуноанализе, позволяющая создавать простые и недорогие тесты для проведения
исследований во внелабораторных условиях (Патент РФ № 218712, приоритет от 08.02.1999).
Впервые отработаны способы получения и применения в качестве маркера в дот-иммуноанализе высокодисперсного активированного угля, импрегнированного каталитически активными золями серебра, способные повысить чувствительность дот-анализа на пористых подложках за счет проявления золей (Патент РФ N 2133469, приоритет от 02.04.1997).
Отработаны технологические подходы к изготовлению и применению белковых матриц для одновременного выявления ряда антигенов (Патент РФ № 202129206, приоритет от 31.10.02) или антител (Патент РФ № 2296995, приоритет от 20.06.03) в многопрофильном дот-иммуноанализе с использованием золей золота и усиления сигнала физическим проявлением. Разработан прототип автономного набора реагентов для многопрофильного анализа, позволяющего одновременно определять 8 различных аналитов в каждом образце и пригодного для использования во внелабораторных условиях (Патент РФ № 2298795, приоритет от 29.03.04).
Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработан комплекс технологических подходов к созданию и применению твердофазных иммунохимических тестов, пригодных для осуществления диагностики инфекционных заболеваний и специфической индикации патогенов в слабооснащенных медицинских учреждениях и во внелабораторных условиях.
Предложенный принцип применения каталитически активных неорганических маркеров, в частности кобальтсодержащих золей, позволяет создавать планшетные варианты иммуноанализа с надежным визуальным учетом результатов. Такой подход допускает выполнение теста в медицинских учреждениях, не обеспеченных регистрирующим оборудованием.
Отработанная технология получения и применения в дот-иммуноанализе золей серебра, а также корпускулярных маркеров на основе активированного угля и угля, импрегнированного серебром, позволяют создавать простые и недорогие тесты с визуальным учетом результатов, пригодные как для массового скрининга, так и для выполнения индивидуальных анализов. Такие тесты пригодны для выполнения иммунохимического анализа в экстраординарных ситуациях. В ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» эти методы рекомендованы для анализа образцов в полевых условиях и используются при конструировании тест-систем для диагностики чумы, бруцеллеза и туляремии (Акт о внедрении от 07.02.02 г.).
Разработанные технологические подходы к конструированию белковых матриц и выполнению на них одновременного анализа нескольких аналитов позволяют создавать автономные и информативные тест-системы для комплексного иммунохимического обследования. Внедрение теста на белковых матрицах в широкую практику может дать значительный экономический эффект за счет невысокой себестоимости тест-систем, сокращения затрат на
проведение анализа и приборное обеспечение. Данные технологические подходы могут также послужить основой для создания белковых матриц с различным спектром специфичности (для контроля переливаемой крови, обследования эпидемиологических очагов и других диагностических задач).
Отработанные в наших экспериментах методы иммуноанализа сочетают
высокую чувствительность, надежность, простоту выполнения и скорость
получения результатов. В то же время они значительно дешевле существующих
аналогов и могут выполняться повсеместно, что делает их более доступными
для пациентов. Кроме того, применение таких тестов позволяет оперативно
осуществлять эпидемиологический мониторинг и санитарно-
эпидемиологический контроль, а также проводить быструю оценку ситуации при возникновении биологических угроз.
Описанные выше технологические подходы не требуют дорогого оборудования, универсальны и могут быть использованы при производстве диагностических наборов любой специфичности. Такие подходы могут найти применение не только в диагностике инфекционных заболеваний, но и в других отраслях медицины, а также в ветеринарии, экологических исследованиях и научных экспериментах.
