Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Применение методов криоконсервации эмбрионов и их исходы в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы). 11
1.1 Методы криоконсервации эмбрионов 11
1.2 Рецептивность эндометрия 24
1.3 Селективный перенос одного эмбриона 28
1.4 Акушерские и перинатальные исходы 31
Глава 2. Материал и методы исследования 40
2.1 Формирование исследуемых групп 40
2.2 Клиническая характеристика пациенток исследуемых групп 42
2.3 Методы исследования 47
2.3.1 Клинико-анамнестический 47
2.3.2 Микроскопический 48
2.3.3 Статистические методы анализа результатов исследования 50
2.4 Методы лечения 51
Глава 3. Результаты собственных исследований 57
3.1 Сравнение исследуемых групп 57
3.2 Оценка эффективности программ криоконсервации 57
3.3 Применение селективного переноса эмбриона в протоколах криоконсервации 63
3.4 Анализ результатов применения различных методов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов 67
3.5 Оценка акушерских и перинатальных исходов в программах ВРТ с использованием методов криоконсервации 71
3.6 Заключение 94
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 97
Выводы 117
Практические рекомендации 119
Список сокращений 120
Список литературы
- Рецептивность эндометрия
- Акушерские и перинатальные исходы
- Клинико-анамнестический
- Анализ результатов применения различных методов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов
Рецептивность эндометрия
Успешность процесса витрификации зависит от таких факторов, как скорость охлаждения, вязкость среды с эмбрионами, объем замораживаемого образца. Высокая скорость охлаждения достигается при помощи жидкого азота. При погружении замораживаемого образца в жидкий азот скорость охлаждения колеблется от сотен до десятков тысяч градусов Цельсия в минуту. Вязкость среды определяется концентрацией и поведением различных криопротекторов и других добавок в процессе витрификации. Чем выше концентрация криопротекторов, тем выше температура стеклования, что в свою очередь снижает вероятность кристаллообразования. Токсичность и осмотический эффект криопротекторов ограничивают повышение их концентрации. Различные криопротекторы обладают различной токсичностью, проницаемостью и температурой витрификации. Как правило, применяют комбинацию различных криопротекторов с целью повышения вязкости, температуры стеклования и снижения токсичности. Кроме того, Vanderzwalmen P. et al. в 2010 году установили, что при проведении витрификации внутриклеточная концентрация криопротекторов ниже, чем при медленном замораживании [147].
Меньшие объёмы замораживаемого образца обеспечивают лучшую теплопередачу, тем самым повышая скорость охлаждения. Прорыв в области витрификации был связан с внедрением различных технологий (Cryotop, Cryoloop, Cryotip, Cryo-E, Rapid-i и т. д.), позволивших уменьшить объем, что позволило снизить концентрацию криопротекторов и значительно повысить эффективность метода [26, 77, 104, 135]. Все эти технологии можно разделить на две категории - открытые и закрытые. При использовании открытых методик прямой контакт замораживаемого образца с жидким азотом обеспечивает более высокую скорость охлаждения. Так же высокая скорость оттаивания достигается за счет прямого воздействия согревающего раствора. Но при этом существует возможный риск вирусной и микробной контаминации [15]. Однако по данным Cobo A. et al., при исследовании образцов жидкого азота, оставшихся после проведения программ ВРТ с использованием криоконсервированных эмбрионов у пациенток с хроническим вирусным гепатитом С, В или ВИЧ инфицированных пациенток, последовательностей вирусных ДНК или РНК методом полимеразной цепной реакции обнаружено не было [146].
При сравнении эффективности закрытой системы Cryotip и открытой Cryotop Kuwayama М. et al. в 2005 году достоверного различия не получили. Выживаемость бластоцист составила 93,0% и 97,0%, частота наступления беременности - 51,0% и 59,0%, а частота родов - 48,0% и 51,0% соответственно [31]. Схожие результаты были получены Hashimoto et al. в 2013 году [8]. Напротив, в исследовании, проведенном Valbuena D. et al., выживаемость верифицированных бластомеров эмбриона человека была достоверно выше в группе, в которой применяли Cryotip (53,8%), по сравнению с группой, в которой использовали открытую систему Cryotop (22,8%) [30]. По данным, опубликованным Panagiotidis Y. et al. в 2013 году, выживаемость бластоцист (84,1% и 82,1%), частота наступления клинической беременности (45,9% и 42,4%), частота имплантации (25,6% и 24,5%), частота родов (41,2% и 41,0%) достоверно не различались при сравнении открытых и закрытых систем [92]. AbdelHafez et al. в 2011 году при сравнении выживаемости эмбрионов мыши и наличия признаков повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) после витрификации с применением открытой системы Cryoloop и закрытых систем Cryotip и HSV straw достоверного различия не получили. При этом общее количество клеток, обнаруживающих повреждение ДНК, было выше после размораживания эмбрионов на стадии бластоцисты по сравнению с эмбрионами, криоконсервированными на стадии дробления [149]. Таким образом, по всей видимости, для витрификации эмбрионов могут быть использованы асептичные закрытые устройства, позволяющие устранить риск контаминации и достичь эффективности, не уступающей закрытым технологиям.
