Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Вводная часть 12
1.2. Биологические и физико-химические свойства инсулина 14
1.3. Генетические конструкции для производства субстанции инсулина человека 21
1.4. Лекарственные формы инсулина и их фармакодинамика и фармакокинетика 27
1.5. Осложнения, сопровождающие инсулинотерапию 36
1.6. Инсулиннезависимый сахарный диабет и амилоидогенез 39
1.7. Заключение по главе 1 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 44
2.1. Лабораторные животные 44
2.2. Материалы 46
2.3. Методы 50
ГЛАВА 3. Собственные исследования 55
3.1. Изучение фармакодинамики гипогликемического действия и фармакокинетики инсулина 56
3.2. Изучение общетоксического действия инсулина 64
3.2.1. Острая токсичность 64
3.2.2. Подострая токсичность 67
3.2.3. Местнораздражающее действие 76
3.3. Изучение аплергизирующего и иммунотропного действия 77
3.3.1. Выявление анафилактогенной активности 79
3.3.2. Определение реакции гиперчувствительности «замедленного» типа 80
3.3.3. Определение реакции дегрануляции тучных клеток 81
3.3.4. Оценка клеточного иммунного ответа 83
3.3.5. Оценка гуморального иммунного ответа 85
ГЛАВА 4. Заключение 86
Обсуждение 88
Выводы 95
Библиографический список использованной литературы
- Генетические конструкции для производства субстанции инсулина человека
- Инсулиннезависимый сахарный диабет и амилоидогенез
- Материалы
- Изучение аплергизирующего и иммунотропного действия
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сахарный диабет - хроническое заболевание, обусловленное абсолютной или относительной недостаточностью инсулина. Оно характеризующееся глубоким нарушением обмена углеводов с гипергликемией и глюкозурией, а также другими нарушениями обмена веществ в результате воздействия ряда генетических и внешних факторов [23].
Инсулин до настоящего времени служит радикальным, а в большинстве случаев единственным средством для поддержания жизни и трудоспособности больных сахарным диабетом (СД). До получения и внедрения инсулина в клинику в 1922-1923 гг. больных сахарным диабетом I типа (СД I типа) ждал летальный исход в течение одного-двух лет с начала заболевания, несмотря на применение самых изнурительных диет. Больные СД I типа нуждаются в пожизненной заместительной терапии препаратами инсулина. Прекращение в силу тех или иных причин регулярного введения инсулина ведет к быстрому развитию осложнений и скорой гибели больного.
В настоящее время СД по распространенности находится на 3-м месте после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. По данным Всемирной организации здравоохранения, распространенность СД среди взрослого населения в большинстве регионов мира составляет 2-5 % и имеется тенденция увеличения количества больных почти в два раза каждые 15 лет [26, 43]. Несмотря на очевидный прогресс в области здравоохранения, численность инсу-линзависимых больных увеличивается с каждым годом и на текущий момент только в России составляет около 2 миллионов человек. Прогнозируемая продолжительность жизни у больных СД I типа укорачивается на треть.
Выделяют два основных типа СД: СД I типа (инсулинзависимый СД) и II типа (инсулиннезависимый СД). 20% больных сахарным диабетом — это больные СД I типа, 80%- СД II типа.
СД I типа (ИЗСД) характеризуется абсолютной инсулиновой недостаточностью из-за первичного аутоиммунного поражения (З-клеток островков Лан-
герганса поджелудочной железы (ПЖ), и терапия инсулином требуется для сохранения жизни больному.
В основе патогенеза СД II типа (ИНСД) лежит возрастающая со временем резистентность инсулинчувствительных органов к действию гормона, развивающаяся на фоне повышенного уровня эндогенного инсулина (гиперинсули-немии), сопровождающегося превалированием в организме внепанкреатиче-ских антагонистов инсулина (инсулиназы, глюкокортикоидов, адреналина и др.) [1,9, 73]. В последние годы был достигнут существенный прогресс в понимании патогенеза СД II типа, связанный с установлением значения для этого процесса синтеза и накопления специфической разновидности амилоидного белка (амилина), играющего ключевую роль в поражении островковых клеток ПЖ[8, 129, 136, 137].