Предложенные технологические подходы защищены 7 патентами РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на
следующих конференциях: Межрегиональной научно-практической
конференции с международным участием «Новые химические системы и
процессы в медицине», (Новосибирск, 2001); Международной научной
конференции «Natural infectious diseases» (Улан-Батор, 2002); Международном
мультидисциплинарном семинаре «Прогресе в биотехнологии и нейробиологии
- интегративная медицина» (Хургада, Египет, 2004); Международной
конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и
практические аспекты» (С-Петербург, 2004); Научно-практической конференции с международным участием «Серебро и висмут в медицине» (Новосибирск, 2005); Международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Научно-практической конференции с международным участием «Нанотехнологии и наноматериалы для биологии и медицины» (Новосибирск, 2007).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 311 страницах, содержит 28 таблиц и 68 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и 2 приложений. Список цитированной литературы включает в себя 414 источников, из них 329 иностранных.
Характеристики реагентов, используемых в иммуноанализе
Выбор иммунореагентов, обеспечивающих выделение из образца аналита на твердой фазе (реагенты захвата), а также его определение (реагенты детекции), является наиболее актуальной задачей при создании диагностического теста [370]. Иммунореагент захвата должен распознать свою цель среди 10000 других видов белка в образце и обеспечить прочное связывание с ней в течение всего тестирования [313]. Другая важная характеристика реагента захвата - его способность сохранять активность после иммобилизации на поверхности и при выполнении различных этапов анализа, которые могут потребовать жестких условий для исключения неспецифических взаимодействий [153]. В качестве реагентов в иммунологическом анализе преимущественно используются антитела и антигены белковой природы, реже - небелковые молекулы, например, входящие в состав аллергенов [198, 103], медикаментозных препаратов [203] или нуклеиновых кислот [147, 181, 258, 395].
Антитела являются базисом любого иммуноанализа, независимо от системы регистрации и усиления сигнала или от применяемых реагентов. Они представляют собой гетерогенную группу у-глобулинов (иммуноглобулинов) сыворотки крови и подразделяются по физико-химическим свойствам и числу антигенсвязывающих участков на пять классов [3]. В каждом классе антител можно выделить подклассы и подподклассы, различающиеся помимо прочего размером тяжелых цепей [3, 9].
Выработка сывороточных антител в организме развивается в определенном порядке. При первичном введении антигена вначале появляются антитела класса М (3-6 день), затем класса G (5-14 день) и, наконец, класса А (15-21 день). При повторном введении антигена антитела М-класса образуются в малом количестве и быстро образуются антитела классов G и А. Иммуноглобулины класса М являются антителами первичного ответа, IgG - основными антителами со строго выраженной специфичностью, IgA играют роль в формировании местного иммунитета слизистых оболочек, IgE имеют большое значение в развитии аллергических реакций, a IgD обуславливают развитие аутоиммунных процессов [3].
Каждая молекула антитела имеет участки (так называемые Fab-фрагменты), специфически связывающие антигенные детерминанты (эпитопы). В формировании антигенсвязывающего центра Fab-фрагмента принимают участие вариабельные домены легких и тяжелых цепей молекулы иммуноглобулина, при этом форма внутренней полости этого центра и распределение зарядов комплементарны таковым антигенных детерминант [9]. Именно участки связывания придают молекуле антитела ее специфичность. Подсчитано, что иммунная система способна продуцировать 106-10 различных специфических иммуноглобулинов [3]. Молекулы антител имеют от 2 (IgG) до 10 (IgM) участков связывания антигена. В нативной молекуле антитела все Fab-фрагменты моноспецифичны [9]. В последнее время с помощью гибридомных технологий и методов генной инженерии получают биспецифические антитела и антитела с другими необычными свойствами [35, 339].
Участок антигена (эпитоп), который реагирует с антителом, определен только его взаимодействием со связывающим участком антитела. Поскольку антитела могут распознавать относительно небольшие области антигенов, они иногда могут находить подобные эпитопы на других молекулах. Это формирует молекулярную основу перекрестной реактивности [51]. Связывание антитела с антигеном зависит полностью от нековалентных взаимодействий, а комплекс антитело-антиген находится в равновесии с компонентами в свободном состоянии [51, 357].