В настоящее время лидирующая роль по совершенствованию метода витрификации и исследованию в области криоконсервации принадлежит японскому ученому Kuwayama М. Длительность хранения эмбрионов не влияет на их качество. В исследовании, проведенном Riggs R. et al. в 2010 году, хранение эмбрионов в течение двадцати лет не оказывало влияния на такие параметры, как выживаемость после оттаивания, частота имплантации, частота наступления беременности, количество прерываний беременности и родов [40]. По данным Wirleitner В. et al., опубликованным в 2012 году, частота наступления беременности и частота родов достоверно не различалась после переноса витрифицированных эмбрионов, хранившихся в течение 1, 2, 3, 4, 5 и 6 лет. В среднем эти показатели составили 43,6% и 29,0%, соответственно [87].
В ряде исследований было показано, что количество интактных бластомеров является важным прогностическим фактором наступления беременности после переноса размороженных эмбрионов [133, 145].
Несмотря на значительные успехи в области криоконсервации эмбрионов, до сих пор нет единого мнения относительно стадии развития эмбрионов, наиболее оптимальной для криоконсервации.
В некоторых странах, в частности в Германии, криоконсервация эмбрионов после пронуклеарной стадии запрещена по этическим соображениям. В лабораториях других стран криоконсервацию проводят на 2 и 3 дни развития эмбрионов. В последнее время в связи с улучшением методов культивирования предпочтение отдается более продвинутой стадии развития эмбрионов - стадии бластоцисты [2].
Акушерские и перинатальные исходы
Для криоконсервации эмбрионов методом медленного замораживания применяли набор для замораживания Blast Freeze Medicult. Бластоцисты переносили в чашку, содержащую раствор для замораживания из виалы 1, и помещали чашку в условия СОг на 10 минут. Затем бластоцисты переносили в раствор 2 в СОг инкубатор на 10 минут. После чего помещали бластоцисты в маркированную стразу, используя в качестве среды для заполнения раствор из виалы 2. Запечатывали отверстие в соломинке, предотвращая проникновение жидкого азота внутрь стразы. Затем помещали соломинки в замораживающее устройство (Planer, Cryologic) и начинали программу замораживания. Охлаждали от комнатной температуры до минус 6С с интервалом 2С. Проводили сидинг вручную при температуре минус 6С. Охлаждали от минус 6С до минус 40С с интервалом 0,3С в минуту. Затем охлаждали от минус 40С до минус 150С с интервалом 35С в минуту. После чего переносили соломинки в коробку с жидким азотом и помещали их в криотубы с азотом, затем в маркированный холдер. Переносили холдер в жидкий азот и хранили при минус 196С.
Для размораживании эмбрионов, криоконсервированных методом медленного замораживания, использовали набор для размораживания BlastThaw, Medicult. Стразу вынимали из жидкого азота и держали при комнатной температуре в течение 10-15 секунд, затем держали стразу в руках до полного оттаивания. Содержимое стразы выдували в чашку Петри, перемещали в лунку, содержащую раствор для размораживания 1, уравновешенный до комнатной температуры и культивировали в течение 10 минут. Затем перемещали бластоцисты в лунку, содержащую раствор для размораживания 2, и культивировали 10 минут при комнатной температуре. После размораживания бластоцисты помещали в среду Blast Assist System Medium 2 и тщательно промывали. После промывания помещали бластоцисты в свежую среду Blast Assist System Medium 2 и оставляли в инкубаторе в условиях С02 до переноса.
