Интраэпителиальная неоплазия молочной железы Ефремов, Геннадий Дмитриевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Современные представления о морфологических критериях диагностики и прогноза предраковых поражений молочной железы (обзор литературы) 11

1.1 Предраковые поражения молочной железы: общие сведения 11

1.2 Морфологическая характеристика дольковой неоплазии 14

1.3 Внутрипротоковые пролиферативные поражения 20

1.4 Протоковая карцинома in situ 25

1.5 Перспективы использования молекулярных маркеров прогноза в скрининге предраковых поражений молочной железы 32

Глава 2. Материалы и методы 37

2.1 Общая характеристика обследованных пациентов 37

2.2 Методы исследования 40

2.3 Статистическая обработка данных 43

Глава 3. Результаты собственных исследований 44

3.1 Морфологические характеристики предраковых поражений молочной железы 44

3.1.1 Дисплазия 44

3.1.2 Дольковая карцинома in situ 46

3.1.3 Протоковая карцинома in situ 47

3.1.4. Микроинвазивный рак 56

3.2 Сравнительная характеристика фоновых проявлений при неоплазиях молочной железы 57

3.3. Морфологические факторы, характеризующие инвазивныи потенциал опухоли при неоплазии 59

3.4. Результаты иммуногистохимического исследования 62

3.4.1 Экспрессия эстрогеновых и прогестероновых рецепторов 63

3.4.2 Экспрессия Е-кадхерина, р-катенина и цитокератинов .65

3.4.3 Экспрессия маркеров - регуляторов клеточного цикла, пролиферации и апоптоза (р53, Ki-67, bcl-2, циклин Dl)72

3.4.4 Экспрессия коллагена IV и гладкомышечного актина при различных видах неоплазии 76

3.5. Морфологические характеристики и особенности экспрессии маркеров в зависимости от степени дифференцировки внутрипротоковой карциномы in situ 78

3.6. Результаты корреляционного анализа показателей больных при внутрипротоковой карциноме in situ 81

3.7. Морфологические и иммуногистохимические характеристики микроинвазивного рака 83

Обсуждение полученных результатов 84

Выводы 99

Практические рекомендации 101

Список литературы 102

• Морфологическая характеристика дольковой неоплазии
• Протоковая карцинома in situ
• Экспрессия Е-кадхерина, р-катенина и цитокератинов
• Обсуждение полученных результатов

Введение к работе

Актуальность темы. Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место по частоте возникновения среди злокачественных новообразований у женщин и является одной из основных причин смертности от онкологических заболеваний. Прогноз РМЖ определяется ранней диагностикой, что требует проведения скрининга среди женщин группы повышенного риска, к которым относятся, в первую очередь, пациентки с предопухолевыми поражениями молочной железы. Интенсивно разрабатываются вопросы верификации и определения прогностического значения прединвазивных поражений молочной железы, среди которых выделяют тяжелую дисплазию, рак in situ молочной железы (carcinoma in situ - CIS), рак с началом инвазии. Эти заболевания существенно отличаются друг от друга по течению и риску последующего развития инвазивного РМЖ.

Большинство исследователей полагают, что для установления характера поражения необходимо уточнить степень степень злокачественности, пролиферативную активность и другие биологические характеристики опухоли, первоначальное определение которых производится при морфологическом исследовании. В материалах Международной конференции по классификации CIS зафиксировано, что для точной верификации этого заболевания недостаточно одной морфологической оценки. В ряде случаев критерии диагностики неоднозначны, что требует проведения дополнительных исследований, в том числе с применением современных иммуногистохимических методов. Иммуногистохимический метод (ИГХ) позволяет не только определить гистогенетические особености предраковых поражений молочной железы, экспрессию гормональных рецепторов, различных онкопротеинов, пролиферативную активность, но и выявить наличие минимальной инвазии, зачастую существенно меняя прогноз заболевания. В связи с этим ИГХ метод стал широко использоваться исследователями при изучении интраэпителиальных неоплазий молочной железы.