Основной проблемой для любого больного СД является развитие поздних многочисленных осложнений болезни, которые вызывают не только ухудшение качества жизни пациентов, но и раннюю инвалидизацию, и преждевременную смерть больных. Среди них, в первую очередь, выделяют микроангиопатии — нефропатию, вызывающую в конечном итоге развитие терминальной почечной недостаточности (поражение почек отмечается у каждого шестого больного СД) и ретинопатию, приводящую к необратимой потере зрения (степень риска развития слепоты у больных СД I типа в 10 раз превышает этот показатель для не страдающих СД лиц), а также преждевременное развитие атеросклероза, поражающего сосуды, что приводит к развитию инфарктов и инсультов. Риск развития ишемической болезни сердца у больных СД I типа в 2-3 раза выше, чем у здоровых лиц. Диабетическая нейропатия создает риск развития синдрома диабетической стопы и нарушает иннервацию жизненно важных внутренних органов, вызывая нарушение их функции. С СД связаны также прямые экономические издержки системы медицинского обслуживания и общества в целом, включая стоимость лекарственных средств, а также затраты из-за потери работоспособности и инвалидности [26,43].
В мировой практике накоплен 80-летний опыт применения инсулина, и
7 пройден значительный путь по выделению и очистке инсулина, в результате чего он стал широко доступен для лечения больных СД.
До 1980 г. для терапии СД весь мир использовал только инсулин животного происхождения - крупного рогатого скота (КРС), свиней, а также полусинтетические инсулины, получаемые из свиного. С начала 1980-х годов внимание ведущих эндокринологов привлечено к биосинтетическим (генно-инженерным, рекомбинантным) инсулинам человека. Для их производства используются рекомбинантные штаммы-продуценты кишечной палочки или дрожжевых клеток. По структуре и биологическим свойствам эти инсулины идентичны панкреатическому инсулину человека. Они индуцируют минимальный уровень побочных реакций у больных СД в отличие от других видов инсулина, что дает возможность резко сократить частоту возникновения осложнений при проведении инсулинотерапии и ограничить инсулиновые аллергии и проявление резистентности к инсулину.
Создание препаратов отечественного генно-инженерного инсулина человека открывает новые возможности решения многих проблем диабетологии России и значительного уменьшения бюджетных затрат. В настоящее время в России созданы возможности производства в ограниченных масштабах лекарственных форм на основе высокоочищенного генно-инженерного инсулина человека, основным разработчиком которых является ГУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов» (ГУ «ГИКиМП»).
Цель исследования. Экспериментальное изучение фармакологических свойств новой отечественной лекарственной формы инсулина человека смешанного типа действия - Инсулмикс (30/70), изготовленной на основе высоко-очищенной генно-инженерной субстанции (производства ОАО «Национальные биотехнологии», Оболенск) в сравнении с зарубежным препаратом инсулина человека - Микстард 30 НМ, фирмы «Ново Нордиск», Дания.
Для достижения поставленной цели потребовалось решение следующих конкретных задач:
1. Сравнительное изучение фармакодинамики гипогликемического эф-
8 фекта и фармакокинетики инсулинов смешанного типа действия путем определения содержания глюкозы и инсулина в крови кроликов до и через различные интервалы времени после введения исследуемых препаратов;
2. Оценка общетоксического действия:
острой токсичности путем введения испытуемых препаратов однократно, белым мышам в различных дозах, значительно превышающих терапевтические, рекомендованные для человека;
подострой токсичности путем введения испытуемых препаратов белым крысам в течение 30 дней и кроликам в течение 51 дня в различных дозах, значительно превышающих терапевтические, рекомендованные для человека;
местнораздражающего действия посредством оценки местной реакции в участках парентерального введения препаратов экспериментальным животным и по реакции на инстилляцию препаратов инсулина в глаза кроликов.
3. Выявление срецифической токсичности:
аллергизирующего действия в опытах анафилактического шока, гиперчувствительности «замедленного» типа (ГЗТ) и дегрануляции тучных клеток (РДТК);
иммунотропного действия в опытах гиперчувствительности «замедленного» типа (ГЗТ) и по методу локального гемолиза Ерне и Нордина.
4. Разработка проекта Фармакопейной статьи предприятия и соответст
вующей нормативной документации на Инсулмикс (30/70).
Научная новизна работы. Автором впервые исследованы физико-химические и фармакологические свойства нового отечественного комбинированного препарата генно-инженерного инсулина человека - Инсулмикс (30/70) производства ГУ «ГИКиМП». Препарат содержит 30% нейтрального раствора инсулина (инсулин короткого действия) и 70% инсулин-протамина (инсулин пролонгированного действия).
В результате экспериментальных исследований выявлена адекватная специфическая сахароснижающая активность и безопасность отечественного лекарственного препарата, не уступающего по фармакологическим показателям
9 зарубежной лекарственной форме генно-инженерного инсулина человека -Микстард 30 НМ. Показано, что Инсулмикс (30/70) и Микстард 30 НМ полностью биоэквивалентны и взаимозаменяемы.
