Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Механизмы свободнорадикального окисления 12
1.2. Механизм свободнорадикального окисления белков 17
1.3. Антиоксидантная система организма 22
1.4. Стресс и реакции свободнорадикального окисления 23
1.4.1. Общее понятие стресса 23
1.4.2. Стресс, изменение биохимических показателей и их связь с балансом про- и антиоксидантных систем организма 25
1.5. Возможности ингибирования реакций свободнорадикального окисления антиоксидантами 29
1.6. Основные характеристики производных пиридина с точки зрения антиоксидантных свойств 31
1.6.1. Характеристика пиридина 31
1.6.2. Характеристика производных 3-оксипиридина 32
1.6.3. Связь химической структуры производных 3-оксипиридина и их биологической активности 32
1.7. Лекарственные препараты - производные 3-оксипиридина 35
1.8. Клиническое применение препаратов 2-этил-6-метил-3-оксипиридина 38
1.9. Новые производные 3-оксипиридина 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 44
2.1. Основные этапы исследований 44
2.2. Схема эксперимента 47
2.3. Характеристика исследуемых соединений 48
2.4. Характеристика доз и пути введения исследуемых производных 3-оксипиридина 50
2.5. Моделирование острого иммобилизационного стресса 51
2.6. Характеристика методов исследования 52
2.6.1. Методы изучения общетоксического действия 52
2.6.1.1. Метод изучения острой токсичности 5 2
2.6.1.2. Метод изучения общетоксического действия производных 3-оксипиридина в дозах 1% и 10% от LD50 на фоне иммобилизационного стресса 53
2.6.2. Метод определения интенсивности окислительной модификации белков 54
2.6.3. Метод определения содержания общего белка 56
2.6.4. Метод определения концентрации глюкозы в крови 56
2.6.5. Метод определения концентрации триглицеридов 57
2.6.6. Метод определения концентрации общего холестерина 58
2.6.7. Метод определения концентрации холестерина липопротеинов высокой и низкой плотности 58
2.6.8. Метод определения концентрации билирубина 59
2.6.9. Метод определения активности аланин аминотрансферазы 60
2.6.10. Метод определения активности аспартат аминотрансферазы 60
2.6.11. Методы статистической обработки полученных результатов 61
ГЛАВА 3. Исследование общетоксического действия новых производных 3-гидроксипиридина 62
3.1. Изучение острой токсичности производных 3 -гидроксипиридина 62
3.2. Изучение общетоксического действия производных 3-гидроксипиридина в дозах 1% и 10% от LD5o на фоне иммобилизационного стресса 70
ГЛАВА 4. Исследование показателей свободнора-дикального окисления белков и некоторых мета болических показателей при введении новых производных 3-гидроксипиридина в условиях иммобилизации 82
4.1. Исследование показателей свободнорадикального окисления белков 82
4.1.1. Исследование интенсивности окислительной модификации белков в условиях иммобилизационного стресса 82
4.1.2. Исследование интенсивности окислительной модификации белков при введении 3-оксипиридина оксалата в условиях иммобилизационного стресса 84
4.1.3. Исследование интенсивности окислительной модификации белков при введении 3-оксипиридина малоната в условиях иммобилизационного стресса 86
4.1.4. Исследование интенсивности окислительной модификации белков при введении 3-оксипиридина адипината в условиях иммобилизационного стресса 89
4.1.5. Исследование интенсивности окислительной модификации белков при введении 3-оксипиридина малеата в условиях иммобилизационного стресса 91
4.1.6. Исследование интенсивности окислительной модификации .белков при введении 3-оксипиридина гемисукцината в условиях иммобилизационного стресса 93
4.2. Исследование метаболических показателей 96
4.2.1. Исследование метаболических показателей в условиях иммобилизационного стресса 96
4.2.2. Исследование метаболических показателей при введении 3-оксипиридина оксалата в условиях иммобилизационного стресса 99
4.2.3. Исследование метаболических показателей при введении 3-оксипиридина малоната в условиях иммобилизационного стресса 103
4.2.4. Исследование метаболических показателей при введении 3-оксипиридина адипината в условиях иммобилизационного стресса 106
4.2.5. Исследование метаболических показателей при введении 3-оксипиридина малеата в условиях иммобилизационного стресса 110
4.2.6. Исследование метаболических показателей при введении 3-оксипиридина гемисукцината в условиях иммобилизационного стресса 114
Обсуждение результатов исследования 119
Выводы 136
Практические рекомендации 138
Библиографический список 139
- Стресс, изменение биохимических показателей и их связь с балансом про- и антиоксидантных систем организма
- Метод определения интенсивности окислительной модификации белков
- Изучение общетоксического действия производных 3-гидроксипиридина в дозах 1% и 10% от LD5o на фоне иммобилизационного стресса
- Исследование интенсивности окислительной модификации белков при введении 3-оксипиридина малоната в условиях иммобилизационного стресса
Введение к работе
Организм существует в аэробных условиях, и кислород является одним из активных соединений в тканях. Основной путь метаболизма кислорода сопряжен с его восстановлением по 4-х электронному пути с образованием воды и генерацией энергии. Также в клетках протекают окислительные реакции, в процессе которых атомы кислорода включаются в органические молекулы с образованием реакционно-способных соединений (Дубинина Е.Е., 2006).
