Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
Эксайтотоксичность 15
Окислительный стресс 17
Агрегирование белков 18
Нарушение аксонального транспорта 19
Дефицит нейротрофических факторов 20
Реактивация клеточного цикла 21
Астроциты, микроглия иГЭБ 25
Механизмы гибели нейронов 27
Диагностика и прогноз БАС 42
Маркеры аберрантной активации клеточного цикла и дисбаланса протеолитических систем в ЦСЖ при неврологических заболеваниях 46
Глава 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Общая характеристика больных 49
2.2. Биохимические методы исследования 53
Глава 3. Результаты 62
3.1. Экспрессия белков клеточного цикла в ЦСЖ больных 62
3.2. Активность протеолитических ферментов и их модуляторов в ЦСЖ больных }
3.3. Маркеры клеточной гибели и нейронспецифические белки в ЦСЖ больных 79
3.5. Оценка проницаемости ГЭБ. Альбуминовый индекс 87
3.6. Диагностическая ценность маркеров ЦСЖ 89
3.7. Клинические наблюдения 91
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 102
Выводы 116
Библиографический указатель
- Дефицит нейротрофических факторов
- Маркеры аберрантной активации клеточного цикла и дисбаланса протеолитических систем в ЦСЖ при неврологических заболеваниях
- Биохимические методы исследования
- Оценка проницаемости ГЭБ. Альбуминовый индекс
Введение к работе
Аісгуальность проблемы
Боковой амиотрофический склероз (БАС) является фатальным нейродегенеративным заболеванием. Вопрос этиологии и патогенеза БАС до настоящего времени не решен, что приводит к поздней диагностике заболевания и к неэффективности разнообразных терапевтических подходов.
Сложность разработки патогенетического лечения определяется несколькими основными причинами. Следует отметить, что БАС является мультифакториальным заболеванием, и это существенно затрудняет выделение основных патогенетических механизмов в качестве мишеней для воздействия. Важную роль играет генетическая предрасположенность, которая определяется мутациями в различных генах, реализуется под воздействием факторов внешней среды и запускает целый ряд патологических процессов. Доказано участие в патогенезе БАС эксайтотоксичности, окислительного стресса, патологического агрегирования белков, нарушения аксонального транспорта, дефицита нейротрофических факторов, аберрантной активации клеточного цикла, патологии астроцитов и нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) (Захарова М.Н. и соавт., 2009; Shaw P.J., 2005). В результате, при отсутствии данных, убедительно доказывающих решающую роль того или иного механизма и данных о запускающем заболевание молекулярном механизме, ставится вопрос о комплексной терапии, хотя эффективность такого подхода пока не показана.
Кроме того, до сих пор остается открытым вопрос о причинах гетерогенности клинических и морфологических проявлений болезни у человека. Принято считать, что избирательность поражения мотонейронов определяется особенностями их морфологического строения, рецепторного пула мотонейронов и недостаточностью кальций-связывающих белков. Тем не менее, у каждого пациента болезнь начинается с поражения определенной группы мотонейронов, имеет индивидуальный для каждого пациента темп прогрессирования, в ряде случаев клиническую картину дополняют когнитивные и вегетативные нарушения. У пациентов старшего возраста, при бульбарной и первично-генерализованной формах заболевания БАС течет более «злокачественно» (Завалишин И.А., 2009; Mitsumoto Н., 2001; Norris F.H., 1992). Эти факты говорят о том, что, возможно, необходим индивидуальный подход к лечению каждого пациента, в то
время как в клинических рандомизированных испытаниях не учитываются индивидуальные особенности течения БАС у того или иного пациента.
Подавляющая часть наших представлений о механизмах патогенеза БАС получена модельных условиях (на животных и клеточных линиях), а эти результаты не могут бьп прямо перенесены на заболевание человека. Так, на мышах и нейрональных культурах мутацией в гене цитозольной супероксид дисмутазы (СОДІ) убедительно продемонстрировано участие каспаза-зависимых и каспаза-независимых механизмов программированной клеточной гибели (ПКГ). Результаты, полученные на материале пациентов с БАС, значительно более фрагментарны. Несоответствие усугубляется тем, что существует множество различных моделей БАС. Наряду с линией мышей с мутацией G93A в гене СОДІ, которая наиболее широко используется в качестве модели БАС, существует более десяти различных моделей с другими мутациями в гене СОДІ. Кроме того, патология мотонейронов описана у мышей с мутациями в гене алейна, легких цепей нейрофиламентов, эндотелиального фактора роста, а также у мышей с увеличенной экспрессией периферина или динамантина. У каждой из перечисленных моделей есть уникальные особенности клинических и морфологических проявлений нейродегенерации (Kato S., 2008). В связи с этим остается открытым вопрос о возможности прямой трансляции на человека наших знаний о моделях БАС.