В большинстве опубликованных работ, использовавших этот метод, ограниченное число маркеров не позволяет в полной мере уточнить биологический профиль изучаемых заболеваний, отсутствуют данные о прогностической значимости данных видов неоплазий, не определен алгоритм комплексной диагностики, сочетающий морфологические и ИГХ критерии.

Вышеизложенное свидетельствует о высокой актуальности проблемы разработки критериев верификации прединвазивных заболеваний молочной железы для онкологии и патологической анатомии и определяет необходимость проведения настоящей работы.

Цель исследования – разработка критериев дифференциального диагноза вариантов интраэпителиальной неоплазии молочной железы на основе применения комплексного морфологического метода исследования с применением оптимальной панели маркеров для улучшения качества диагностики и оценки риска развития инвазивного рака.

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1. Определить комплекс морфологических критериев дифференциальной диагностики дисплазий и карциномы in situ молочной железы.

2. Уточнить критерии дифференциальной диагностики протоковых и дольковых преинвазивных поражений молочной железы.

3. Определить оптимальный набор иммуногистохимических маркеров, необходимых для выявления фокусов микроинвазии при карциномах in situ.

4. Оценить роль некоторых ИГХ маркеров в оценке инвазивного потенциала предраковых изменений.

5. Сравнить морфологические и иммуногистохимические критерии, определяющие степень злокачественности протоковой карциномы in situ молочной железы.

Научная новизна исследования. Проведено комплексное изучение широкого спектра структурных характеристик предраковых изменений молочной железы, отражающих различные аспекты биологической агрессивности неоплазий с учетом их гистологического строения (основных морфологических типов). Систематизированы характерные признаки различных видов неоплазий молочной железы, предложен алгоритм дифференциальной диагностики между протоковыми и дольковыми поражениями.

Сформулированы критерии дифференциальной диагностики дисплазии молочной железы и высокодифференцированной карциномы in situ. Показано, что в качестве таковых могут быть использованы уровень пролиферации мономорфных клеток, наличие патологических митозов и некроза, поляризация ядер по отношению к базальной мембране, количество структур вовлеченных в патологический процесс, уровень экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону и цитокератинам 5/6 и 14 типов.

Определена диагностическая ценность применения двух маркеров- коллагена IV типа и гладкомышечного актина для выявления фокусов микроинвазии при карциномах in situ.

Определен комплекс морфологических и иммуногистохимических признаков, сочетающихся с повышением инвазивного потенциала внутрипротокового рака. Доказано, что к ним можно отнести степень дифференцировки клеток, наличие некроза, поляризации, уровни экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, p53, bcl-2, Ki-67. Продемонстрировано, что для низкодифференцированного и микроинвазивного протокового рака in situ характерны максимальные уровни риска инвазивного потенциала опухоли, в то время как минимальные значения этих параметров выявляются при дисплазиях и дольковой карциноме in situ.

На основе экспрессии иммуногистохимических маркеров, выявлены корреляции между факторами инвазивности внутрипротоковой карциномы in situ и морфологическими характеристиками предопухолевых поражений.

Практическая значимость работы. Полученные данные о частоте и выраженности экспрессии различных иммуногистохимических маркеров позволяют создать основу для определения индивидуального прогноза течения заболевания, что, в свою очередь, будет способствовать разработке адекватных схем терапии прединвазивных неоплазий молочной железы. Предложены подходы к оптимальной морфологической диагностике прединвазивных поражений молочной железы, что позволит свести к минимуму риск развития рецидивов и определить возможность возникновения последующей инвазии. Предложен алгоритм исследования биологических свойств и проведения дифференциальной диагностики различных видов неоплазий молочной железы.