В иммунологических тестах используются преимущественно иммуноглобулины класса G, специфичные к целевым антигенам, они могут быть или поликлональными или моноклональными. Как правило, поликлональные антитела нарабатывают путем иммунизации животных, таких как овцы или козы, где они могут быть получены в большом количестве [153]. Поликлональные сыворотки содержат антитела, специфичные к множеству эпитопов, но могут иногда обеспечивать большую специфичность, чем моноклональные антитела, если нежелательная перекрестная реактивность удалена иммуноаффинным фракционированием с использованием очищенных антигенов [313]. Однако поликлональная сыворотка может содержать около 10000 различных по специфичности видов молекул иммуноглобулинов, поэтому выделение чистой фракции моноспецифических антител связано со значительными трудностями [3].
Для использования в сэндвич-анализах могут быть получены моноклональные антитела, обладающие высоким аффинитетом и специфичностью, на различные эпитопы одной молекулы антигена [153, 357]. Все молекулы моноклональных антител идентичны [35]. Такие иммунореагенты предпочтительны в конкурентных методах иммуноанализа, поскольку в таких случаях меченые или связанные с твердой фазой антигены и определяемые аналиты конкурируют за одинаковые центры связывания. Следует отметить, что около 90% мышиных моноклональных антител относятся к иммуноглобулинам подкласса G! и при нейтральных значениях рН плохо связываются с белком A Staphylococcus aureus, часто использующимся в качестве реагента детекции в сэндвич-анализе [35]. Кроме того, различные моноклональные антитела имеют разные изоэлектрические точки и различаются по конформационной устойчивости (например, иммобилизация на подложке мышиных моноклональных антител подкласса IgG3 представляет большую проблему [326]), что необходимо учитывать при их связывании с твердой фазой.
Источниками антигена при разработке теста с захватом антител могут быть лизаты клеток, очищенные белки, а также рекомбинантные и синтетические белки [153]. Вся совокупность белков микроорганизма содержит очень большое число эпитопов, в том числе и антигенных детерминант, способных проявлять перекрестную реактивность. В ряде случаев достаточная специфичность анализа может быть достигнута с использованием лизатов или частично очищенных белков. Однако, свойства таких антигенов (иммунологические, сорбционные, электрохимические и другие) значительно варьируют в зависимости от видовых и штаммовых различий источника антигена, способа и среды его культивирования, используемых методов инактивации, выделения, очистки и консервации антигена [357]. Кроме того, прямое связывание белковых антигенов с гидрофобной подложкой может приводить к частичной или полной денатурации связанного белка и потере конформационных эпитопов [132]. Разнообразие свойств натуральных антигенов вызывает необходимость тщательного подбора компонентов тест-системы и условий проведения анализа в каждом конкретном случае. Успехи молекулярной биологии последних лет сделали возможной масштабную наработку синтетических и рекомбинантных антигенов, которые с каждым годом все шире внедряются в практику иммуноанализа [58].
Синтетические пептиды недороги и могут обладать высокой степенью чистоты, благодаря эффективным методам очистки с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешения. Недостаток коротких пептидов состоит в том, что они обычно представлены линейными, а не конформационными эпитопами. Кроме того, и набор линейных эпитопов в таких антигенах весьма ограничен и в ряде случаев не обеспечивает высокой чувствительности теста [340, 177]. Вследствие малой молекулярной массы и отсутствия четкой объемной структуры такие пептиды плохо адсорбируются и требуют ковалентной привязки к твердой фазе с определенной ориентацией молекул [255, 344]. Кроме того, из-за сниженной скорости реакции вблизи от поверхности подложки, распознавание мелких пептидных молекул часто затруднено [153]. Перечисленные недостатки ограничивают применение синтетических пептидов для диагностики инфекционных заболеваний.