Криоконсервацию эмбрионов методом витрификации проводили при комнатной температуре с использованием набора Kitazato Cryotop Safety Kit Vitrification #VT401. Методика витрификации эмбрионов состояла в следующем. Аспирированную из культуральной среды бластоцисту на кончике пипетки в минимальном объеме переносили в лунку чашки Nunc, содержащую 300 мкл раствора ES, и инкубировали в течение 15 минут. Затем в минимальном объеме ES переносили бластоцисту в лунку, содержащую 300 мкл раствора VS, и инкубировали в течение 1 минуты. В процессе инкубации бластоцисту трижды переносили на новый участок лунки, сопровождая перенос помешиванием вокруг бластоцисты кончиком пинцета. После чего бластоцисту переносили в лунку, содержащую 300 мкл раствора VS, и инкубировали в течение 30 секунд. В процессе инкубации бластоцисту дважды переносили на новый участок лунки, сопровождая перенос помешиванием вокруг бластоцисты кончиком пинцета. В минимальном объеме среды переносили бластоцисту на кончик Cryotop. Кончиком пипетки отбирали излишки среды. Затем быстро опускали конец Cryotop в верификационный контейнер с жидким азотом и под слоем жидкого азота пинцетом надевали защитный чехол на Cryotop.
Размораживание криоконсервированных эмбрионов проводили при комнатной температуре с использованием набора Kitazato Cryotop Safety Kit Thawing #VT402. Предварительно за полтора часа до начала размораживания виолу со средой TS и чашку Петри 35 мм помещали в инкубатор на 37С. Остальные среды для размораживания инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Для проведения процедуры размораживания под жидким азотом пинцетом снимали с Cryotop защитный чехол. За минимальное время доставали Cryotop и опускали его конец в чашку Петри, содержащую раствор TS. Инкубировали бластоцисту в TS 1 минуту. Затем аспирировали капилляром бластоцисту в некотором количестве среды TS, помещали на дно лунки, содержащей раствор DS, и инкубировали 3 минуты. После чего аспирировали капилляром бластоцисту и некоторое количество раствора DS, переносили на дно лунки, содержащей раствор WS1, и инкубировали в течение 5 минут. Затем аспирировали капилляром только бластоцисту и переносили ее в лунку, содержащую раствор WS 2, на поверхность раствора. После опускания бластоцисты на дно несколько раз повторяли процедуру. Инкубация в растворе WS 2 составляла 1 минуту. Затем бластоцисты переносили в подготовленную и уравновешенную в инкубаторе чашку со средой Blast Assist System Medium-2, Medicult.
После размораживания эмбрионов проводили вспомогательный хэтчинг при помощи лазерного аппарата Saturn laser. Длина волны лазера составляла 650 нм. Выживаемость эмбрионов оценивали при наличии 50% и более интактных бластомеров. Размороженные эмбрионы переносили в полость матки. Количество перенесенных эмбрионов не превышало 2. Перенос эмбрионов осуществляли под контролем УЗИ с помощью катетера для переноса эмбрионов Wallace.
Для подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов применяли режим подготовительной гормональной терапии и перенос эмбрионов в модифицированном натуральном цикле.
В качестве подготовительной гормональной терапии использовали препарат эстрадиола со 2-3 дня менструального цикла: Прогинова 2 мг 3 раза в день или Эстрофем 2 мг 3 раза в день или Дивигель 1 г 3 раза в день, а также комбинации препаратов. При достижении толщины эндометрия 8 мм и более по данным УЗИ к указанной терапии добавляли препарат прогестерона: Утрожестан 200 мг 3 раза в день интравагинально или гель Крайнон 8% - 90 мг по 1 аппликатору 1 раз в день интравагинально. На 5 день после назначения препарата прогестерона проводили перенос размороженных эмбрионов.
Методика переноса эмбрионов в модифицированном натуральном цикле состояла в следующем. Пациенткам проводили фолликулометрию на 8-9 день менструального цикла. При наличии доминантного фолликула выполняли УЗ мониторинг. При достижении по данным УЗИ размера доминантного фолликула 19-20 мм назначали "овуляторную" дозу ХГЧ (Прегнил, Овитрель). Со следующего дня после наступления овуляции назначали терапию препаратом эстрадиола (Прогинова 2 мг 2 раза в день или Дивигель 1 г 2 раза в день) совместно с препаратом прогестерона (Утрожестан 200 мг 3 раза в день интравагинально или гель Крайнон 8% - 90 мг по 1 аппликатору 1 раз в день интравагинально). Перенос размороженных эмбрионов проводили на 5 день от начала указанной терапии. После переноса эмбрионов продолжали поддерживающую терапию, включающую перечисленные препараты прогестерона и эстрадиола. Для диагностики наступления беременности определяли концентрацию Р-субъединицы ХГЧ на 14 день после ПЭ и выполняли УЗИ матки на 23-25 день после ПЭ. Факт наступления клинической беременности определяли при наличии в полости матки плодного яйца. В случае отсутствия беременности препараты отменяли. При установлении беременности прием препаратов прогестерона и эстрадиола продолжали. Дозы и длительность приема препаратов устанавливали в зависимости от особенностей течения беременности, данных акушерско-гинекологического анамнеза.