Свободные радикалы образуются в организме в результате метаболизма растворенного в тканях кислорода, и образующиеся при этом его активные формы вызывают окисление мембранных липидов, белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 2005; Чеснокова Н.П. с со-авт., 2007).
Процесс свободнорадикального окисления белков, также как и процесс окисления липидов носит цепной характер. В реакциях переходных металлов с гемсодержащими белками продуцируются активные кислородные метаболиты (АКМ): 02-, Н02, Н9О2, -ОН, инициирующие цепной процесс с участием гемо-вого фрагмента белка. Воздействие активных форм кислорода (АФК) на белки приводит к нарушению их структуры, сшивке или дефрагментации, что инак-тивирует рецепторы и ферменты (Барабой В.А., Брехман И.И., 1992; Чеснокова Н.П. с соавт., 2007). Окислительная модификация под действием АФК затрагивает около 240 различных ферментов (Карли Ф., 1997; Ляхович В.В., Вавилин В.А., Зенков В.К., 2005; Чеснокова Н.П. с соавт., 2007). Таким образом, выраженные процессы перекисного окисления белков могут сопровождаться дестабилизацией как структурных, так и функциональных свойств организма в целом.
При окислительном стрессе патогенетически обоснованным является применение средств фармакологической коррекции процессов свободнорадикального окисления - экзогенных антиоксидантов. В последние годы в меди-
8 цинской практике широкое использование для профилактики и Лечения различных патологических состояний получили препараты-антиоксиданты мекси-дол и эмоксипин (Дюмаев К.М. с соавт., 1995; Машковский М.Д., 2000). Эмок-сипин (3-окси-6-метил-2-этилпиридина хлорид) и мексидол (3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат) являются производными одного вещества - 3-гидроксипиридина (3-ОП), различающимися только кислотой в составе соли. Однако кислоты обусловливают различия в фармакологических свойствах данных препаратов, например, различия в антигипоксической активности (Лукьянова Л.Д., 1999). Представляется логичным поиск новых лекарственных средств среди других солей 3-гидроксипиридина.
Для оценки специфической антиоксидантной активности потенциальных лекарственных средств важным и необходимым является использование моделей окислительного стресса. Наиболее часто применяют модель иммобилизации животных, так как даже кратковременная иммобилизация (экспозиция, начиная с 30 минут) способна вызвать снижение ресурсов организма и возникновение выраженного окислительного стресса (Рудько Н.П., Давыдов В.В., 2001; Агаева Р.К., Фастова И.А., 2003; Кравцов В.И. с соавт., 2006; Герасимова Н.Г., Балашов В.П., Кругляков П.П., 2007).
В работе были использованы новые соединения 3-гидроксипиридина (3-ОП оксалат, 3-ОП малонат, 3-ОП адипинат, 3-ОП малеат, 3-ОП гемисукцинат), синтезированные в Институте биохимической физики имени Н. М. Эмануэля РАН и ГУ НИИ Фармакологии РАМН.
Цель исследования. Изучение общетоксического и антиоксидантного действия на процесс свободнорадикального окисления белков, а также влияния на некоторые метаболические показатели новых производных 3-гидроксипиридина (3-ОП оксалата, 3-ОП малоната, 3-ОП адипината, 3-ОП ма-леата, 3-ОП гемисукцината) в эксперименте.
В соответствии с поставленной целью решались следующие
задачи:
Исследовать общетоксическое действие (летальность, поведение, масса крыс и их внутренних органов) и определить условные эффективные дозы (1% и 10% от LD5o) при иммобилизации и введении 3-ОП оксалата, 3-ОП малоната, 3-ОП адипината, 3-ОП малеата, 3-ОП гемисукцината.