Получение серебряных золей и исследование их структурно-дисперсных характеристик
Наиболее доступными и надежными способами получения высокодисперсных золей металлов считаются конденсационные, основанные на химическом восстановлении металлов из их растворимых солей [85]. Обычно для получения высокодисперсных золей серебра, применяемых в медицинских и технических целях, используют восстановление металла в присутствии защитных растворов белков, полисахаридов или синтетических полимеров [22, 60]. При этом одновременно происходит ядрообразование, конденсация частиц серебра и блокировка их поверхности защитным полимером, препятствующим дальнейшему росту металлических ядер и стабилизирующим золь [22]. Однако такой подход не может быть использован для получения золя - маркера, поскольку маркер необходимо связать с иммунореагентами, а насыщенная поверхность описанных золей теряет адсорбционные свойства. Если же использовать иммунореагенты в качестве защитных коллоидов непосредственно при приготовлении золей, они при контакте с ионами серебра теряют свои специфические свойства. Следует отметить, что золи с дисперсностью менее 2 нм подвержены окислению [8] и перекристаллизации с растворением мелких и увеличением размеров более крупных частиц [22], что также недопустимо для каталитического маркера.
Фотозоли, получаемые посредством лазерного облучения водных растворов солей серебра, также непригодны для использования в качестве маркеров. Приведенные ранее [6, 7] описания таких препаратов свидетельствуют о полиморфности и полидисперсности частиц, что, как известно, служит причиной коагуляционной неустойчивости золей [85].
При выполнении настоящей работы опробованы конденсационные методы получения коллоидного серебра с использованием ряда восстановителей, таких как цитрат натрия, Fe(II), фотопроявляющих и других веществ. Выбрана наиболее простая, доступная и воспроизводимая процедура получения золей с применением боргидрида натрия. Золи серебра получали восстановлением из растворов азотнокислого серебра с концентрациями от 0,005 % до 0,05 % (в/о) в деионизованной воде равными объемами 0,5 %-го раствора боргидрида натрия. Все операции по получению и нагрузке золя проводили при активном перемешивании и комнатной температуре. При добавлении нитрата серебра в раствор боргидрида образовывался высокодисперсный, гомогенный и стабильный золь, а при обратном порядке смешивания золь часто получался полиморфным, полидисперсным, частично агрегированным. Отмеченный эффект согласуется с представлениями о стабилизирующей способности избытка анионов, образующих внешний слой мицеллы и препятствующих слипанию частиц благодаря отталкивающим электростатическим силам [85]. Мы использовали в работе препараты, полученные добавлением раствора соли серебра к раствору боргидрида натрия, поскольку они более стабильны и воспроизводимы.
После 10-15 минутного созревания золя осуществляли его адсорбционное связывание с кроличьими иммуноглобулинами против всей молекулы IgG человека или SpA (оба препарата фирмы Sigma, США). На начальных этапах работы мы использовали способ максимальной нагрузки золя иммунокомпонентами, отработанный [288, 322] для получения иммунозолей на основе золота. Однако для удаления из препарата несвязавшихся биокомпонентов, вместо предлагаемого в этих работах ультрацентрифугирования, мы применяли метод колоночной фильтрации через гели, предназначенные для разделения соединений с большой молекулярной массой, такие, например, как Акрилекс П-300 (Reanal, Венгрия), Sephacryl S-400 (Pharmacia, Швеция) или Toyopearl (TSK, Япония). Такая очистка была не менее эффективна, но более доступна, чем ультрацентрифугирование. Недостатком этого подхода являлось значительное разбавление иммунозоля элюирующим раствором, часто влекущее за собой необходимость концентрирования препарата методами диализа или ультрафильтрации.