Изучение патогенеза и причин гетерогенности заболевания у человека наряду с исследованием аутопсийного материала может быть основано на исследовании прижизненных маркеров патологического процесса. Так, исследования крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) подтвердили участие в патогенезе заболевания эксайтотоксичности, оксилительного стресса, нейровоспаления и дефицита нейротрофических факторов (Turner M.R. et al., 2009). Показано, что в крови больных БАС повышено содержание глутамата (Ilzecka J. et al., 2003), уровень активных метаболитов кислорода (Захарова М.Н., 2001), концетрация интерлейкина 6 (Ono S. et al., 2001) и моноцитарного хемоаттрактанта, а также ряда других маркеров (Simpson Е.Р. et al., 2004). В ЦСЖ повышен уровень макрофагалыюго хемоаттрактанта (Tanaka М. et al., 2006), снижено содержание сосудистого эндотелиального фактора роста (Moreau С. et al., 2006), эритропоэтина (Brettschneider J. et al., 2007); кроме этого, снижен антиоксидантный потенциал ЦСЖ больных БАС (Захарова М.Н., 2001; Siciliano G. et al., 2007). С помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) в различных режимах - ТІ, диффузионно-взвешенного изображения, функционального МРТ и спектроскопии - удалось
визуализировать как преимущественное поражение кортикоспинального тракта, так и вовлечение в процесс других популяций нейронов, в частности нейронов лобных извилин у пациентов с когнитивными нарушениями (Waragai М. et al., 1997; Ciccarelli О. et al., 2006; Tessitore A. et al., 2006; Lule D. et al., 2007). Часть биохимических и МРТ-маркеров показали свою диагностическую и прогностическую ценность (Turner M.R. et al., 2009). Однако, до сих пор ни один из них не вошел в клиническую практику, а в диагностике и прогнозе спорадического БАС используются лишь клинические и нейромиографические критерии.
Таким образом, поиск новых прижизненных маркеров БАС является актуальной научной задачей. Этот поиск должен быть основан на выявлении периферических маркеров универсальных патогенетических механизмов, таких как аберрантная активация клеточного цикла, патология глиальных клеток, нарушение проницаемости ГЭБ, активация каспаз и других протеолитических ферментов. Сопоставление уровня маркеров с клинической картиной заболевания - длительностью, формой, вариантом, темпом прогрессирования болезни, а также с возрастом больного - возможно, позволит выявить патогенетически наиболее значимый механизм, пролить свет на причины клинической гетерогенности болезни и установить последовательность патологических событий.
Цель исследования: изучение роли белков клеточного цикла и протеолитических ферментов в патогенезе БАС и поиск новых диагностических маркеров заболевания.
Задачи исследования:
Определить экспрессию белков клеточного цикла - циклин-зависимой киназы-1 (cdk-1), циклин-зависимой киназы-4 (cdk-4), циклина В1- в цереброспинальной жидкости больных боковым амиотрофическим склерозом.
Определить активность протеолитических ферментов - каспазы-3, калпаина-1, катепсина В - в цереброспинальной жидкости больных боковым амиотрофическим склерозом.
Оценить активность модуляторов протеолитических ферментов - каспазы-3, калпаина-1 и катепсина В - в цереброспинальной жидкости больных боковым амиотрофическим склерозом.
Изучить содержание маркеров клеточной гибели и нейронспецифических белков -лактатдегидрогеназы, нейронспецифической енолазы, фосфорилированных тяжелых цепей
нейрофиламентов - в цереброспинальной жидкости больных боковым амиотрофическнм склерозом
Оценить проницаемость гематоэнцефалического барьера у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом путем измерения альбуминового индекса.
Провести клинико-биохимические сопоставления уровня изучаемых маркеров с формой, вариантом течения, длительностью заболевания и характером его прогрессирования.
Научная новизна исследования:
Впервые проведено комплексное клинико-биохимическое исследование уровней белков клеточного цикла, активности протеолитических ферментов и их модуляторов в ЦСЖ больных БАС, позволяющее оценить вклад аберрантной активации клеточного цикла и дисбаланса протеолитических систем в патогенез БАС.
Впервые показано увеличение экспрессии циклин-зависимой киназы-1 в ЦСЖ больных БАС. Установлена связь уровня экспрессии циклин-зависимой киназы-1 с формой и длительностью заболевания. Продемонстрировано, что повышенная экспрессия этого белка клеточного цикла определяет неблагоприятный прогноз болезни, так как уровень cdk-І выше у пациентов с быстрым темпом прогрессирования БАС.
Впервые в ЦСЖ больных БАС выявлено специфичное для данного заболевания повышение калпаиноподобной активности при низких значениях рН (КПАк). Показана связь КПАк в ЦСЖ с формой, длительностью болезни и с уровнем маркеров клеточной гибели. Полученные данные указывают на возможное сходство исследуемого фермента с известными калпаинами.