Клинико-анамнестический
Приводимые в главе 3 результаты указывают на то, что витрификация является более эффективным методом криоконсервации эмбрионов по сравнению с методом медленного замораживания.
Данное положение подтверждается более высоким показателем выживаемости верифицированных эмбрионов по сравнению с размороженными эмбрионами, криоконсервированными методом медленного замораживания. Согласно нашим наблюдениям, применение метода витрификации кроме того позволяет улучшить клинические результаты. Так, частота наступления беременности после переноса витрифицированных эмбрионов возросла в 1,5 раза по сравнению с результатами, полученными при использовании метода медленного замораживания. Также удалось повысить такие показатели эффективности программ ВРТ, как частота родов и "take home baby rate".
Применение метода витрификации эмбрионов способствовало не только улучшению исходов по сравнению с методом медленного замораживания, но и позволило получить результаты, не уступающие программам ВРТ с использованием нативных эмбрионов. Частота наступления беременности, частота родов, показатель "take home baby rate" по нашим данным не различались после переноса верифицированных и нативных эмбрионов.
Высокая эффективность метода витрификации позволила выполнить повторную криоконсервацию эмбрионов и селективный перенос одного эмбриона. Обнадеживающие результаты применения на небольшом количестве наблюдений перечисленных методик в программах ВРТ с использование криоконсервированных эмбрионов в дальнейшем позволят более широко использовать их в клинической практике для снижения частоты наступления многоплодной беременности, тем самым повышая безопасность данных программ.
Согласно нашим данным, различные методы подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов, а именно назначение подготовительной гормональной терапии и перенос эмбрионов в модифицированном натуральном цикле, не оказывают существенного влияния на эффективность программ криоконсервации. После переноса витрифицированных эмбрионов и при применении эмбрионов, криконсервированных методом медленного замораживания, такие показатели, как частота наступления беременности, частота родов и "take home baby rate" при различных методах подготовки эндометрия достоверно не различались. Однако все же перенос размороженных эмбрионов в МНЦ позволил несколько повысить такие важные показатели, как частота родов и количество детей, выписанных домой. Также следует заметить, что при переносе размороженных эмбрионов в модифицированном натуральном цикле, в отличие от режима ГИТ, отсутствует необходимость в приеме гормональных препаратов до назначения триггера овуляции. В связи с чем, модифицированный натуральный цикл является методом выбора для пациенток с сохраненным овуляторным циклом.
Наибольшая толщина эндометрия в нашем исследовании была получена при проведении КОС. При этом пациентки, у которых была получена беременность, имели большую толщину эндометрия по сравнению с пациентками с отрицательным результатом переноса эмбрионов.
Согласно нашим наблюдениям, методы криоконсервации эмбрионов, а также режим подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов не оказывает влияния на развитие осложнений течения беременности и родов. После переноса размороженных эмбрионов, криконсервированных методом витрификации и методом медленного замораживания, в МНЦ и при назначении ПГТ выявленные осложнения беременности и родов существенно не различались по виду и частоте развития от нативных циклов.
По нашим данным, дети из двоен, рожденные после переноса размороженных эмбрионов имеют большую массу и длину тела по сравнению с новорожденными, полученными при использовании нативных эмбрионов. Также перенос нативных эмбрионов привел к рождению большего количество детей с низкой и экстремально низкой массой тела в сравнении с протоколами с использованием криконсервированных эмбрионов. Однако при учете срока родоразрешения (срочные и преждевременные роды) различий по массе и длине тела новорожденных получено не было как в случае одноплодной беременности, так и в случае двоен. На другие параметры, проанализированные в нашей работе для оценки перинатальных исходов, включающие частоту преждевременных родов, оперативного родоразрешения, оценки по шкале Апгар на 1 и 5 минутах, перинатальную смертность, частоту развития ВПР, влияния применения методов криоконсервации эмбрионов при сравнении с нативными циклами выявлено не было. Различные режимы подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов достоверного влияния на перечисленные параметры также не оказывали.
Анализ результатов применения различных методов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов
Частота наступления беременности после переноса верифицированных эмбрионов в нашем исследовании (47,5%) сопоставима с результатами, опубликованными в последние несколько лет авторами Mesut N. et al. (51,1%), Cobo A. et al. (45,5%) [35, 96]. Схожие с полученными в нашем исследовании данными по частоте наступления беременности после применения метода медленного замораживания (29,8%) были получены Kuc P. et al. (25,9%) в 2010 году [156].