В дальнейшем, чтобы избежать длительной и дорогой процедуры очистки мы использовали метод «дробной нагрузки» при значительном избытке маркера. Осуществляли расчет теоретически возможной максимальной сорбции IgG на поверхности золя. Площадь участка связывания IgG принимали равной 20 нм . Примеры расчетов для золей с концентрацией 1 мг/мл приведены в таблице 6. Согласно таким расчетам частица диаметром 10 нм может удерживать на своей поверхности до 15 молекул IgG, а максимальная нагрузка составляет около 0,5 мг IgG на 1 мг золя или 30 мкг IgG на 1 мл золя.
Для связывания с золем мы использовали количество иммуноглобулинов, в 5 раз меньше величины, полученной расчетным путем, и метод дробной нагрузки золя. При таком подходе не вся поверхность частиц покрыта иммуноглобулинами, но свободные участки поверхности блокируются БСА и не мешают проведению анализа. Полученный препарат без дополнительной очистки использовали при проведении анализа. Для исследования дисперсионных характеристик использовали золи, стабилизированные БСА.
Исследование структурно-дисперсных характеристик золей, полученных из растворов с разной концентрацией азотнокислого серебра и стабилизированных БСА, проводили методами малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) и электронной микроскопии. При анализе структуры частиц золей применяли теорию метода МУРР. Измерения малоугловых рентгенограмм проводили на дифрактометре фирмы "Siemens" (Германия). Длина волны используемого излучения 1=0,154 нм (СиКа), температура образцов при измерении рентгенограмм - 18С. Малоугловые рентгенограммы измеряли в угловом диапазоне: 0.195 h 0.828 нм" , где h = 4% Sin(Q)/X,, 2Q - угол рассеяния. В рентгенограммы вносились поправки на фоновое рассеяние, коллимацию, проводилось сглаживание. Использовался метод контраста [64] с применением растворителя, сходного про плотности с белковым компонентом иммунозолей - БСА (р=1,27 г/см3). При этом рассеяние от БСА затенено, а регистрируется только сигнал от металлических ядер золей. Для получения растворителя с заданной плотностью использовали сухую сахарозу, как описано в работе Ю.Д. Холодовой и П.П. Чаяло [79]. Вычисление Dv(R) - функций объемного распределения частиц по размерам выполнялось по алгоритмам, описанным в работе Д.И. Свергуна с соавт. [64].
Выявление антител к вирусу паротита с использованием маркеров на основе активированного угля и графитированной сажи
При изготовлении диагностикумов в качестве иммунореагента использовали антиген вируса паротита в весовом соотношении с маркером 1:2000, соответственно. В работе использовали: 1) иммунную кроличью сыворотку к штамму Эндерс вируса паротита (П1), полученную после трехкратной иммунизации животного очищенным вирусом в дозе 100 мкг/иммунизацию/животное; 2) сыворотку реконвалесцента (П2); 3) нормальную кроличью сыворотку (НКС); 4) нормальную сыворотку человека (НЧС), производства НИИ ЭМ им. Г.Н. Габричевского (Москва). Сыворотки НКС и НЧС не содержали антител к вирусу паротита по данным РТГА и реакции нейтрализации.
Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) проводили традиционным методом, используя эритроциты обезьяны (Масаса multatta).
Иммуноферментный анализ выполняли, на планшетах сенсибилизированных антигеном вируса паротита в дозе 1,0 мкг на ячейку. Для определения антител к вирусу паротита в сыворотке крови кролика использовали конъюгат пероксидазы хрена с козьими иммуноглобулинами против IgG кролика. Для определения антител к вирусу паротита в сыворотке крови реконвалесцента использовали конъюгат пероксидазы хрена с моноклональными антителами против всех подклассов IgG человека.