Изучить показатели свободнорадикального окисления белков и некоторые метаболические показатели в сыворотке крови экспериментальных животных в условиях иммобилизационного стресса.
Исследовать показатели перекисного окисления белков в сыворотке крови экспериментальных животных при введении 3-ОП оксалата, 3-ОП малоната, 3-ОП адипината, 3-ОП малеата, 3-ОП гемисукцината на фоне иммобилизационного стресса.
Изучить некоторые метаболические показатели при введении 3-ОП оксалата, 3-ОП малоната, 3-ОП адипината, 3-ОП малеата, 3-ОП гемисукцината на фоне иммобилизационного стресса.
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование показателей перекисного окисления белков в условиях иммобилизационного стресса. Установлено, что через 12 часов иммобилизации увеличивается интенсивность окислительной модификации белков в сыворотке крови экспериментальных животных.
Изучено содержание различных продуктов свободнорадикального окисления белков (алифатических альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера) в сыворотке крови экспериментальных животных при введении 3-ОП оксалата, 3-ОП малоната, 3-ОП адипината, 3-ОП малеата и 3-ОП гемисукцината в дозах 1% и 10% от LD5o на фоне иммобилизационного стресса. Выявлено, что наиболее выраженное антиоксидантное действие в отношении процесса перекисного окисления белков оказывают 3-ОП оксалат и 3-ОП адипинат в дозах 1% от LD5o, а также 3-ОП гемисукцинат в дозе 10%otLD,0.
Исследованы различные метаболические показатели в сыворотке крови экспериментальных животных при введении новых производных 3-ОП в дозах 1 % и 10% от LD50 на фоне иммобилизационного стресса. Доказано, что для каждого соединения характерен определенный спектр метаболических показателей, изменяющихся под его влиянием, который различается при введении изучаемых производных 3-ОП в условной минимальной и максимальной эффективной дозах.
Практическая ценность работы состоит в том, что полученные данные расширяют представления о спектре фармакологического действия производных 3-гидроксипиридина (3-ОП оксалата, 3-ОП малоната, 3-ОП адипината, 3-ОП малеата, 3-ОП гемисукцината) и являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего изучения их в качестве перспективной группы для создания лекарственных средств с антиоксидантной активностью.
Основные положения, выносимые на защиту:
12-часовая иммобилизация экспериментальных животных приводит к повышению в сыворотке крови экспериментальных животных интенсивности окислительной модификации белков, а также уровней общего и непрямого билирубина.
Большинство из изученных производных 3-ОП проявляет различной степени выраженности антиоксидантную активность. Наиболее выраженное антиоксидантное действие в отношении процесса перекисного окисления белков оказывают 3-ОП оксалат и 3-ОП адипинат в дозах 1% от LD50, а также 3-ОП гемисукцинат в дозе 10% от LD50.
Спектр изменяемых метаболических показателей и выраженность этих изменений зависят от особенностей химического строения, а также дозы исследуемых соединений.
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на XX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова «Нейрофизиология», Москва, 2007 год; V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и ал-
лергии, V Европейском конгрессе по астме «Аллергология и иммунология», Москва, 2007 год; III съезде фармакологов России «Фармакология практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007 год.
Публикации. По теме диссертации имеется 6 публикаций, в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка. Работа изложена на 171 страницах текста компьютерного набора, иллюстрирована 18 рисунками, 29 таблицами, 1 фотографией. Библиографический список содержит 307 названий работ, из них 163 отечественных и 144 зарубежных автора.
Стресс, изменение биохимических показателей и их связь с балансом про- и антиоксидантных систем организма
В рамках развития общего адаптационного синдрома закономерно регистрируется интенсификация процессов свободнорадикального окисления липи-дов и белков, а чрезмерная стресс-индуцированная активация РСО выступает одним из наиболее важных патогенетических факторов повреждения (Меерсон Ф.З., Пшенникова М. Г., 1988; Вьюшина А.В. с соавт., 2002).
Нарушение так называемого «редокс-статуса» связано с усилением свободнорадикального окисления и/или уменьшением активности антиокси-дантной защиты организма. Этот дисбаланс, в свою очередь, называется окислительным (оксидативным) стрессом (Halliwell В., 1991; Aller М.А. et al, 2008; Basini G. et al., 2008). В соответствии с термином «стресс», предложенным Г. Селье, оксидативный стресс также имеет универсальный характер. Механизмы оксидативного стресса интенсивно изучаются с середины 60-х годов (Селье Г., 1960; Sies Н., Cadenas Е., 1985), и в наше время актуальность и острота этой проблемы не только не снизилась, но и многократно возросла.