В подострых экспериментах на кроликах исследовано токсическое действие экзогенного препарата инсулина - Инсулмикс (30/70). На модели гиперин-сулинемии, индуцированной у животных высокими дозами экзогенного инсулина человека впервые показано, что при соответствующей компенсации гипогликемии одновременно вводимым раствором глюкозы предельные дозы экзогенного высокоочищенного генно-инженерного инсулина человека не вызывают патологических изменений в органах и тканях экспериментальных животных. С помощью специальных методов окрашивания показано отсутствие образования амилоидных отложений, прежде всего в межклеточном пространстве островков Лангерганса ПЖ.
Практическая значимость работы. Проведенные доклинические исследования показали высокий уровень специфического действия и безопасности препарата Инсулмикс (30/70). Эти данные открывают перспективы создания комплекса отечественных лекарственных средств смешанного типа действия на основе генно-инженерного инсулина человека и их внедрения в клиническую практику. Полученные данные позволяют рекомендовать новый отечественный препарат инсулина человека Инсулмикс (30/70) для дальнейшего изучения в клинике. Материалы диссертации могут быть использованы для разработки новых и усовершенствования существующих методов доклинического испытания лекарственных препаратов инсулина человека.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
1. Результаты оценки фармакодинамики гипогликемического действия и фармакокинетики исследуемых образцов лекарственных форм инсулина. Введение препаратов вызывало длительное содержание инсулина в крови кроликов, заметное снижение концентрации глюкозы и длительное сохранение гипогликемического эффекта. Наблюдаемая пролонгация являлась адекватной
10 продолжительностью гипогликемического эффекта на кроликах при введении смешанной формы инсулина (раствор плюс суспензия).
Данные изучения общетоксического действия испытуемых лекарственных форм инсулина. После однократного введения препаратов инсулина белым мышам в дозах, значительно превышающих терапевтические, погибло не более 12,5% животных, получавших большие дозы инсулина (100 МЕ/кг и выше). Введение испытуемых препаратов инсулина белым крысам в течение 30 дней и кроликам в течение 51 дня в дозах, существенно превышающих терапевтические, не оказывало влияния на динамику прироста массы тела, гематологический и биохимический состав крови и не вызывало патоморфологических изменений во внутренних органах.
Оценка местнораздражающего действия исследуемых препаратов инсулина. Исследования мест парентерального введения препаратов инсулина экспериментальным животным и реакции на инстилляцию инсулина в глаза кроликов свидетельствовали об отсутствии признаков воспаления после введения лекарственных форм инсулина человека.
Критерии оценки аллергизирующего и иммунотропного действия исследуемых препаратов инсулина. Введение исследуемых препаратов не вызывало анафилактического шока у морских свинок. Оба препарата в равной степени обуславливали развитие дегрануляции тучных клеток, феномена ГЗТ и существенно не влияли на индукцию АОК.
Полученные результаты сравнительной оценки биодоступности, биоэквивалентности и др. фармакологических свойств лекарственного препарата Ин-сулмикса (30/70) с препаратом Микстард 30 НМ свидетельствуют об идентичности исследуемых лекарственных форм инсулина. Это позволяет рассчитывать на эффективное использование препарата Инсулмикс (30/70) для индукции гипогликемического действия в организме человека и рекомендовать его для дальнейшего изучения в клинике.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на отраслевой научной конференции ГУ «ГИКиМП» 2 октября 2003 г. и на
внутриинститутской конференции молодых ученых ГУ «Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гау-зе» в честь 50-летия института 14 декабря 2004 г.
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 3 печатные работы.
Митрушкин Д.Е., Новохатский А.С., Кондратьев B.C., Журавлева Е.Е. К вопросу о влиянии экзогенной гиперинсулинемии на амилоидогенез // Проблемы медицинской биотехнологии. Сб. материалов отраслевой научной конференции ГУ «ГИКиМП». М.: 2003. - С. 17-21.
Митрушкин Д.Е., Никулина Е.Е., Иванова М.Е., Черненко СМ. Доклиническое изучение лекарственной формы генно-инженерного инсулина человека — Инсулмикс (30/70) // XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 2005. - С. 684.
Митрушкин Д.Е. Фармакологические свойства отечественного реком-бинантного человеческого инсулина смешанного типа действия - Инсулмикс (30/70) // Химико-фармацевтический журнал. - 2005.- т.39 (№5), с. 37-39.