В этой работе мы использовали формат теста для массового скрининга образцов и сравнивали два вида углеродных маркеров - активный уголь (БАУ) и графитированную сажу (ГТС), а также два блокирующих агента - БСА и поливинилпирролидон 40 кДа (ПВП-40) (Sigma, США). С использованием весового соотношения антигенгмаркер = 1:2000 были получены четыре препарата на основе паротитного антигена: БАУ с блокированием ПВП-40 - БАУ-П;БАУ с блокированием БСА - БАУ-Б; ГТС с блокированием ПВП-40 - ГТС-П; ГТС с блокированием БСА - ГТС-Б. Для оценки эффективности сорбции антигена на углеродных маркерах по 5 мл каждой иммуносуспензии подвергали очистке от возможно несвязавшегося с сорбентом антигена. Очистку производили двукратным центрифугированием при 10000 g в течение 15 минут. Осадок после каждого цикла очистки ресуспендировали пипетированием в 5 мл 0,02 М трис-HCl, рН 7,2, с 0,15 М NaCl, 0,1 % азида натрия и добавлением 0,5 % БСА или ПВП-40, соответственно исходной иммуносуспензии. Результаты дот-блот-анализа серий трехкратных разведений иммунных и нормальных сывороток с использованием исходных и очищенных иммуносуспензии представлены на рисунке 25.
Результаты анализа с использованием иммуносуспензий на основе БАУ до и после очистки были практически идентичны, что указывало на полное связывание антигена углем при нагрузке сорбента. Неочищенная суспензия на основе графитированной термической сажи практически не связывалась с сыворотками, а после очистки реагировала с ними, что свидетельствовало о наличии в неочищенной суспензии свободного (несвязанного с маркером) антигена, блокирующего активные центры иммуноглобулинов. Интенсивность сигнала, чувствительность и специфичность определения с использованием ГТС-иммуносуспензии была значительно ниже, чем с суспензией на основе БАУ, что позволило сделать вывод о слабой сорбирующей или удерживающей способности ГТС в условиях эксперимента, а также о наличии на поверхности ее частиц участков связывания, не блокирующихся БСА и ПВП.
Слабая сорбционная способность ГТС согласуется с представлением о ней, как о типичном непористом неспецифическом сорбенте, поверхность которого в идеале представлена однородной базисной гранью графита, адсорбирующей в основном за счет универсального неспецифического дисперсионного притяжения [33]. Пористый БАУ имеет удельную площадь примерно на порядок большую, чем ГТС (более 100 м /г), поверхность его неоднородна и содержит полярные и функциональные участки, обеспечивающие более прочные связи с белковыми молекулами [67]. Возможно, более эффективная посадка антигена на поверхность ГТС могла быть достигнута модификацией ее поверхности или созданием специальных условий (рН, ионная сила, наличие определенных ионов и т.п.). Такой интенсивно окрашенный непористый маркер мог бы иметь предпочтение в плане экономного и эффективного использования сорбируемого иммунореагента [305]. Однако настоящие исследования не предполагали поиск таких условий и ограничились в дальнейшем оценкой иммуносуспензий на основе БАУ.
При работе с полиморфными и полидисперсными взвесями, такими как суспензии механически измельченного угля, важно знать какой фракции этой взвеси можно отдать предпочтение. Мы разделили иммуносуспензий БАУ на крупную фракцию, осаждающуюся центрифугированием при 3000 g в течение 5 мин, и более мелкую, собранную центрифугированием при 10000 g в течение 15 мин. Все осадки ресуспендировали пипетированием в исходном объеме стабилизирующего раствора с 0,5 % БСА или ПВП-40, соответственно исходному составу. Мембраны, аналогично предыдущему эксперименту, блокировали 2 %-ми растворами БСА или ПВП-40 на 0,02 М трис-HCl буфере, рН 7,2, в течение 15 мин, и инкубировали 30 мин в соответствующих мелких и крупных фракциях иммуносуспензий БАУ-Б и БАУ-П. В каждую суспензию помещали по 2 мембраны. По окончании одну мембрану быстро прополаскивали в воде, другую - фиксировали в стакане, заполненном 0,02 М трис-НС1 буфером (рН 7,2) и отмывали в течение 10 мин на магнитной мешалке при частоте вращения 300 об/мин. Результаты анализа приведены на рисунке 26.