В процессе иммобилизации главным фактором, запускающим стрессовую реакцию, является эмоциональный. Даже кратковременная иммобилизация животных (экспозиция, начиная с 30 минут) приводит к развитию оксидативного компонента стресса (Зорькина А.В., Костин Я.В., Инчина В.И., 1998; Рудько Н.П., Давыдов В.В., 2001; Рудько Н.П., 2002; Агаева Р.К., Фастова И.А., 2003).
Кратковременная иммобилизация усиливает процессы перекисного окисления в тканях и клетках. Так, всего 30 минутная иммобилизация на спине у взрослых крыс сопровождалась стимуляцией ПОЛ в печени. Проявлением того служило увеличение в ней в 2,2 раза содержания флюоресцирующих соединений типа Шиффовых оснований, по сравнению с интактными животными. Характерно, что уровень диеновых конъюгатов при этом оставался неизменным (Рудько Н.П., 2002). На модели иммобилизационного стресса (крысы) показано, что стресс существенно усиливает процессы перекисного окисления в мембране эритроцита (Витриченко Е.Е., 1987). На модели эмоционально-болевого стресса - раздражение электрическим током (крысы) продемонстрировано влияние возраста на выраженность оксидативного стресса, скорость перекисного окисления белков и липидов. Наиболее выраженные изменения окислительно-восстановительного баланса были обнаружены у совсем молодых и старых животных. Процессы перекисного окис-ления белков были наиболее выражены в мозговой ткани, легких и миокарде, перекисного окисления липидов - в мозге, печени, легких и миокарде (Нестеров Ю.В. с соавт., 2008). На модели острого эмобилизационного стресса (обезьяны) продемонстрировано, что активность супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы эритроцитов увеличивалась у молодых животных, а у старых и базальная активность этих ферментов была ниже, и после стресса она практически не изменялась (Гончарова Н.Д., Маренин В.Ю., 2008). Катехола-мины, концентрация которых многократно повышается при стрессе, при самоокислении существенно повышают продукцию активных форм кислорода, причем этот эффект не связан с адренореноцепторами. В оригинальном исследовании показана роль катехолзависимого оксидативного стресса в повреждении кардиомиоцитов (Neri М. et al., 2007). Введение норадреналина приводит к значительному увеличению интенсивности процессов реактивного окисления в клетках и плазме крови (Schraml Е. et al., 2007; Bertagnolli М. et al., 2008). Исследования показали, что допамин (синтетический аналог дофамина, который является предшественником адреналина, синтезируется в надпочечниках и его концентрация при стрессе существенно увеличивается) в значительной степени стимулирует перекисное окисление, причем этот эффект усиливается при сочетанном применении с ингибиторами моноаминооксидазы, а де-. фероксамин, хелатор, связывающий ионы железа, полностью предотвращает окислительный эффект допамина (Ben-Shachar D., Zuk R., Glinka Y., 1995). Глю-кокортикоиды несколько увеличивают продукцию (АФК) нейтрофилами, могут вызывать апоптоз (связанный, по-видимому, с усилением перекисного окисления) некоторых клеток, например тимоцитов (Вольский Н. Н. с сравт., 2007). Установлено, что при стрессе, в частности, иммобилизационном происходит динамическое изменение ряда биохимических показателей. Так выделение аце-тилхолина и плазменная концентрация глюкозы первоначально повышались, а затем снижались. Плазменный уровень адреналина и норэпинефрина, первоначально повышаясь, оставался высоким длительное время (Tajima Т. et al., 1996). В условиях стресса, однако, включаются и защитные механизмы, ограничивающие перекисное окисление. На модели иммобилизационного стресса (крысы, экспозиция 24 часа) показано, что перекисное окисление сдерживают гормоны надпочечников, в то время как гормоны щитовидной железы и яичек подобным эффектом не обладают (Ryzhavskii Bla., 1978). Также известно, что адреналин увеличивает активность системы глютатиона в печени (Sies Н., Са-denas Е., 1985), причем для выявления этого эффекта достаточно незначительной физической нагрузки (Laires M.J. et al., 1993). На модели острого желудочного кровотечения (крысы) показано, что адреналин уменьшает кровопотерю и повреждение слизистой не только через сужение сосудов, он также снижает уровень перекисного окисления в слизистой желудка и повышает активность антиоксидантной системы (уровень глютатиона). Кроме того, адреналин увеличивает уровень оксида азота в слизистой желудка. Причем, эти эффекты связаны с а- и р рецепторами слизистой желудка (Hsu D.Z. et al., 2005). Гормоны коры и мозгового слоя надпочечников регулируют уровень окислительно-восстановительного баланса в слизистой желудка при язвенной болезни (Yildirim A. et al., 2007). Глюкокортикоиды оказывают значительное антиоксидантное действие при стрессе. Дексаметазон на модели холестаза у крыс значительно снижает все показатели перекисного окисления- в печени и почках по сравнению с контролем, повышает активность антиокислительных эндогенных систем (Ozturk Н. et al., 2006). В рекомендациях по лечению острых травм спинного мозга (США) рекомендуется использовать высокие дозы (до 30 мг/кг/сут) метилпреднизолона для снижения повреждения, вызванного оксида-тивным стрессом (Kamano S., 2000). У породы мышей, склонных к патологии, напоминающей амиотрофический склероз, введение глюкокортикоидов предотвращает или снижает проявления этой патологии, что связывают с уменьшением продукции активных форм кислорода и азота в клетках мозга (Gonzalez Deniselle М.С., Gonzalez S.L., De Nicola A.F., 2001).