Основная часть результатов получена автором самостоятельно. Химико-физические свойства препаратов инсулина исследованы сотрудниками ГУ «ГИКиМП» Мазовым М.Ю., Персановой Л.В., Костаковой Г.А. и Дубичевым А.Г. при участии автора. Вклад в работу соавторов отражен в публикациях по теме диссертации.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, заключения, обсуждения, выводов и библиографического списка использованной литературы. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста и включает 20 таблиц, 4 рисунка и 203 литературных источника.
Генетические конструкции для производства субстанции инсулина человека
Как уже было сказано выше, в течение многих десятилетий сохранение жизни больных СД обеспечивалось препаратами инсулина животного происхождения, получаемыми из ПЖ КРС и свиней, а также полусинтетическими инсулинами. Длительное применение этих препаратов, не всегда достаточно очищенных, приводило к развитию ряда побочных эффектов и, в том числе, к иммунологической резистентности к инсулину.
Человеческий инсулин был впервые синтезирован в 1965 г. американским ученым Katsoyannis [144]. Работы по промышленному получению генно-инженерного инсулина человека начались в 1978 г., когда в США появилось сообщение о получении штамма Е. coli (кишечной палочки), продуцирующего проинсулин крысы [52]. В 1980 г. впервые становится возможным промышленное изготовление фармацевтических препаратов человеческого инсулина биосинтетическим путем с помощью применения генно-инженерной технологии. С тех пор генно-инженерный инсулин начинает вытеснять препараты, изготовленные из животного сырья [83, 116].
Для получения генно-инженерного инсулина человека необходимый генетический материал переносят в микроорганизмы, которые начинают синтезировать предшественники инсулина.
В настоящее время в качестве продуцентов инсулина человека, получаемого с помощью рекомбинантной ДНК-технологии, используют либо прока-риотические, либо эукариотические биопродуцирующие системы.
При использовании прокариотической системы применяют специально сконструированные штаммы-продуценты Е. coli, в ДНК которых введен ген, ответственный за синтез инсулина. В дальнейшем осуществляют разрушение клеточной биомассы и выделение проинсулина, который после ферментного отщепления С-пептида превращается в инсулин.
Выделение и последовательная трансформация гибридного белка проходит несколько этапов (обозначены цифрами на рис. 2), приводя в итоге к получению инсулина: 1 этап. Выделение гибридного белка. 2 этап. Расщепление гибридного белка по остатку метионина под действием BrCN на линейный проинсулин и фрагмент А-белка. 3-4 этапы. Образование проинсулина в результате сульфитолиза SH-групп и последовательного замыкания -S-S- связей. 5 этап. Ферментное отщепление С-пептида из молекулы проинсулина с образованием инсулина.
В случае использования эукариотической системы трансформированные дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи), продуцирующие инсулин, выращивают в реакторах на специально разработанных ферментационных средах. В этом случае инсулин может быть выделен как из культу-ральной жидкости, так и из клеточной биомассы после ее разрушения [41].
Использование бактериальных или дрожжевых продуцентов - вопрос выбора, решение которого целиком зависит как от экономических, так и от биотехнологических факторов. Обе экспрессирующие системы имеют свои преимущества и недостатки, сравнительная характеристика которых приведена в табл. 1 [52]. Выбирая ту или иную продуцирующую систему, необходимо учитывать особенности экспрессии и ренатурации как самого целевого белка, так и его базисного вектора.
Как показано многочисленными исследованиями, получаемая этими методами субстанция, представляющая собой мелкокристаллический порошок белого или почти белого цвета, полностью идентична естественному панкреатическому инсулину человека. Она имеет точно такой же аминокислотный ряд в обеих А и В полипептидных цепочках, такую же конформацию молекулы и должна иметь следующие характеристики: - содержание проинсулина, ррт - не более 10; - наличие А21 дезамидоинсулина человека, % - не более 2; - содержание цинка, % - 0,3-0,6; - активность, МЕ/мг - не менее 27,5; - наличие бактериальных эндотоксинов, ЕЭ/мг — не более 10 (табл. 2).
Экспериментальные и клинические испытания показали, что лекарственные препараты инсулина, субстанция которых получена биосинтетическим путем, по биологическим свойствам не отличаются от инсулина, выделяемого из ПЖ человека [61, 118, 140, 146].