Крупные фракции при слабой отмывке обеспечивали более яркий сигнал, но при более интенсивных отмывочных процедурах, в отличие от мелкой фракции, слабо удерживались на поверхности мембраны. Вероятно, это было связано с наличием в крупной фракции агрегатов угольных частиц, разрушающихся или смываемых в процессе интенсивной отмывки. Мелкая фракция обеспечивала при той же чувствительности более стабильные и воспроизводимые результаты. ПВП-40 обладал слабым защитным действием для угольных частиц. Уголь в иммуносуспензиях, содержащих ПВП-40, в течение 1-3 суток коагулировал и полностью выпадал в осадок. В суспензиях с БСА часть угля тоже осаждалась, но значительное количество частиц оставалось во взвешенном состоянии в течение 2-3 месяцев и более.
Осадки и в том и в другом случаях легко суспендировались пипетированием или интенсивным встряхиванием, заметного ухудшения качества препаратов при этом не происходило. Наряду с более слабым стабилизирующим действием на суспензию, ПВП-40 обладал и более слабой, чем БСА, способностью уменьшать неспецифическое связывание. Увеличение концентрации ПВП-40 до 4 % не повышало эффективности блокирования, а снижение до 1 % требовало увеличения времени инкубации примерно вдвое (до 30 мин, по сравнению с 15 мин при 2 %-ой концентрации) и не всегда препятствовало связыванию иммуносуспензии со свободными от сыворотки участками мембраны. Повышение концентрации БСА в блокирующем растворе выше 2 % ослабляло интенсивность оптического сигнала при выполнении анализа, но не исключало связывание иммуносуспензии с малыми (до 1/27) разведениями нормальных сывороток.
Выбор и исследование свойств материалов для подложки
Первичный отбор материалов для изготовления подложки белковой матрицы, мы производили по следующим критериям: однородность (по цвету и структуре) поверхности; нерастворимость (неразмокаемость) в условиях анализа; наличие известных методов связывания с белками, простота обработки при изготовлении матрицы и удобство при выполнении анализа.
Так, несмотря на то, что нам удалось добиться прочной ковалентной иммобилизации ряда антигенов на поверхности стекла, позволяющей выполнять одновременный анализ специфических антител в сыворотках пациентов, этот материал был признан малоперспективным и отвегнут по следующим причинам: - ковалентное связывание - технически сложный, длительный и относительно дорогой метод иммобилизации; - стекло - хрупкий материал, неудобный при изготовлении и применении матриц; - стекло - прозрачный материал, что затрудняет визуальный учет результатов. Более подробно нами были изучены три группы листовых материалов: пористые матрицы на основе полимерных материалов, непористые органические полимеры, а также синтетическая бумага, сочетающая органические и минеральные компоненты. Морфологические исследования их поверхности выполняли методами атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии. Некоторые материалы (в частности, синтетическая бумага) имели с двух сторон различную структуру, поэтому для них наиболее однородную поверхность именовали в дальнейшем "лицевой". Для оценки материалов по адсорбционным свойствам и способности влиять на результаты анализа их нарезали на полоски (стрипы) с размерами 8 х 60 мм и наносили по определенной схеме антигены на рабочую часть стрипа. При исследовании материалов мы оценивали три параметра: - эффективность адсорбции антигенов, о которой судили по интенсивности оптического сигнала в месте нанесения антигена после выполнения анализа с положительной сывороткой; - способность к неспецифическому связыванию компонентов, о которой судили по наличию или отсутствию фоновых оптических сигналов на несенсибилизированной подложке после выполнения анализа; - способность материала самостоятельно провоцировать осаждение серебра из проявителя, о которой судили по наличию или отсутствию фоновых или артефактных оптических сигналов на поверхности чистого тестируемого материала после стандартной процедуры физического проявления.