Впервые показано, что ЦСЖ пациентов с БАС имеет специфический профиль влияния на активность протеолитических ферментов. При сравнении с контрольной группой и больными рассеянным склерозом (PC) установлено, что в ЦСЖ пациентов с БАС повышена степень ингибирования калпаина-1 и степень ингибирования катепсина В. Продемонстрировано, что активность ингибиторов калпаина-1 и катепсина В зависит от формы и длительности заболевания. Выявлено, что степень ингибирования катепсина В при добавлении ЦСЖ больных БАС обратно коррелирует со степенью дыхательных нарушений.
При анализе свойств ингибиторов калпаина-1 и катепсина В впервые показано, что в ЦСЖ как в норме, так и при патологии, содержатся низкомолекулярные (менее 10 кД) ингибиторы калпаина-1 и катепсина В.
Научно-практическая значимость работы:
В работе выявлены признаки активации клеточного цикла и дисбаланса протеолитических систем, что имеет важное теоретическое значение для понимания патогенеза БАС. Полученные данные дают основание предположить, что аберрантная активация клеточного цикла и протеолитические системы участвуют в нейродегенеративном процессе при БАС.
При анализе ЦСЖ выявлен новый, не описанный ранее, фермент, обладающий калпаиноподобной активностью при низких значениях рН. Показано, что в ЦСЖ присутствуют низкомолекулярные ингибиторы цистеиновых протеаз, калпаина-1 и катепсина В.
Показано, что уровень экспрессии циклин-зависимой киназы-1 и альбуминовый индекс могут быть использованы в качестве маркеров прогрессирования болезни. Повышение уровня циклин-зависимой киназы-1 и альбуминового индекса на ранних стадиях болезни является плохим прогностическим фактором и характерно для быстро прогрессирующего течения БАС.
Установлено, что в диагностике БАС может быть использован анализ уровня фосфорилированных тяжелых цепей нейрофиламентов в ЦСЖ, калпаиноподобная активность в ЦСЖ, степень ингибирования калпаина-1 и катепсина В при добавлении ЦСЖ. Перечисленные маркеры согласно полученным данным обладают высокой чувствительностью и специфичностью.
Основные положения, выносимые на защиту:
Развитие патологического процесса при боковом амиотрофическом склерозе происходит на фоне повышения экспрессии белка клеточного цикла, циклин-зависимой киназы-1, и дисбаланса протеолитических систем в цереброспинальной жидкости.
Нейродегенеративный процесс сопровождается повышением уровня маркеров клеточной гибели в цереброспинальной жидкости и нарушением гематоэнцефалического барьера.
Активация клеточного цикла и увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера могут служить пусковыми механизмами програмированной клеточной гибели и
аксональной дегенерации, в то время как активация протеолитических систем происходит на более поздних этапах патологического процесса.
Наиболее выраженные изменения биохимических показателей происходят при самоіі «злокачественной», бульбарной, форме бокового амиотрофического склероза.
Исследованные маркеры могут быть использованы в диагностике и прогнозе течения нейродегенеративного процесса при БАС.
Апробация работы
Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании сотрудников первого, второго, третьего, пятого, шестого неврологических и научно-консультативного отделений, лабораторий патологической анатомии, нейрохимии и клинической биохимии НЦН РАМН 08.09.2009 г. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференции молодых ученых 29.12.2008 в НЦН РАМН, а также на 11 конгрессе Европейского общества неврологов (EFNS) (Бельгия, Брюссель, 2007); на 18 конгрессе Международной Ассоциации, посвященной заболеваниям мотонейрона (ALS/MND Association) (Канада, Торонто, 2007).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи, 4 тезиса научных конференций и глава в монографии (в соавторстве).
Объем и структура диссертации.
Дефицит нейротрофических факторов
Под эксайтотоксичностью принято понимать механизм повреждения нейрона, обусловленный воздействием на него избыточного количества возбуждающих нейромедиаторов. Это действительно для классической эксайтотоксичности, при которой нейродегенерация провоцируется избыточной синаптической концентрацией глутамата. Однако описана и медленная форма эксайтотоксичности, при которой глутамат оказывает свое пагубное действие не за счет высокой концентрации, а вследствие длительного времени воздействия, увеличения чувствительности рецепторов или нарушения механизмов внутриклеточного депонирования ионов кальция (Doble А., 1999; Van Den Bosch L. et al., 2006). Повышение концентрации глутамата в синаптической щели может произойти в результате его избыточного выделения из пресинаптической терминали, а также в результате нарушения обратного захвата глутамата или разрушения близлежащих клеток с выходом глутамата в межклеточное пространство. Обратный захват глутамата осуществляется транспортерами ЕААТ2 и GLT 16 1, экспрессирующимися в астроцитах. При реализации эксайтотоксичности ключевым является взаимодействие глутамата с ионотропными рецепторами NMDA и AMP А, что приводит к повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция (Са2+) (Choi D.W., 1988; Prehn J.H. et al., 1995). Избыточная концентрация Ca"+ может быть губительной для клетки по причине чрезмерной активации различных кальций-зависимых ферментов, и образования активных форм кислорода при захвате ионов кальция митохондриями (Dykens J.A., 1994; Carriedo S.G. et al., 2000; Urushitani M. et al.,2001).