Основной проблемой биосинтетического метода получения инсулина человека является полная очистка конечного продукта от малейших примесей использованных микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности. Совершенствование методов промышленного производства инсулина позволило значительно повысить качество его очистки. В настоящий момент наибольшее распространение на всех стадиях очистки промежуточных производных и самого конечного продукта получили хроматографические методы, главным образом ВЭЖХ на различных носителях, являющаяся одновременно основным методом анализа качества препарата наряду с радиоиммунологическим методом. Степень очистки препаратов инсулина оценивается по показателю ppm (part per million)- числу молекул, например, проинсулина, присутствующих в препарате на 1 млн. молекул инсулина. Учитываются также и другие примеси (соматоста-тин, глюкагон, панкреатический полипептид и др.). По степени очистки различают инсулины: обычные, монопиковые, монокомпонентные. Для инсулинов высшей степени очистки (монокомпонентные) ppm не должно превышать 10. Незначительное количество примесей гарантирует минимальные иммуноген-ные свойства монокомпонентных инсулинов, что значительно снижает риск развития аллергических реакций, инсулинорезистентности и др. Выпускаемые в настоящее время человеческие инсулины по степени очистки относятся к монокомпонентным инсулинам. Чистота современных человеческих инсулинов отвечает самым высоким требованиям, предъявляемым к медицинским лекарственным средствам. Каких-либо нежелательных побочных действий, зависящих от примесей, эти препараты инсулина не имеют [13,15,29].
Инсулиннезависимый сахарный диабет и амилоидогенез
Одним из осложнений СД II типа, наряду с рядом других патологий, является появление и накопление амилоидных отложений в межклеточном пространстве островков Лангерганса ПЖ.
Амилоидоз - заболевание, характеризующееся сложным нарушением белкового и углеводного обмена, основным признаком которого является экст-рацеллюлярное отложение особого гликопротеида, специфичного по своему происхождению. Ультраструктурный компонент всех форм амилоидоза, независимо от органа и патогенеза заболевания — амилоидные фибриллы.
По современной классификации выделяют 5 основных групп амилоидоза: идиопатический (первичный), наследственный (генетический), приобретенный (вторичный), старческий и локальный. Во всех названиях типов амилоидоза первой буквой является прописная буква А, означающая слово «амилоид», за ней следует сокращенное обозначение конкретного фибриллярного белка амилоида - А (амилоидный А-белок), L (легкие цепи иммуноглобулинов), TTR (транстирретин), р2М (( - микроглобулин), В (В-белок) и IAPP (островковый амилоидный полипептид). С клинических позиций целесообразно разделение амилоидоза на системную (генерализованную) и локальную формы [42, 84].
Амилоидные отложения обнаруживаются при различных заболеваниях. Обычно в процесс вовлекаются системы органов, причем амилоидные накопления приводят к органной дисфункции или недостаточности. Амилоидные болезни включают амилоид, связанный с болезнью Альцгеймера, синдромом Дауна, хроническими воспалениями, миеломами, прионными болезнями, эндокринными опухолями, СД II типа, полинефропатиями и рядом других заболеваний. Так, например, болезнь Альцгеймера характеризуется накоплением фибриллярной формы пептида, обозначаемого как (3-амилоидный протеин и обнаруживаемого в виде внеклеточных амилоидных пятен, а также в виде амилоидных отложений в пределах стенок церебральных кровеносных сосудов, приводящих к токсичности и нейрональной клеточной смерти [164, 182, 183].
В последние годы был достигнут существенный прогресс в понимании патогенеза ИНСД и роли в его развитии гипергликемии и гиперинсулинемии. Ключевую роль в поражении островковых клеток играет белок амилин - специфическая разновидность амилоидного белка.
Гиперинсулинемия, характерная для данного заболевания, сочетается с повышенной секрецией амилина. Избыток этого пептида переходит в амилоид и вытесняет функциональную ткань островков ПЖ, приводя к дисфункции 0-клеток и, как следствие, к гипергликемии с количественными и кинетическими нарушениями секреции инсулина. Гипергликемия, являясь стимулятором секреции амилина, способствует ещё большему накоплению этого полипептида и ускоренному формированию амилоида. Таким образом, нарушается функция Р-клеток, что в сочетании с состоянием инсулинорезистентности, также ассоциированным с амилином, создает картину СД II типа [129, 130, 142].
При СД II типа скопления амилоида выявляются в островках (более, чем в 90% случаев) и никогда не определяются в паренхиме экзокринной ткани ПЖ [136]. У практически здоровых лиц амилоидоз островков ПЖ выявляют в 7% случаев (преимущественно у лиц пожилого возраста), при инсулиноме — в 59%. При СД I типа, обусловленным первичным аутоимунным поражением Р-клеток островков Лангерганса ПЖ, амилоидного перерождения, по-видимому, не происходит [20, 34].