Основные результаты исследований приведены в таблице 20. Нитроцеллюлозные мембраны хорошо адсорбируют белки, однако изготовлены из очень хрупкого, ломкого материала, что значительно затрудняет их использование. Поливинилхлоридные мембраны эластичны и не ломаются, однако их сорбционная емкость невелика. Одним из основных недостатков пористых мембран является сложность их отмывки от не связавшихся компонентов реакции, особенно от золей, остатки же неотмытого золота провоцируют неспецифическое проявление. Еще одним существенным недостатком доступных пористых мембран является их относительно высокая стоимость. Таким образом, адсорбирующие фильтры, по нашему мнению, малоперспективны для производства белковых матриц.
Непористые листовые материалы на основе органических полимеров весьма разнообразны. В качестве твердой фазы в иммунологических методах чаще используются планшеты, изготовленные из полистирола и поливинилхлорида (ПВХ). Известны случаи применения подложек из лавсана, полиэтилена и других пластиков [27, 51]. Полистирол, ПВХ и лавсан имеют на своей поверхности химические группы способные связывать карбоксильные или аминогруппы белков [166, 211]. Количество таких групп, а, следовательно, и способность пластмассы связывать и удерживать на себе белки, зависит от химического состава, наличия добавок и примесей, а также технологии приготовления и штамповки (прокатки) пластмассы. Листовых пластмасс, специально предназначенных для проведения иммунологических исследований, нам найти не удалось. Наиболее подходящими для этой цели выглядел поливинилхлорид, использующийся фирмой Titerteck (Финляндия) для изготовления ПВХ - планшетов для иммунологических реакций. Для оценки свойств этого материала мы использовали крышки от указанных планшетов. Вопреки ожиданиям, этот материал продемонстрировал слабые сорбционные свойства. Кроме того, прозрачность материала вызывала необходимость тщательной обработки (очистки) подложки с той и другой стороны, что существенно усложняет технологию ее подготовки.
Такими же недостатками обладали прозрачные образцы лавсана (полиэтилентерифталата). Всего проверено 8 партий лавсана от различных производителей, все они обладали сходными характеристиками, поэтому в таблице приведены только наиболее показательные образцы. Немного лучше по сорбционным свойствам выглядели химически модифицированные лавсановые пленки для лазерного принтера, мелкосерийное производство которых было налажено в Институте органической химии (СО РАН, Новосибирск).
Учитывая недостатки прозрачных пластиков, для исследования отбирали образцы непрозрачного листового полистирола, выпускающегося для производства разовой посуды и упаковки. Исследовали доступные партии белого полистирола толщиной до 0,5 мм. Уровень непрозрачности и белизны (матовости) таких материалов варьируется добавками двуокиси титана в расплав прозрачного пластика [211]. Всего исследовано 20 партий обычного (ПС) (ТУ-10-27-90) и ударопрочного (УППС) (ТУ-24-27-90) полистирола. Все они показали близкие характеристики и в таблице приведены данные только наиболее показательных образцов. В целом все исследованные подложки показали хорошую сорбционную способность, но требовали предварительной обработки (очистки) поверхности. Однако даже тщательно химически очищенная поверхность полистирола имела участки слабо сорбирующие белки и участки, провоцирующие спонтанное осаждение серебра из растворов физического проявителя. По приблизительной оценке такие дефектные участки составляли до 5% поверхности пластика. Ознакомление с технологией изготовления листового полистирола показало, что при его производстве обычно используются добавки вторичного сырья (бывшей в употреблении посуды и упаковки). Количество таких добавок варьирует от партии к партии и может достигать 60 %. Возможно, выявляемые на пластике артефакты связаны именно с посторонними примесями, вносимыми с вторичным сырьем. Все попытки получения подходящего по параметрам пластика, чистого от вторичного сырья, не увенчались успехом.