Определение использованных в работе показателей рекомендовано к применению в крупных региональных онкологических центрах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гистологическое исследование предраковых поражений молочной железы следует дополнить оценкой экспрессии иммуногистохимических маркеров. Определение уровней экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, p53, bcl-2, Ki-67, цитокератинов 5/6, H, циклину D1, Е-кадхерину и -катенину является важнейшим инструментом дифференциальной диагностики различных видов неоплазий молочной железы и независимым фактором оценки инвазивности опухоли.

2. Определение наличия фокусов микроинвазии при карциноме in situ должно проводиться с использованием иммуногистохимического исследования. Оценка экспрессии двух протеинов: коллагена IV типа и гладкомышечного актина позволяет установить диагноз микроинвазивного рака в большинстве случаев, однако, рекомендуется добавление к панели дополнительных маркеров для улучшения диагностики.

3. Признаками повышения инвазивности неоплазий молочной железы являются: повышение частоты выявления некроза, нарушения поляризации клеток, снижение частоты экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, сочетание максимальной экспрессии р53 и Ki-67 при минималной экспрессии bcl2.

4. Признаками снижения степени дифференцировки опухолевых клеток при внутрипротоковой карциноме in situ также являются: повышение частоты выявления некроза, нарушений поляризации клеток, снижение частоты экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, снижение уровня экспрессии bcl-2, повышение частоты экспрессии р53, Ki-67.

Внедрение результатов в клиническую практику. Результаты исследования применяют для диагностики рака in situ молочной железы в патологоанатомическом отделении ФГБУ «Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена» Минздрава Россиии и лаборатории патологической анатомии ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России.

Апробация работы. Диссертация апробирована 31 января 2013 года на заседании межотделенческой конференции ФГБУ «МНИОИ им. П.А.Герцена» Минздрава России. Основные положения исследования доложены на: Конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» 9-10 октября 2009 г.; Всероссийской конференции «Новые технологии в диагностике и лечении рака молочной железы и меланомы кожи» 16-17 декабря 2010, на конференции «Актуальные вопросы в диагностике и лечении больных раком молочной железы и меланомой кожи» 2011 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 научные работы, которые изданы в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста. Состоит из введения, трех глав, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 14 отечественных и 313 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 35 рисунками и 16 таблицами.

Морфологическая характеристика дольковой неоплазии

Дольковые неоплазии (ДН) характеризуются пролиферацией мелких, рыхло расположенных клеток, без признаков инвазии стромы. Сам термин относят к полному спектру атипичных пролиферации эпителия, расположенного в пределах терминальной протоково-дольковой единицы (ТПДЕ), с или без педжетоидного распространения на терминальные протоки [Tavassoli F.A. et al., 2003]. Для различных, часто морфологически сходных, заболеваний широко используются обозначения - атипическая дольковая гиперплазия (ALH) и дольковыи рак in situ (LCIS). Во многих публикациях эти понятия используются как синонимы.

Классическое описание гистологической картины преинвазивного рака долек молочной железы дано Foot и Stewart как редкой формы рака молочной железы еще в 1941 г. Затем они же в 1945 г. подробно описали гиперпластические процессы в дольках, расценивая их как начальные фазы развития преинвазивного рака. Однако, спустя более чем шестьдесят лет после первоначального описания, роль дольковой карциномы in situ в развитии инвазивного рака окончательно не определена. Публикации Haagensen CD. et al. (1978) и Rosen P.P. et al. (1978) показали, что изменения эпителия долек, описываемые как дольковыи рак in situ и атипическая дольковая гиперплазия, не являются предшественниками развития инвазивной карциномы. Haagensen предложил термин «дольковая неоплазия» (lobular neoplasia, LN) для этих состояний [Haagensen CD. et al., 1978]. Причиной этому послужили следующие наблюдения:

- ДН редко прогрессирует до инвазивной карциномы;

- риск развития инвазивной карциномы на фоне дольковой карциномы in situ равен в обоих молочных железах;

- инвазивный рак, который развивается на фоне ДН, с одинаковой вероятностью бывает протокового или долькового строения.