Метод определения интенсивности окислительной модификации белков
Поскольку исследуемые вещества относятся к группе производных 3-оксипиридина, также как и лекарственные препараты эмоксипин и мексидол, обладающие широким спектром фармакологической активности, в первую очередь, антиоксидантными свойствами, в настоящей работе изучались показатели перекисного окисления белков на фоне введения изучаемых соединений.
Для оценки перекисного окисления белков использовался спектрофото-метрический метод определения интенсивности окислительной модификации белков по уровню карбонильных производных в сыворотке крови экспериментальных животных (Дубинина Е.Е. с соавт., 1995).
Определение общего пула окисленных белков по содержанию карбонильных производных является достаточно специфическим тестом, характеризующим уровень окислительной модицикации белков. Свободнорадикальное окисление белков - процесс цепной, в результате которого образуются карбонильные группировки, которые и являются маркером окислительной деструкции белков (Levine R.L. et al., 1990; Levine R.L. et al., 1994; Blakeman D.P. et al., 1995; Denu J.M., Tanner K.G., 1998; Evans P., Lyras L., Halliwell В., 1999).
Принцип метода основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона нейтрального и основного характера, которые регистрируются спектрофотометрически. Продуктами нейтрального характера являются производные нейтральных аминокислот, основного характера — производные основных аминокислот (серии, треонин, тирозин). Меньшим количеством основных аминокислот объясняется низкое содержание продуктов основного характера в исследуемых объектах.
Оптическую плотность образовавшихся 2,4-динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре Apel PD 303 (Япония). Согласно данным литературы, для алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального характера спектр поглощения зарегистрирован в диапазоне 260-558 нм, основного характера - в диапазоне 258-264 и 428-520 нм. Для алифатических кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера спектр поглощения 363-367 нм, основного характера — 430-434 нм и 524-535 нм (Дубинина Е.Е. с соавт., 1995). При проведении настоящих исследований оптическую плотность образовавшихся алифатических альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера регистрировали при длинах волн 356, 363, 370 нм, основного характера - при 430 и 530 нм (табл. 2.3). Каждую опытную пробу измеряли против контроля.
Содержание карбонильных производных окисленных белков выражали в единицах оптической плотности, отнесенных на 1 г белка (ед.опт.пл/г общего белка). Увеличение содержания 2,4-динитрофенилгидразонов при какой-либо из исследованных длин волн свидетельствует о повышении интенсивности окислительной модификации белков сыворотки крови.
Содержание общего белка в данной работе определяли биуретовым методом с использованием диагностических наборов фирмы «Olvex» (страна производитель - Россия).
Принцип метода заключается в том, что в результате взаимодействия белковых молекул с ионами меди в щелочной среде образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 540 нм. Опытную пробу измеряли против холостой пробы и стандарта. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре Apel PD 303 (Япония).
С целью определения концентрации глюкозы в сыворотке крови экспериментальных животных при проведении настоящих исследований использовался энзиматический колориметрический метод с помощью набора реактивов «Глюкоза-02/12/32-Витал» (Россия).
Принцип метода основан на том, что при окислении P-D-глюкозы кислородом воздуха под действием глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта, интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.
Оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм при длине волны 510 нм регистрировали на спектрофотометре Apel PD 303 (Япония).
Концентрацию триглицеридов в сыворотке крови в данной работе определяли с помощью энзиматического колориметрического метода и набора реактивов «Триглицериды-02/12/22-Витал» (Россия).
Принцип метода заключается в том, что триглицериды под действием фермента липазы распадаются на жирные кислоты и глицерин, который под влиянием фермента глицерокиназы и при участии АТФ превращается в глице-рил-3-фосфат с образованием АДФ. В последующем глицерил-3-фосфат вступает в реакцию с кислородом, при этом образуется диоксиацетон фосфат, а также перекись водорода, которая при взаимодействии с 4-ААР и 4-хлорфенолом под действием пероксидазы образует хинонимин и воду. Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе.
Измерение оптической плотности опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм при длине волны 505 нм проводили на спектрофотометре Apel PD 303 (Япония).
Изучение общетоксического действия производных 3-гидроксипиридина в дозах 1% и 10% от LD5o на фоне иммобилизационного стресса
Примечания: Рк - уровень значимости различий по сравнению с контрольной группой; Рі-2ит.д- между соответствующими группами животных; Рин - по сравнению с интактными животными. Масса сердца при введении всех изученных соединений не отличалась статистически значимо от таковой в группе контроля (табл. 3.7). Масса печени в группах 3-ОП оксалата, 3-ОП малоната и 3-ОП адипината была существенно меньше таковой в группе контроля (Р 0,05; Р 0,05 и Р 0,01 соответственно), а также в группе 3-ОП гемисукцината (соответственно Р 0,05; Р 0,05 и Р 0,01 в трех указанных группах) (табл. 3.7; рис. 3.5). Масса почек в группах 3-ОП оксалата и 3-ОП малеата была меньше аналогичного показателя в группах контроля и 3-ОП малоната (Р 0,05 в обеих указанных группах как по сравнению с группой контроля, так и 3-ОП малоната) (табл. 3.7; рис. 3.5). Масса селезенки на фоне введения 3-ОП гемисукцината была больше таковой в группах контроля, 3-ОП оксалата и 3-ОП малеата (Р 0,01 по сравнению со всеми указанными группами). Кроме того, в группе 3-ОП малоната масса селезенки была меньше, чем в группе 3-ОП оксалата, 3-ОП малеата (Р 0,05 по сравнению с тремя указанными группами) и 3-ОП гемисукцината (Р 0,01), а в группе 3-ОП адипината - меньше, чем в группах 3-ОП малеата (Р 0,05) и 3-ОП гемисукцината (Р 0,01) (табл. 3.7; рис. 3.5). Масса легких оказалась наибольшей в группе 3-ОП гемисукцината (Р 0,05 по сравнению с группами контроля, 3-ОП оксалата и 3-ОП адипината; Р 0,01 - по сравнению с группой 3-ОП малоната), а также в группе 3-ОП малеата (Р 0,01 сравнению с группами контроля и 3-ОП малоната) (табл. 3.7; рис. 3.5). Примечания: 1-я группа — животные, которым вводили 3-ОП оксалат; 2-я - 3-ОП малонат; 3-я - 3-ОП адипинат; 4-я - 3-ОП малеат; 5-я - 3-ОП гемисук-цинат; Р - уровень значимости различий; Р]_5 „ т.д. — между показателем в соответствующих группах; Рк - по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, на фоне введения 3-ОП оксалата в дозе 1% от LD5o отмечается снижение массы крыс, а также массы таких внутренних органов, как печень и почки. При введении 3-ОП малоната и 3-ОП адипината регистрируется уменьшение массы печени, 3-ОП малеата - снижение массы почек и увеличение массы легких. На фоне 3-ОП гемисукцината отмечается повышение массы селезенки и легких. Полученные данные свидетельствуют о разнонаправленной динамике изменения массы тела и внутренних органов на фоне введения различных производных 3-ОП, а также об определенной органотропности общего действия изучаемых производных в дозе 1% от LD5o При введении изучаемых производных 3-ОП в дозе 10% от LD50, в частности 3-ОП малоната и 3-ОП адипината, масса крыс оказалась ниже таковой в группе контроля (Р 0,05 в обеих группах). При этом в обеих группах масса крыс была также меньше аналогичного показателя в группах 3-ОП оксалата и 3-ОП гемисукцината (Р 0,01 в группе 3-ОП малоната; Р 0,05 в группе 3-ОП адипината по сравнению с обеими указанными группами). Причем в группе 3-ОП малоната масса крыс была ниже таковой в группе введения этого же соединения в дозе 1% от LD5o. Кроме того, в группе 3-ОП оксалата масса крыс была больше аналогичного показателя в группе 3-ОП оксалата в дозе 1% от LD5o (Р 0,01 по сравнению с обеими группами), в группе 3-ОП малеата - меньше, чем в группах 3-ОП оксалата и 3-ОП гемисукцината (Р 0,05) (табл. 3.8).