При Западно-Тихоокеанской форме БАС в роли эксайтотоксинов могут выступать поступающие с пищей семена саговой пальмы, растущей на острове Гуам, в которых содержится эксайтотоксин (З-метиламино-Ь-аланин, являющийся агонистом глутаматных рецепторов и способный приводить к развитию заболевания (Spencer P.S. et al., 1986).
Основную роль в развитии эксайтотоксичности при БАС играет эндогенный глутамат. У пациентов с БАС уровень глутамата в ЦСЖ повышен (Rothstein J.D. et al., 1990; Shaw P.J. et al., 1995), что может быть связано со снижением экспрессии астроцитарного переносчика глутамата ЕААТ2, недостаток которого способен вызывать увеличение концентрации глутамата в синаптической щели (Rothstein J.D. et al., 1995). Мутации в генах ЕААТ2 и субъединицы АМРА-рецептора глутамата предрасполагают к развитию БАС посредством увеличения чувствительности нейронов к эксайтотоксичности.
Однако, нужно отметить, что уровень глутамата в образцах мозговой ткани больных БАС не повышен, а, напротив, снижен (Malessa S. et al., 1991; Tsai G.C. et al., 1991; Plaitakis A. et al., 1988; Perry T.L. et al, 1987). При этом приблизительно у половины пациентов не выявлено изменений концентрации глутамата в биологических жидкостях и уровень экспрессии ЕААТ2 не отличается от нормы. Тем не менее, эффективность препарата рилузол, который уменьшает эксаитотоксичность, свидетельствует о роли эксайтотоксичности в патогенезе заболевания.
Окислительный стресс
Развитие окислительного стресса провоцируется повышением внутриклеточной концентрации кальция, которое в свою очередь может быть связано с описанным выше механизмом эксайтотоксичности. При повышенном содержании ионов кальция нарушается дыхательная цепь митохондрий и образуется избыток супероксид-аниона, который способен индуцировать каскад свободнорадикальных реакций. Образующийся при деградации супероксид-аниоиа пероксинитрит участвует в нитрировании тирозиновых остатков различных белков, что препятствует их регуляторному фосфорилированию.
Свободные радикалы имеют множество внутриклеточных мишеней. Так, есть данные о связи свободнорадикальных реакций с изменением функциональной активности рецепторов и ионных каналов. Активные формы кислорода способны окислять различные функциональные группы белков, что приводит к утрате активности ферментов. Альдегиды, образующиеся в процессе окислительного стресса, участвуют в образовании межмолекулярных сшивок и патологическом агрегировании белков. Гидроксильный радикал атакует пуриновые и пиримидиновые основания. Таким образом, при перекисном окислении липидов нарушается функция мембран, органелл, происходит повреждение ДНК, то есть нарушается нормальное функционирование клеток (Болдырев А.А., 1995; Dean R.T. et al., 1997; Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., 2006).
Маркеры аберрантной активации клеточного цикла и дисбаланса протеолитических систем в ЦСЖ при неврологических заболеваниях
Определение влияния ЦСЖ больных на активность протеаз
1. Определение влияния ЦСЖ больных PC и контрольной группы на активность рекомбинантной человеческой активной каспазы-3. 10 мкл ЦСЖ смешивали с 10 мкл активной рекомбинантной человеческой каспазы-3 (BioSource International Inc., США) и 20 мкл реакционной среды. Конечные концентрации реагентов в смеси: 50 мМ MES (Serva, ФРГ), рН 7.4, 10 мМ DTT (Sigma, США), 100 мкМ флуорогенный субстрат каспазы-3 Ac-DEVD-AMC (Biomol, США), 0,5 U/ml активной рекомбинантной человеческой каспазы-3. Измерение производили в 384-луночной плашке NUNC 384. В качестве положительного контроля использовали пробу без добавления ЦСЖ для определения общей активности фермента. Флуоресценцию измеряли при температуре 37С в динамике в течение 60 минут с интервалом измерений 10 мин при длинах волн возбуждения и эмиссии 380 и 440 нм соответственно. Калибровочную кривую строили по флуоресценции свободного АМС (Sigma, США). Влияние ЦСЖ на активность фермента оценивали в виде среднего процента активности фермента.