Амилоидный полипетид (амилин), состоящий из 37 аминокислотных остатков, синтезируется р-клетками островков Лангерганса ПЖ как больных, так и здоровых людей, но у здоровых он накапливается в виде секреторных гранул вместе с инсулином, в молярном соотношении примерно 1:100, откуда секрети-руется (также вместе с инсулином) в кровь в ответ на глюкозу и другие секре-тогены, не откладываясь в островковой ткани. В Р-клетках белок амилин является одним из физиологических модуляторов секреции инсулина [105], однако служит антагонистом при проявлении его действия [8, 188], но при СД II типа он откладывается в виде амилоида в островках Лангерганса, коррелируя с продолжительностью и тяжестью заболевания. Опыты на обезьянах и домашних кошках выявили, что степень образования клеточного амилоида связана со степенью редукции секреции инсулина. Клеточный амилоидоз причастен к гибели р-клеток и обнаруживается при патоморфологическом исследовании островков Лангерганса ПЖ в пространстве между Р-клетками и между Р-клетками и эндо-телиальными клетками, окрашенными специфическим красителем Конго-красным, в 70-90% и более случаев [129, 135,137, 139].
На данный момент в литературе не имеется данных о том, вызывает ли длительное введение экзогенного инсулина амилоидное перерождение гистоар-хитектоники р-клеток островков Лангерганса ПЖ. В связи с этим становится актуальным проведение исследования по оценке длительного введения больших доз экзогенного инсулина на возможное появление и накопление амилоидных отложений в островковой ткани ПЖ и в других органах и тканях, как свидетельство повреждающего действия гормона.
Клеточный амилоидоз является наиболее общей и согласующейся особенностью повреждения панкреатических Р-клеток ПЖ у людей, обезьян, кошек, собак и, менее, у кроликов с СД II типа из-за практически идентичного аминокислотного состава амилина в позициях 21-30, являющихся ответственными за агрегацию амилоидных фибрилл. У крыс и мышей, связанный с диабетом клеточный амилоидоз не развивается в силу особенностей генетики. Аминокислотный состав амилина у этих животных не позволяет амилоидным фибриллам агрегировать с образованием амилоидных отложений [89, 97, 108, 166]. Следовательно, оптимальной биологической моделью для проведения опыта служат кролики, редко используемые экспериментаторами при длительном введении инсулина для изучения его токсичности в связи с их дороговизной и высокой чувствительностью к инсулину (в отличие от общепринятых биомоделей - крыс и мышей).
Материалы
Комплекс методических приёмов, используемых в работе, был выбран с учетом поставленных задач исследования. При проведении сравнительного анализа во всех методах исследования фармакологических свойств лекарственного препарата Инсулмикс (30/70) в качестве образца сравнения использовали препарат Микстард 30 НМ. Активность того и другого препарата была проверена методом ВЭЖХ.
Для оценки фармакодинамики гипогликемического действия (глюкодина-мики) - специфической активности, длительности эффекта исследуемых лекарственных форм инсулина человека - определяли содержание глюкозы в крови кроликов породы Шиншилла, массой 3-4 кг, взятой из краевой вены уха до и через 0,75; 1,5; 3,0; 4,5; 6,0; 7,5 и 9,0 ч после подкожного введения препаратов инсулина из расчета 0,8 ME на 1 кг массы тела животного. Концентрацию глюкозы в плазме крови определяли на глюкозоанализаторе "Сателлит", Россия.
Определение фармакокинетики — оценки скорости всасывания, распределения и метаболизма в организме испытуемых препаратов, проводили путем подкожного введения испытуемых препаратов в дозе 0,8 МЕ/кг кроликам, массой 3-4 кг. Пробы крови отбирали из краевой вены уха, до введения и через 0,75; 1,5; 3,0; 4,5; 6,0; 7,5; 9,0 и 10,5 ч после инъекции, для определения концентрации инсулина в сыворотке крови методом радиоиммунологического анализа. Исследование проводили с помощью счетчика радиоактивных импульсов «LKB Minigamma 1275», Швеция, используя набор реактивов «Рио-Инс-ПГ-I» производства «Института биоорганической химии», Белоруссия.
Исследование общетоксического действия лекарственных препаратов инсулина проводили в опытах по выявлению острой и подострой токсичности.