В последующие несколько десятилетий дольковая карцинома in situ рассматривалась как «индикатор риска» развития инвазивной карциномы, а не как истинное предопухолевое поражение.

В настоящее время на основании данных молекулярно-генетического анализа ДН вновь начала рассматриваться как истинное предопухолевое поражение, и чтобы подчеркнуть ее неинвазивный характер, был предложен термин дольковая внутриэпителиальная неоплазия (ДИН).

Частота ДН составляет от 1 % [Wheeler J.E. et al., 1976] до 3,8 % [Haagensen CD. et al., 1972] от общего количества злокачественных карцином молочной железы. Структуры ДН обнаруживаются в 0,5-4,0 % первичных биопсий молочной железы [Page D.L. et al., 1991]. ДН встречается у женщин в возрасте от 15 лет, но чаще в возрасте 40-50 лет, т.е. на 10 лет раньше чем протоковая карцинома in situ [Ackerman L.V., Katzenstein A.L., 1977; Tavassoli F.A. 1992].

Заболевание является мультицентричным у 85 % пациентов [Rosen P.P. et al., 1979; Tavassoli F.A., 1994] и билатеральным от 30 % [Haagensen CD., 1986] до 67 % женщин, которым была проведена двусторонняя мастэктомия [Newman W., 1966]. ДН не имеет отчетливой маммографической симптоматики [Ottesen G.L. et al., 1993; Pope T.L. et al., 1988] кроме случайных микрокальцинатов, развивающихся в пределах центрального некроза [Sapino A. et.al., 2000].

Оценка распространенности ДН сложна, поскольку она не имеет выраженной клинической картины и редко выявляется при маммографическом исследовании. Из-за этого ДН случайно обнаруживается в биоптатах взятых по поводу других заболеваний молочной железы. В последнее время отмечена тенденция к увеличению числа выявленных ДН. Частично это, по-видимому, связанно с увеличением числа биопсий после проведенных маммографических исследований [Habel L.A. et al., 1997].

Как уже упоминалось, повреждение клеток при ДН расположено в пределах ацинусов терминальной протоково-дольковой единицы [Wellings S.R. et al., 1975] с педжетоидным вовлечением терминальных протоков в 75 % случаев [Andersen J.A., 1974; Haagensen CD., 1986]. При микроскопическом исследовании, архитектура долек сохранена, ацинусы одной или более долек расширены, с различной степенью пролиферации мелких рыхло расположенных клеток нечеткими контурами и светлой цитоплазмой. Ядра клеток округлые, мономорфные, с нечеткими ядрышками, однородным хроматином. Некроз и микрокальцинаты нехарактерны, митозы редки или отсутствуют. Внутрицитоплазматические люмены встречаются часто, но не являются специфичными для ДН [Andersen J.A., Vendelboe M.L., 1981]. В некоторых случаях обнаруживаются более крупные, полиморфные, а также перстневидные клетки. Апокриновая метаплазии встречается, но существование эндокринного варианта ДН оспаривается [Eusebi V., Azzopardi J.G., 1980].

Выделяют два гистологических типа ДН: Тип А при котором клетки, заполняющие просвет ацинусов и прилегающих протоков, мелкие, ядра слегка укрупнены, но мономорфны, без митозов и окружены узким поясом едва заметной цитоплазмы. Тип В: клетки более крупные, имеют светлое, везикулярное, структурное ядро с неправильным распределением хроматина, встречаются редкие митозы, цитоплазма обильная светлая [Haagensen CD. et al., 1978]. Некоторые авторы отмечают, что число вовлеченных в процесс долек при типе А меньше, чем при типе В. Встречаются смешанные варианты. В последнее время в группе ДН выделяют плеоморфный вариант с наличием крупных клеток с большими полиморфными ядрами, четкими ядрышками [Citoler P., Zippel Н.Н., 1975].