Масса сердца существенно не отличалась практически во всех обследованных группах животных, за исключением группы 3-ОП гемисукцината, у животных которой этот показатель превышал таковой в группах контроля и 3-ОП адипината (Р 0,05 по сравнению с обеими указанными группами) (табл. 3.8).
Масса печени в группе 3-ОП адипината была существенно ниже таковой в группах контроля и 3-ОП гемисукцината (Р 0,01 по сравнению с обеими группами). В остальных из обследованных групп масса печени существенно не отличалась от группы контроля. При этом масса указанного органа в группе 3-ОП оксалата была выше аналогичного показателя в группах 3-ОП адипината (Р 0,01) и 3-ОП оксалата в дозе 1% от LD50(P 0,05) (табл. 3.8; рис. 3.6).
В группе 3-ОП малеата масса печени была больше, чем в группе 3-ОП адипината, но меньше, чем в группе 3-ОП оксалата (Р 0,05 по сравнению с двумя указанными группами) (табл. 3.8; рис. 3.6).
Данные, представленные в таблице 3.8, свидетельствуют также о том, что масса почек оказалась меньше таковой в группе контроля после введения 3-ОП малоната и 3-ОП адипината (Р 0,05 в обеих указанных группах), а больше аналогичного показателя в группе контроля - на фоне введения 3-ОП гемисукцината (Р 0,05). При этом в группе 3-ОП малоната она была ниже аналогичного показателя в группах 3-ОП оксалата (Р 0,01) и 3-ОП малоната в дозе 1% от LD5o (Р 0,05), а в группе 3-ОП гемисукцината, напротив, больше, чем в группах 3-ОП малоната, 3-ОП адипината и 3-ОП гемисукцината в дозе 1% от LD50 (Р 0,01; Р 0,05 и Р 0,05 соответственно). Кроме того, в группе 3-ОП оксалата масса почек существенно превышала аналогичный показатель в группах 3-ОП адипината (Р 0,05), 3-ОП малеата (Р 0,05) и 3-ОП оксалата в дозе 1% от LD50 (Р 0,01) (табл. 3.8; рис. 3.6).
Масса селезенки на фоне введения 3-ОП оксалата, 3-ОП малеата и 3-ОП гемисукцината в дозе 10% от LD5o оказалась больше, чем в группе контроля (Р 0,01; Р 0,05 и Р 0,01 соответственно). Кроме того, в группе 3-ОП оксалата она была больше таковой в группе 3-ОП оксалата в дозе 1% от LD50 (Р 0,01). В группе 3-ОП малоната масса селезенки была также больше аналогичного показателя в группе 3-ОП малоната при введении его в дозе 1% от LD$o (табл. 3.8; рис. 3.6).
Исследование интенсивности окислительной модификации белков при введении 3-оксипиридина малоната в условиях иммобилизационного стресса
Активация свободнорадикального окисления может являться как фактором защиты организма, так и фактором его повреждения. Конечный эффект данных реакций зависит от соотношения систем свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты (Дубинина Е.Е., 2006).
В условиях нормы активные формы кислорода (АФК) - это физиологические метаболиты. Многие важные процессы, например, генерация продуктов пуринового обмена и распад дофамина обязательно сопровождаются выработкой АФК. Осуществляя защитные реакции клетки, специализированные мезен-химальные элементы - макрофаги и гранулоциты могут многократно усиливать продукцию АФК. АФК способны разрушать неповрежденные клеточные стенки бактерий и интактные мембраны клеток. Через АФК опосредуют свое действие фактор некроза опухолей и другие агенты, осуществляющие цитотоксиче-ские эффекты. Однако длительное и значительное увеличение продукции АФК ведет к нерегулируемому самоповреждению клеток (Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б., 2001; Петрович Ю.Б. с соавт., 2004).