Острую токсичность препаратов исследовали в опытах на белых мышах при однократном подкожном введении. Препараты вводили белым мышам массой lg-20 г, в дозах из расчета 25; 50; 100; 200 и 400 МЕ/кг массы тела, подкожно. Для уменьшения специфического действия инсулина животным одно временно с инъекцией препаратов вводили внутрибрюшинно 20% раствор глюкозы в объеме 0,5 мл. Наблюдение за состоянием животных продолжали 72 ч.
Подострую токсичность препаратов инсулина изучали на белых крысах линии Вистар, самцах, с исходной массой 120-130 г, которым вводили препарат в дозах 20 и 100 МЕ/кг с последующим введением внутрибрюшинно 20% раствора глюкозы в объеме 2 мл. Контролем служили крысы, которым вводили 2 мл физиологического раствора. Препараты вводили подкожно в течение 30 дней, забой производили через 24 ч после последней инъекции.
После забоя исследовали количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина и глюкозы в крови. Клетки крови подсчитывали в гемоцитометре кондуктомет-рическим ГЦМК-3, количество гемоглобина определяли фотоэлектрокалори-метрически по методу Дервиза и Воробьёва, глюкозу определяли на глюкозоа-нализаторе «Сателлит», Россия.
В сыворотке крови опытных и контрольных крыс определяли следующие биохимические показатели: общий белок, альбумины и глобулины, общий билирубин, холестерин и креатинин. Также ставили формолгелевую пробу. Биохимические параметры определяли с помощью диагностических наборов фирмы «SIGMA», США. Работу проводили на колориметре фотоэлектрическим концентрационном КФК-2МП, СССР, и спектрофотометре Pharmacia LKB Bio-chrom, Англия.
Патоморфологическим исследованиям подвергались жизненноважные органы всех экспериментальных животных, на которых изучали подострую токсичность препаратов инсулина, а также кожа и подкожная клетчатка мест введения препаратов. Материал фиксировали в жидкости Карнуа и окрашивали гематоксилинэозином.
С целью выявления образования амилоидных отложений при введении больших доз экзогенного инсулина, использовали кроликов породы Шиншилла, массой 2,5-4 кг, которым вводили препарат Инсулмикс (30/70) в дозах, в 10-15 раз превышающих терапевтические, под контролем введения 10% раствора глюкозы. Инъекции проводились через день, в течение 51 дня. Срезы органов подопытных и контрольных животных, окрашивались 1% раствором Конго красного по методикам, описанным в [48, 66, 177] для выявления возможных патоморфологических изменений, в т.ч. отложений амилоидных масс.
Местнораздражающее действие оценивали по местной реакции в участках парентерального введения лекарственных форм (кожа, подкожная клетчатка) и по реакции на инстилляцию препаратов в конъюнктиву глаз кроликов.
Исследование специфических видов токсичности проводили по оценке аллергенных и иммунотропных свойств исследуемых препаратов.
Аллергизирующее действие определяли по способности препаратов инсулина вызывать анафилактический шок, реакцию ГЗТ и по методу РДТК.
Оценка анафилактогенной активности была проведена в реакции общей анафилаксии характеризующейся немедленной, тяжелой и системной аллергической реакцией, вызванной дегрануляцией тучных клеток с выбросом биологически активных медиаторов. Исследования проводили на морских свинках, самцах массой 450-500 г, которым вводили исследуемые препараты подкожно в эффективной терапевтической дозе 0,4 ME на животное и в дозе в десять раз превышающей терапевтическую — 4,0 ME на животное. Разрешающая доза была равна 15 МЕ/особь всем группам животных, в т.ч. и контрольной. Сенсибилизирующие инъекции сопровождались введением 1 мл 20% раствора глюкозы, а разрешающая - 2 мл 20% раствора глюкозы внутрибрюшинно.
Опыты по определению реакции ГЗТ проводили на нелинейных мышах, массой 18-20 г, которых сенсибилизировали однократно, внутрикожно в основание хвоста. Интенсивность воздействия химических соединений на реакции ГЗТ к и их длительность зависят от сроков формирования и сочетания действия различных субпопуляций Т-супрессоров, подавляющих ГЗТ. Исходя из этого, химические аллергены (исследуемые препараты) вводили в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ). ПАФ препятствует формированию Т-супрессоров. При этом возможно усиление аллергенных свойств даже при введении слабых химических аллергенов
Изучение аплергизирующего и иммунотропного действия
Для патоморфологических исследований от животных, получавших в течение 30 суток указанные выше дозы изучаемого и стандартного препаратов инсулина, а также контроля, были взяты следующие органы: сердце, легкие, печень, почки, надпочечники, ПЖ, селезенка, кожа и подкожная клетчатка. Гистологические срезы фиксировали в жидкости Карнуа и окрашивали гематоксилин-эозином [66].