Базируясь на морфологических критериях и клиническом результате, была предложена трехуровневая система градации данного вида поражения МЖ, основанная на распространенности, степени пролиферации клеток и цитологических особенностях [Bratthauer G.L., Tavassoli F.A., 2002]. Поражения с заметно увеличенными дольками, часто с центральными некрозами, состоящие из полиморфных или перстневидных клеток, относятся к ДИН 3, они часто связаны с ивазивной карциномой [Tavassoli F.A., 2003]. Однако такая система градации не является общепринятой и требует подтверждения другими центрами.

При ДН позитивная реакция с рецепторами эстрогена (ER) встречается в 60-90 % случаев, с рецепторами прогестерона - несколько реже [Bur М.Е. et. al., 1992; Giri D.D. et al., 1989; Pallis L. et. al., 1992], причем такое соотношение более характерно для классического варианта ДН, чем для плеоморфного [Bentz J.S. et al., 1998; Silver S.A., Tavassoli F.A., 2000]. В отличие от низкодифференцированного DCIS, классическая ДН редко экспрессирует ERBB2 или белок ТР53 [Albonico G. et. al., 1998; Ramachandra S. et. al., 1990; Rudas M. et. al., 1997]. Экспрессия этих маркеров более вероятна при плеоморфном варианте [Middleton L.P. et. al., 2000; Silver S.A., Tavassoli F.A., 2000]. Реакция с Е-кадхерином характерна для внутрипротоковых повреждений и вообще отсутствует как в ДН, так при инвазивной дольковой карциноме [Moll R. et al., 1993; Rasbridge S.A. et. al., 1993]. Е-кадхерин представляет собой кальций-связывающий белок, обеспечивающий взаимодействие между эпителиальными клетками в слоях. Внутриклеточный домен Е-кадхерина взаимодействует с бета-катенином и далее через альфа-катенин - с цитоскелетом. Таким образом, формируется прочный каркас для эпителия. Установлена роль рецепторных молекул адгезии в приобретении опухолевыми клетками инвазивной и метастатической активностей. Потеря Е-кадхерина или других компонентов системы способствует прогрессии опухоли и метастазированию [ Vleminckx К. et al., 1999 , Perl А.К. et al., 1998].

Обычно при ДН экспрессия Е-кадхерина и цитокератинов 5, 6 отрицательна, а высокомолекулярного цитокератина FBVIW СК34ВЕ12 положительна [Bratthauer G.L. et al., 2002], в отличии от DCIS, при котором экспрессия Е-кадхерина положительна, а СК34ВЕ12 - негативен. В редких случаях наблюдается обратная парадоксальная реакция. Полагают, что сомнительные, как с морфологической и иммуногистохимической точек зрения, так называемые «гибридные поражения» с протоковыми и дольковыми признаками, должны выделяться из общей группы для их дальнейшего изучения [Bratthauer G.L. et. al., 2002].

Определенные диагностические трудности возникают, когда ДН встречается в участках склерозирующего аденоза или при других склерозирующих процессах. В этих случаях ДН сложно отличить от инвазивной карциномы. Присутствие слоя миоэпителиальных клеток вокруг структур, относящихся к новообразованию, исключает возможность инвазивной карциномы. При этом иммунофенотипирование с маркерами к гладкомышечному актину может помочь обнаружить миоэпителиальный слой, и таким образом облегчить дифференцировку. Присутствие изолированных атипичных клеток, расположенных в строме недалеко от фокуса ДН может ызвать сложности в диагностике. При этом отсутствие миоэпителиального слоя вокруг отдельных клеток, выявленных с помощью любого из эпителиальных маркеров, говорит о наличии стромальной инвазии.

Протоковая карцинома in situ

Морфологический диагноз внутрипротокового рака был установлен в 71 случае. Для оценки степени дифференцировки внутрипротоковой карциномы использовались следующие критерии: степень ядерного полиморфизма, митотическая активность, поляризация клеток и архитектоника опухоли.