2. Определение влияния ЦСЖ больных PC и контрольной группы на активность активного очищенного человеческого калпаина-1. 10 мкл ЦСЖ смешивали с 10 мкл активного очищенного человеческого калпаина-1 (Sigma, США) и 20 мкл реакционной среды. Конечные концентрации реагентов в смеси: 50 мМ MES (Serva, ФРГ), рН 7.4, 5 мМ DTT (Sigma, США), 2.5 мМ СаС12, 800 мкМ флуорогенный субстрат калпаина Ас-LY-AMC (Biomol, США), 1,25 U/ml активного очищенного человеческого калпаина-1. Измерение производили в 384-луночной плашке NUNC 384. В качестве положительного контроля использовали пробу без добавления ЦСЖ для определения общей активности фермента. Флуоресценцию измеряли при температуре 37С в динамике в течение 60 минут с интервалом измерений 10 мин при длинах волн возбуждения и эмиссии 380 и 440 нм соответственно. Калибровочную кривую строили по флуоресценции свободного АМС (Sigma, США). Влияние ЦСЖ на активность фермента оценивали в виде среднего процента остаточной активности фермента.
3. Определение влияния ЦСЖ больных PC и контрольной группы на активность активного очищенного бычьего штепсина В. 10 мкл ЦСЖ, разведенного в 4 раза, смешивали с 10 мкл активного очищенного бычьего катепсина В (Sigma, США) и 20 мкл реакционной среды. Конечные концентрации реагентов в смеси: 15 мМ ацетат натрия, рН 5.0, 5 мМ DTT (Sigma, США), 100 мкМ флуорогенный субстрат катепсина В Z-RR-AMC (Biomol, США), 0,25 U/ml активного очищенного бычьего катепсина В. Измерение производили в 384-луночной плашке NUNC 384. В качестве положительного контроля использовали пробу без добавления ЦСЖ для определения общей активности фермента. Флуоресценцию измеряли при температуре 37С в динамике в течение 60 минут с интервалом измерений 10 мин при длинах волн возбуждения и эмиссии 380 и 440 нм соответственно. Калибровочную кривую строили по флуоресценции свободного АМС (Sigma, США). Влияние ЦСЖ на активность фермента оценивали в виде среднего процента остаточной активности фермента.
Гельфильтрацию ЦСЖ проводили на колонке для высокоэффективной хроматографии Protein-Pak 60 (Waters, США) в фосфатном буфере рН 6,5. Определение активности лактатдегидрогеназы в ЦСЖ больных Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) проводили согласно методическим рекомендациям, приведенным в Lases Е.С. et al. (2004), с модификациями. Образец ЦСЖ (10 мкл) смешивали с реакционной средой (10 мкл), конечные концентрации реагентов: 25 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 2.5 мМ пируват, 0.5 мМ NADH (все реактивы производства Sigma, США). После 10 мин инкубации при 37С к реакционной смеси добавляли 15.6 мкл 1 N НС1 и инкубировали 15 мин при комнатной температуре для удаления непрореагировавшего NADH. Затем к пробам добавляли 125 мкл 6 N NaOH, инкубировали 10 мин при 60С и измеряли флуоресценцию при длинах волн возбуждения и эмиссии 360 и 460 нм соответственно. В качестве стандартной пробы использовали 0.05 мг/мл ЛДГ (Sigma, США) в 25 мМ Tris-HCI, рН 7.5. Все образцы измерены в двух параллелях. Активность фермента выражали в нмоль/мин/мг белка. В предварительных экспериментах установлена зависимость флуоресценции NAD 1 от концентрации белка и времени инкубации пробы. Определение концентрации нейронспецифической енолазы (НСЕ) в ЦСЖ больных
Для определения концентрации нейронспецифической енолазы в ЦСЖ больных БАС и людей контрольной группы мы использовали коммерческий набор для НСЕ ELISA (Chemicon, USA).
Лунки были промыты один раз промывочным раствором. Затем пипетировали по 25 мкл стандартов NSE и ЦСЖ пациентов в лунки. В каждую лунку раскапали по 100 мкл инкубационного раствора (конъюгат HRP Анти-НСЕ и биотинилированные анти-НСЕ антитела). Инкубировали плашку 1 час при комнатной температуре в микропланшетном шейкере. После инкубации промывали каждый стрип 6 раз. Затем добавляли по 100 мкл субстрата ТМБ в каждую лунку. Инкубировали 30 минут при комнатной температуре в шейкере. Считали абсорбцию при длине волны 620 нм на микропланшетном ридере.