При стрессе в рамках общего адаптационного синдрома закономерно происходят динамические изменения различных биохимических показателей, в том числе интенсификация процессов свободнорадикального окисления (Рудь-ко Н.П., Давыдов В.В., 2001; Агаева Р.К., Фастова И.А., 2003; Кравцов В.И. с соавт., 2006; Герасимова Н.Г., Балашов В.П., Кругляков П.П., 2007; Aller М.А., Garsia-Fernandes M.I., Sanchez-Patan А., 2008; Basini G. et al., 2008) и подавляется активность антиоксидантной системы вследствие увеличения распада и угнетения синтеза белковых компонентов. Это касается, например, каталазы и глютатионпероксидазы — энзимов предупреждающего действия, которые восстанавливают активные формы кислорода до неактивного состояния, суперок-сиддисмутазы - фермента, прерывающего цепную реакцию (Зайчик А.Ш., Чу-рилов Л.П., 2000). До 5-10% АФК, образовавшихся в митохондриях (первичные радикалы), способны начать реакции свободнорадикального окисления (РСО) липидных молекул. Кроме того, перекисной модификации могут подвергаться белки и нуклеиновые кислоты (Дубинина Е.Е. с соавт., 1995; Конторщикова К.Н., 2000; Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 2005).
Из РСО именно перекисное окисление липидов (ПОЛ) длительное время являлось главным объектом изучения, в настоящее время придается большое значение и перекисному окислению белков.
Известно, что цитопатогенное действие АФК на молекулы клетки может быть обусловлено прямым ковалентным связыванием с белками мембран или опосредованным через активацию процесса ПОЛ (Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н., 2007). Окислительные процессы затрагивают первичную, вторичную и третичную структуру белков, что может быть важным для ряда физиологических и патологических процессов, таких как старение, тканевой и энергетический обмен. Характер окислительной модификации белка зависит от типа АФК, и процесс свободнорадикального окисления белков, также как и процесс окисления липидов, имеет цепной характер (Болдырев А.А., 2001; Зарубина И.В., 2002; Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н., 2007).
При нарушении баланса между антиоксидантной и прооксидантной системами в качестве корректоров целесообразно применение антиоксидантов. Высокая эффективность антиоксидантов обусловлена, прежде всего, их мем-бранопротекторным действием, что играет большую роль в профилактике и коррекции повреждений клеточных мембран при различной патологии (Бара-бой В.А. с соавт., 1992; Девяткина Т.А., Коваленко Э.Г., Смирнов Л.Д., 1993; Aust S.D. et al., 1993; Cerruti P.A., 1993).
Антиоксидантними свойствами обладает множество соединений. Наиболее сильными антиоксидантами природного происхождения являются витамины группы Е (токоферолы) (Бурлакова Е.Б., 1998; Быстрова Н.А., 2000; Manson J.E., Gaziano J.M., Spelsberg А., 1995). Однако исследования антиокислительной активности различных средств in vitro показали, что витамины-антиоксиданты (кислота аскорбиновая, токоферола ацетат, ретинола ацетат) проявляют невысокую антиоксидантную активность по сравнению со средствами на основе белковых антиоксидантов (церулоплазмином, лактоферрином, супероксиддис-мутазой) (Утешев Б.С. с соавт., 2001; Бровкина И.Л., Конопля А.А., Утешев СБ., 2004).
Большинство природных антиоксидантов, являясь жирорастворимыми веществами, всасываются довольно медленно, действуют мягко и используются в профилактических целях. Однако при острых состояниях требуется «сильный» антиоксидант, который, кроме того, должен хорошо растворяться в воде и быстро с током крови попадать в нужное место (Подосиновикова Н.П., Петров В.В., Долго-Сабуров В.Б., 2005).
Такими препаратами являются производные 3-гидроксипиридина. Как лекарственные средства зарегистрированы три - эмоксипин, мексидол и про-ксипин (Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д., 1995; Скулачев В.П., 2001).
Доказано, что различия в фармакологических свойствах препаратов эмоксипин и мексидол обусловлены кислотными остатками, связанными со структурной основой препаратов - 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридином, то есть у эмоксипина - анионом хлора, что обусловливает его выраженное анти-гипоксическое действие (Смирнов А.В., Криворучко Б.И., 1998), а у мексидола - остатком янтарной кислоты (Машковский М.Д., 2000), обеспечивающим ан-тиоксидантный эффект и положительное влияние на энергетический обмен в клетке (Воронина Т.А., 2001; Миронов Н.В., Суднева В.В., Горяйнова И.И., 2001; Капелько В.И., 2003).