В нашем исследовании встречались следующие степени ядерного полиморфизма:

- низкая степень (ЯП 1) (24 случая, 33,8 %). Внешний вид ядер мономорфный, размер составляет 1,5-2,0 диаметра нормальных эритроцитов крови или ядра неизмененной протоковой эпителиальной клетки. Хроматин обычно дисперсный, рассеянный, встречаются единичные ядрышки и фигуры митоза (Рис. 5);

- высокая степень полиморфизма (ЯП 3) (26 случаев, 38 %). Внешний вид ядер полиморфный, размер ядра обычно составляет более 2,5 диаметра эритроцитов крови или ядра нормальной протоковой эпителиальной клетки. Ядра имеют везикулярную структуру, отмечается нерегулярное распределение хроматина, многочисленные ядрышки и фигуры митоза (Рис. 6);

Фигуры митоза и микрокальцинаты встречались часто (в 68%), но не во всех случаях. Некроз по типу «комедо» обнаруживался в 19% всех случаев. Поляризация клеток оценивалась как радиальная ориентация апикальной части опухолевых клеток по отношению к базальной мембране.

- умеренная степень полиморфизма (ЯП 2) (20 случаев, 28,2%). Ядра, которые полностью не отвечают критериям первых двух групп (Рис. 7).

В структурном отношении в нашей работе встречались следующие архитектурные варианты:

- угревидный;

- криброзный;

- папиллярный;

- солидный;

- стелющийся.

Угревидный рак (комедо-карцинома) - характеризуется выраженной пролиферацией атипичных полиморфных клеток с обширным некрозом в центре. Клетки с выраженным ядерным полиморфизмом, гиперхромией, с большим количеством митозов, преимущественно патологических (Рис. 8).

Криброзный рак - образован пролиферацией клеток с формированием множественных просветов по типу «ломтика сыра». Клетки сравнительно мономорфные, средних размеров, иногда встречаются более крупные с обильной эозинофильной цитоплазмой, митозы единичные (Рис. 9).

Папиллярный рак - характеризуется наличием внутрипротоковых пролифератов с образованием множественных сосочковых и папиллярных структур. Иногда это маленькие эпителиальные сосочки из довольно мелких, умеренно полиморфных клеток с явлениями некроза по поверхности сосочков. В отдельных случаях определяются структуры напоминающие внутрипротоковую цистаденопапиллому. Образующие их клетки довольно однотипны, небольшого размера. Следует отметить, что в данном случае необходимым представляется разграничение внутрипротокового папиллярного рака из мелких протоков и внутрикистозного рака. При поражении мелких протоков строма развита скудно, апокринизация и некрозы отсутствуют. При внутрикистозном раке строма сосочков развита хорошо или неравномерно, полиморфизм клеток умеренный, митозы немногочисленны (Рис. 10).

При солидном варианте CIS аплазированные клетки полностью заполняют просвет увеличенного в размере протока, без образования каких-либо структур. Клетки с довольно выраженным полиморфизмом, гиперхромией ядер, с четкими ядрышками. Имеются атипичные митозы. Редко в центре структур солидного рака могут встречаться небольшие некрозы и отложение микрокальцинатов. Появление некроза ассоциируется с нарастанием полиморфизма, гииперхромией, увеличением пролиферативнои активности.

Стелющаяся карцинома представлена эктазированными протоками с выстилкой из однорядного эпителия, иногда с образованием микрососочков с выраженным полиморфизмом и гиперхромией ядер, митозы немногочисленны (Рис. 11).

В зависимости от степени ядерного полиморфизма, наличия внутрипротокового некроза, митотической активности и гистологического строения, мы разделили внутрипротоковые неоплазии на две группы по степени дифференцировки.

Высокодифференцированная протоковая карцинома in situ (34 случая, 48,9%) была представлена мелкими, мономорфными клетками, образующими аркады, микропапиллярные, криброзные или солидные структуры. Ядра были однородны и имели правильное распределение хроматина с малозаметными нуклеолами. Степень ядерного полиморфизма была низкой в 60%) случаев, в остальных случаях отмечалась умеренная степень полиморфизма. Фигуры митоза встречались крайне редко. В просвете отдельных протоков имелись слущенные клетки. Некроз и угревидные структуры отсутствовали (Рис.12).