Определение концентрации фосфорилированных тяжелых цепей нейрофиламентов (фНФТ) в ЦСЖ больных
Для определения концентрации фНФТ в ЦСЖ больных PC, БАС и людей контрольной группы мы использовали коммерческий набор для фНФТ ELISA (Chemicon, USA). Аналитическая чувствительность набора 0.0585 нг/мл, диапазон детекции - от 0.0293 до 15 нг/мл. Все этапы производили согласно методическим указаниям. Сначала увлажняли 100 мкл TBS ячейки стриппованой плашки 12 8 с адгезированными поликлональными антителами цыпленка к человеческим фНФТ, инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем, после удаления из ячеек TBS, в ячейку вносили по 50 мкл ЦСЖ, стандарты и контроли. Инкубировали 1 час при комнатной температуре при бережном помешивании. Аспирировали содержимое ячеек, отмывали 6 раз Wash Buffer. Затем вносили 100 мкл
Биохимические методы исследования
Содержание НСЕ в ЦСЖ было определено в подгруппе из 16 больных БАС и у 10 пациентов из группы контроля. Группы были сопоставимы по полу, среди пациентов с БАС было 10 мужчин (62,5%) и 6 женщин (37,5%), а в группе контроля - 6 мужцин (60%) и 4 женщины (40%). Возраст больных БАС составил 49,7±9,7 лет и был сопоставим с возрастом группы контроля (52,3±9,4 лет). Шейно-грудная форма была отмечена у 8 (50%) больных БАС, пояснично-крестцовая - у 4 (25%), бульбарная - у 4 (25%). Смешанный вариант течения заболевания встречался у 11 больных (68,75%). Преобладание сегментарно-ядерных нарушений ("переднероговой вариант") или пирамидной симптоматики наблюдалось у 4 (25%) и 1 (6,25%) больных соответственно. Длительность заболевания до 1 года отмечена у 5 больных (31,25%), от 1 года до 2 лет - у 8 (50%), более 2 лет - у 3 (28,75%). В обследованной группе быстрый темп прогрессирования наблюдался у 10 (62,5%) больных, медленный - у 6 (37,5%) человек. ЖЕЛ больных БАС составила 89,7 (78,5; 99,7) процентов от ДЖЕЛ, тяжесть заболевания - 32,5 (28,5;34,5), срок до генерализации - 9 (7; 10) месяцев.
Экспрессия нейронспецифической енолазы ЦСЖ больных БАС составила 14,0 нг/мл (9,8; 18,9) и не отличалась от контрольной группы - 11,9 нг/мл (8,7; 16,5)(рис.3.22). БАС(п=16) Контроль(п=10) Рисунок 3.22. Концентрация НСЕ в ЦСЖ. Данные представлены в виде медианы и верхнего квартиля. При анализе содержания НСЕ в ЦСЖ больных с разной длительностью заболевания и разными формами БАС достоверных различий между подгруппами больных получено не было. Ни одна из подгрупп, выделенных по длительности или по форме болезни не отличалась от контроля.
Тем не менее, уровень НСЕ в группе больных БАС прямо коррелировал с активностью ЛДГ (г=0,86; р=0,00083) (рис. 3.23). Активность ЛДГ, нмоль НАДН/мин/мг В ранее опубликованных работах по определению содержания НСЕ в ЦСЖ были включены лишь единичные образцы от больных БАС, входившие наряду с пробами от пациентов с другими неврологическими заболеваниями в группы сравнения (Kohira I. et al., 2000). Нами впервые проведено изучение концентрации НСЕ в группе пациентов из 16 человек с разными формами заболевания, с разной длительностью и темпом прогрессирования БАС.
В группу пациентов с БАС, у которых в ЦСЖ была измерена концентрация фНФТ вошло 10 человек, 6 мужчин (60%) и 4 женщин (40%). В группу контроля вошло 7 пациентов, 4 мужчин (57,1%) и 3 женщин (42,9%). Возраст больных составил 48,9±11,9 лет и был сопоставим с возрастом группы контроля (51,8=Н0,1 лет). Медиана длительности заболевания равнялась 13 (8; 26) месяцам, а тяжесть заболевания в этой группе была 32 (27; 35) баллов по шкале ALSFRS-R, ЖЕЛ - 97,4 (84,5; 99,85) процентов от ДЖЕЛ, срок до генерализации - 10 (7; 13) месяцев. У 5 (50%) пациентов диагностирована шейно-грудная форма, у 3 (30%) - бульбарная, у 2 (20%) - пояснично-крестцовая. Доля пациентов с длительностью болезни менее года составила 30%, от одного до двух лет - 40%), более двух лет - 30%. Группу сравнения составили 16 пациенты с PC. Средний возраст больных PC составил 38,7±8,5, среди пациентов было 3 мужчин (18,7%) и 13 женщин (81,3%). Группа PC была сопоставима по возрасту с группой больных БАС, однако возраст больных PC был ниже, чем возраст контрольноай группы (р-0.041). В группе пациентов с PC, в отличие от группы БАС и контрольной группы, преобладали женщины.