Применение метода витрификации в нашем исследовании позволило достичь частоты наступления беременности (47,5%), достоверно не различающейся с аналогичным показателем, установленным после переноса нативных эмбрионов (53,0%). Полученные результаты имеют важное практическое значение. В случае развития в процессе КОС синдрома гиперстимуляции яичников или возникновения ситуаций, препятствующих переносу нативных эмбрионов, криоконсервация методом витрификации полученных эмбрионов с последующим переносом размороженных может являться альтернативной методикой, не снижающей результативность программ ВРТ.
Схожие с нашими результаты были получены в исследовании, проведенном Ku P. et al. в 2012 году [32]. Частота наступления беременности после переноса нативных и размороженных эмбрионов, криоконсервированных методом витрификации, достоверно не различалась и составила 66,1% и 59,3% соответственно. Авторы Zhu D. et al., Tong G. et al. в недавних исследованиях получили частоту наступления беременности после переноса верифицированных эмбрионов достоверно превышающую аналогичный показатель, полученный после переноса нативных эмбрионов [24, 157].
Высокая эффективность метода витрификации позволила применить повторную криоконсервацию эмбрионов. В нашем исследовании перенос повторно криоконсервированных эмбрионов был проведен лишь в трех случаях.
В связи с этим, высокие показатели выживаемости эмбрионов (100%) и частоты наступления клинической беременности (66,7%) требуют дальнейшей верификации на большей группе исследования.
Исследования, посвященные применению повторно криоконсервированных эмбрионов, немногочисленны. По данным Stanger A.J. et al., общая выживаемость эмбрионов, витрифицированных на стадии зиготы, 3 дня развития и стадии бластоцисты, ранее подвергшихся криоконсервации методом медленного замораживания или методом витрификации, составила 96,8% [152]. Kang М. et al. не получили достоверного различия по частоте наступления клинической беременности после переноса однократно и повторно витрифицированных эмбрионов 5 дня развития (35,3% и 34% соответственно) [29]. Таким образом, на основе перечисленных данных можно заключить, что повторная витрификация эмбрионов не оказывает негативного влияния на выживаемость и клинические результаты протоколов криоконсервации. Однако необходимы дальнейшие исследования в этой области.
Многоплодная беременность относится к беременности высокого риска в связи с многократным повышением частоты развития осложнений со стороны матери и со стороны плода. По данным разных авторов частота наступления многоплодной беременности в программах ВРТ находится в пределах 18-44,8% [17, 24, 32, 112-118, 142]. Селективный перенос одного эмбриона является эффективным методом, позволяющим снизить частоту наступления многоплодных беременностей. В таких странах, как Швеция, Финляндия, Бельгия доля селективного переноса одного эмбриона в программах ВРТ превышает 50%.
В нашем исследовании частота наступления беременности после селективного переноса одного эмбриона достоверно не различалась с аналогичным показателем, полученным после переноса двух эмбрионов как в контрольной группе, в которой применяли нативные эмбрионы (46,1% и 55,2%), так и в I группе, в которой применяли размороженные эмбрионы, криоконсервированные методом витрификации (55,6% и 50,0%). Во II группе, в которой проводили перенос размороженных эмбрионов, криоконсервированных методом медленного замораживания, частота наступления беременности после селективного переноса одного эмбриона оказалась несколько выше по сравнению с результатами переноса двух эмбрионов (50,0% и 28,3%). Во всех группах, включая контрольную, селективный перенос одного эмбриона позволил достоверно снизить количество полученных многоплодных беременностей. Указанный показатель в контрольной группе составил 16,7%, в I и II группах многоплодные беременности получены не были. Относительно высокий показатель частоты наступления многоплодной беременности в контрольной группе связан с малым числом наблюдений.
Данные литературы, посвященные сравнению результатов селективного переноса одного эмбриона и двух эмбрионов, несколько противоречивы. Le Lannou D. et al., Gelbaya T.A. et al, а также рядом других авторов было установлено, что селективный перенос одного эмбриона приводит к снижению частоты наступления беременности по сравнению с результатами переноса двух эмбрионов [34, 64]. Однако кумулятивная частота наступления беременности достоверно не различалась с аналогичным показателем, полученным после переноса двух эмбрионов. Напротив, по данным, опубликованным Gardner D.K. et al. и Criniti A. et al., достоверного различия по частоте наступления беременности после селективного переноса одного эмбриона и переноса двух эмбрионов получено не было [46, 121]. При этом, по мнению всех авторов, селективный перенос одного эмбриона позволил достоверно снизить частоту многоплодных беременностей.