Макроскопическое изучение материала показало, что внутренние органы белых крыс, получавших испытуемые препараты, по форме и величине, цвету и характеру рисунка органа на разрезе не отличались от органов контрольных животных. Микроскопическое изучение препаратов всех групп показало сохранность гистологического строения внутренних органов.
Сердце. Мышечные волокна имели поперечную исчерченность, равномерно окрашивались эозином, а ядра гематоксилином. Сосуды полнокровны. Строма без признаков воспаления. Признаков дистрофии не обнаружено.
Легкие. Альвеолы имеют обычное гистологическое строение. Состояние стенок бронхов и бронхиол без признаков воспаления, со свободным просветом. Участков эмфиземы и ателектаза не отмечено. Кровеносные сосуды полнокровные.
Печень. Имеет балочное строение. Кровеносные сосуды полнокровные. Печеночные пластинки обычных размеров. Клеточных инфильтратов не обнаружено. Признаков дистрофии не выявлено.
Почки. Строение корковой и мозговой зон не нарушено. Клубочки одинаковых размеров, без признаков атрофии и воспаления, капилляры полнокровные, в просвете капсулы Боумена эритроцитов не обнаружено. Эпителий канальцев проксимальных и дистальных отделов без особенностей, в их просвете не выявлено наличия слущенных клеток и белковых масс. Соединительнотканная строма не отечна и не имеет клеточных инфильтратов. Кровеносные сосуды полнокровны.
Надпочечники. Соединительнотканная капсула без признаков воспаления. Клубочковая зона представлена адренокортикоцитами, образующими округлые сплетения. Пучковая зона состоит из клеток, ориентированных вдоль эпителиального тяжа. Мозговая часть надпочечника представлена скоплением крупных округлой формы клеток, расположенных между кровеносными сосудами.
Поджелудочная железа. Отмечается обычное строение железы. Островки Лангерганса округлой и овальной формы. Выводные протоки имеют обычное гистологическое строение. Признаков воспаления не обнаружено. Кровеносные сосуды полнокровные.
Селезенка. Лимфатические фолликулы обычных размеров, их клеточный состав не отличается от контроля. Красная пульпа представлена в основном эритроцитами и другими клеточными элементами крови. Венозные синусы полнокровные. Состояние капсул и трабекул, центральной артерии без особенностей. Признаков фиброза не обнаружено.
Кожа и подкожная клетчатка. Отмечается сохранность структуры кожи. Отека, лейкоцитарной инфильтрации, а также сосудистых расстройств дермы и подкожной клетчатки не отмечено.
Таким образом, введение испытуемых препаратов инсулина белым крысам в различных дозах не вызывает нарушения гистологического строения внутренних органов и развития воспалительных и дистрофических процессов. Это позволяет сделать вывод, что длительное подкожное введение препаратов инсулина человека в дозах, значительно превышающих терапевтические, не вызывает патоморфологические изменения во внутренних органах белых крыс.
Подводя итог, можно заключить, что длительное (в течение 30 дней) введение препаратов Инсулмикс (30/70), как и препарата Микстард 30 НМ в дозах, значительно превышающих терапевтические, не вызывает сколько-нибудь существенных токсических изменений у экспериментальных животных.
Выявление образования амилоидных отложений вследствие больших доз экзогенно-вводимого инсулина осуществляли с помощью подкожного введения препарата Инсулмикс (30/70) кроликам породы Шиншилла, весом 2,5-4 кг в течение 51 дня.
Доза препарата была выбрана с учетом приблизительных доз инсулина, применяемых в психиатрической практике (от 4 ME), а также исходя из минимальных смертельных доз его у человека (от 400 до 980 ME и более) [50]. С целью предотвращения гипогликемической комы одномоментно с инъекцией инсулина вводился 10% раствор глюкозы, подкожно, в дозе 5 мл/кг.
Исследуемые кролики (12 особей) были разбиты на 2 группы — опытная (6 особей) и контрольная (6 особей). Кролики из опытной группы были разделены на 3 подгруппы (по 2 особи), каждая из которых получала определенные, возрастающие дозы инсулина (табл. 14). Контрольной группе животных вводили физиологический раствор, подкожно, в объеме 20 мл. Наблюдение за состоянием животных проводили в течение 3-х часов после инъекций.