Концентрация фосфорилированных тяжелых цепей нейрофиламентов в ЦСЖ достоверно выше в группе больных БАС, чем в контрольной группе (р=0,016) (табл. 3.5, рис.3.24). В группе больных PC отмечена тенденция к более высокой, чем в группе контроля экспрессии фНФТ (р=0,068). Подгруппы больных БАС, выделенные по форме или по длительности заболевания не отличаются друг от друга по концентрации фНФТ в ЦСЖ. Однако достоверное отличие от контрольной группы зафиксировано для пациентов с меньшей длительностью заболевания (группы с длительностью до 1 года и 1-2 года) (р 0,05) (рис. 3.25), а также у пациентов с шейно-грудной и бульбарной формами заболевания (р 0,05) (рис. 3.26). Выявлена корреляция концентрации фНФТ с жизненной емкостью легких (г=0.69, р=0.04), что также указывает на повышение уровня нейрофиламенов в ЦСЖ преимущественно на ранних стадиях БАС. При PC выявлена достоверная обратная корреляция концентрации фНФТ в ЦСЖ с длительностью заболевания (г=-0.656, р=0,008) (рис. 3.27). Полученные результаты согласуются с данными литературы, в соответствии с которыми в ЦСЖ больных БАС повышается содержание фНФТ (Brettschneider J. et al., 2006; Reijn T.S. et al., 2009).
Альбуминовый индекс был измерен в подгруппе из 24 больных БАС. Среди пациентов с БАС было 16 мужчин (66,7%) и 8 женщин (33,3%). Возраст больных БАС составил 50,4±10,4 лет. Шейно-грудная форма была отмечена у 11 (45,8%) больных БАС, пояснично-крестцовая - у 8 (33,3%), бульбарная - у 5 (20,8%). Смешанный вариант течения заболевания встречался у 18 больных (75%). Преобладание сегментарно-ядерных нарушений ("переднероговой вариант") или пирамидной симптоматики наблюдалось у 5 (20,8%) и 1 (4,2%) больных соответственно. Длительность заболевания до 1 года отмечена у 7 больных (29,2%), от 1 года до 2 лет - у 7 (29,2%), более 2 лет - у 10 (41,6%). В обследованной группе быстрый темп прогрессирования наблюдался у 14 (58,4%о) больных, медленный - у 10 (41,6%) человек. ЖЕ Л больных БАС составила 89,7 (79,2; 100) процентов от ДЖЕЛ, тяжесть заболевания - 32 (29,5;35,5), срок до генерализации - 9 (6; 13) месяцев.
Верхняя граница нормальных значений альбуминового индекса (QHOPM) была рассчитана по формуле Reiber (С2норм=(4+Возраст/15) 10-3) для каждого пациента индивидуально (Reiber Н., 1995). У 50% пациентов с БАС альбуминовый индекс превышал нормальные расчетные значения. Альбуминовый индекс был достоверно выше у пациентов с быстрым темпом прогрессирования БАС (р=0,027) и у пациентов на стадии генерализации, чем у пациентов, не достигших этой стадии (р=0,031). У пациентов с бульбарной формой альбуминовый индекс достоверно выше, чем у пациентов с пояснично-крестцовой формой БАС (рис.3.28). Достоверных отличий между группами, выделенными по длительности заболевания не получено. Полученные данные согласуются с данными более ранних работ, где показано повышение проницаемости ГЭБ у пациентов с БАС, однако в в опубликованных исследованиях доля пациентов с нарушением ГЭБ составляла около 30% (Brettschneider J. et al., 2006), что несколько меньше, чем в нашей работе.
Оценка проницаемости ГЭБ. Альбуминовый индекс
Следует также отметить, что в отличие от авторов опубликованных работ (Reijn T.S. et al., 2009; Brettschneider J. et al., 2006) мы определяли концентрацию фНФТ с помощью коммерчески доступного стандартизированного набора (ELISA kit), что повышает воспроизводимость результатов и расширяет возможности по внедрению в практику.
В нашей работе получены также данные, свидетельствующие о вовлечении в патогенез БАС повышенной проницаемости ГЭБ. Альбуминовый индекс был достоверно выше у пациентов с быстрым темпом прогрессирования БАС, чем с медленным, и у пациентов на стадии генерализации, чем у пациентов, не достигших этой стадии. Выявлена корреляция альбуминового индекса с концентрацией фНФТ. Согласно данным литературы альбуминовый индекс повышен у 20-30% пациентов с БАС (Garbuzova-Davis S. et al., 2007), однако мы впервые показали, что проницаемость ГЭБ увеличивается при более злокачественном течении болезни и непосредственно связана с повреждением нейронов. Наши результаты указывают на возможную самостоятельную патогенетическую роль повышенной проницаемости ГЭБ в развитии БАС и согласуются с моделью Zlokovic-Cleveland (Zlokovic B.V. et al., 2008). Согласно этой гипотезе повреждение ГЭБ при БАС приводит к выходу плазменных белков из кровяного русла и отеку, вызывающему локальную ишемию в ткани спинного мозга. Патологическое воздействие ишемии усугубляется нарушенной регуляцией экспрессии VEGF при БАС. Гемоглобин может оказывать прямое нейротоксическое действие (Regan R.F. et al., 1998), связанное с генерацией свободных радикалов и перекисным окислением липидов. Кроме того иммуноглобулины крови могут вызывать развитие аутоиммунных реакций, а их связывание с антигенами нейронов может приводить к генерации активных форм кислорода (Wentworth A.D. et al., 2000). Данная модель заслуживает внимания и требует дальнейших экспериментальных подтверждений.
Полученные нами результаты можно рассмотреть в свете существующих представлений о последовательности патогенетических событий при развитии БАС. Морфологические исследования на мышиной модели БАС показывают, что гибель нейронов начинается на досимптоматической стадии заболевания, когда погибает до 50% мотонейронов передних рогов спинного мозга (Bendotti С. et al., 2004). Нейродегенерация сопровождается астроглыозом, который также начинается до появления первых клинических признаков. Нарушение ГЭБ отмечено на стадии появления первых симптомов заболевания. Единственным морфологическим изменением, которое впервые регистрируется после появления симптомов является воспалительная инфильтрация спинного мозга Т-лимфоцитами. При сопоставлении этих данных с прижизненными исследованиями цереброспинальной жидкости пациентов с БАС можно прийти к следующим заключениям. Маркером процесса нейродегенерации являются тяжелые и легкие цепи нейрофиламентов. По данным литературы более высокий уровень легких цепей нейрофиламентов в ЦСЖ был отмечен у пациентов с меньшей продолжительностью заболевания, а высокая концентрация тяжелых цепей ассоциировалась с быстрым темпом прогрессирования заболевания. Наши результаты также указывают на повышение концентрации фНФТ преимущественно в начале заболевания. Эти данные хорошо согласуются с динамикой нейродегенеративных изменений по данным морфологических исследований. Есть также работы, в соответствии с которыми уровень хемоаттрактантов, синтезируемых астроглией (МСР-1 и IL-8), повышается по мере прогрессирования заболевания. Уровень этих медиаторов воспаления обратно коррелировал с оценкой по шкале ALSFRS. Это можно соотнести с прогрессированием астроглиоза. Уровень маркера активации Т-лимфоцитов (IL-2) также был повышен в ЦСЖ больных БАС, но не коррелировал с клиническими показателями.
На основании этих данных можно сделать предположение, что источником cdk-І, уровень которой обратно коррелирует с длительностью заболевания являются гибнущие нейроны. Ингибиторы калпаина и катепсина В, уровень активности которых превышал контрольный только в первый год болезни, по-видимому, также выходят из разрушенных нейронов. Можно предположить, что повышение КПАк преимущественно на второй год болезни связано с тем, что фермент с калпаиноподобной активностью синтезируется астроцитами или клетками воспаления. Этот фермент может определять описанное в литературе токсическое действие ЦСЖ на мотонейроны (Vijayalakshmi К. et al., 2009) и поддерживать тем самым прогрессирование заболевания. Корреляция активности этого фермента с активностью ЛДГ подтверждает это предположение (Схема 4.1).
Выявленные нами изменения в составе ЦСЖ могут быть использованы для разработки диагностических и прогностических маркеров БАС.
Уровень cdk-1 в ЦОК может иметь прогностическую ценность у пациентов на ранних стадиях БАС. Тем не менее, этот белок на сегодняшний день не может стать диагностическим маркером БАС, так как увлечение экспрессии cdk-1 происходит не при всех формах БАС (низкая чувствительность), а также при других неврологических заболеваниях (низкая специфичность).
В качестве диагностического маркера может быть использована степень ингибирования катепсина В при добавлении ЦСЖ пациента с БАС, так как ее повышение является специфичным для БАС, наблюдается у пациентов с разными формами заболевания и коррелирует с клинической картиной.
В нашей работе впервые показано, что альбуминовый индекс может быть использован для прогноза БАС. Его повышение на ранних стадиях болезни ассоциируется с более злокачественным течением заболевания.
В нашей работе мы подтвердили высокую диагностическую ценность определения концентрации фНФ-Т в ЦСЖ при БАС. Согласно рекомендациям Европейской ассоциации неврологических обществ тяжелые цепи нейрофиламентов в ближайшем будущем могут быть использованы в качестве биомаркеров нейрональной гибели и аксонального повреждения при различных неврологических заболеваниях, в том числе при БАС (Deisenhammer F. et al., 2009).
Таким образом, проведенное исследование подтвердило вовлеченность абберантной активации клеточного цикла и дисбаланса протеолитических систем в патогенез БАС на разных стадиях его развития. На основании полученных результатов предложены диагностические и прогностические маркеры БАС.