Соответственно вариантам архитектоники, 35,5%, или 12 случаев высокодифференцированной DCIS были солидного строения, 20,6% (7 случаев) - криброзного строения, 44,1 % (15 случаев) - папиллярного.

Очаги низкодифференцированной DCIS (37 случаев, 52,1 %) были образованы резко атипичными клетками, расположенными как в один слой, так и с формированием микропапиллярных, криброзных и солидных структур. Ядра были резко полиморфны, плохо поляризованы, с нечетким контуром и грубым распределением хроматина и четкими нуклеолами. Высокая степень ядерного полиморфизма определялась в 83,9%) случаев, во всех случаях часто встречались фигуры митоза. Характерным признаком низкодифференцированного внутрипротокового рака in situ являлся так называемый «комедо-некроз» с наличием большого количества некротических масс, окруженных пролиферирующими крупными полиморфными клетками опухоли (РисІЗ).

Экспрессия Е-кадхерина, р-катенина и цитокератинов

Е-кадхерин, Р-катенин и высокомолекулрные цитокератины считаются наиболее информативными маркерами, позволяющими провести дифференциальный диагноз между протоковыми и дольковыми неоплазиями молочной железы. В связи с этим, экспрессия данных протеинов исследовалась нами с целью подтверждения морфологического диагноза и определения их диагностической специфичности.

В первую очередь, к маркерам дифференциальной диагностики относится Е-кадхерин, трансмембранный протеин, являющийся белком адгезии. Потеря мембранной экспрессии Е-кадхерина считается характерным признаком дольковой неоплазии, в то время как большинство протоковых карцином и диспластических поражений, так же как и нормальный протоковый эпителий, интенсивно экспрессируют белок. Тем не менее, изредка встречающаяся потеря экспрессии Е-кадхерина клетками протоковой карциномы, также как и аберрантная экспрессия протеина при дольковых неоплазиях, может вести к диагностическим ошибкам [Young Choi, 2008]. В таких случаях ряд исследователей использует дополнительные маркеры, такие, как высокомолекулярный цитокератин, специфичный для клеток дольковой неоплазии, и альфа, бета и гамма-катенины, характерные для протоковых клеток [Dabbs DJ et al 2007, Esposito et al 2007].

В нашем исследовании экспрессия Е-кадхерина была выявлена во всех образцах дисплазии (100%), 68 образцах внутрипротокового рака (95,7%), и в 19 образцах микроинвазивного рака (90,4%).

В большинстве случаев протокового рака in situ уровень экспрессии был оценен как 3+ (66 образцов, 93%) и лишь в 2 случаях оценивался как 2+. Рис. 21 представляет характерную картину полномембранного окрашивания с антителами к Е-кадхерину при типичной внутрипротоковой карциноме. Три случая, при котором экспрессия Е-кадхерина отсутствовала, были первоначально охарактеризованы как высокодифференцированная протоковая карцинома in situ солидного строения по морфологическим критериям, однако иммуногистохимическое исследование позволило отнести их в группу внутридольковых карцином.

Во всех случаях классической внутридольковой карциномы первого типа (19 случаев, 68%) определялось полное отсутствие экспрессии Е-кадхерина. Среди 9 случаев, квалифицированных при морфологическом исследовании как внутридольковый рак с выраженной клеточной атипией (второго типа), были выявлены 4 случая (14,2%) полномембранного окрашивания клеток. В трех случаях интенсивность окрашивания была оценена как 3+, в одном случае - как 2+. Случай, определенный как обладающий смешанными морфологическими признаками, также показал выраженную экспрессию Е-кадхерина, расцененную как 3+. В целом, окрашивание на Е-кадхерин отсутствовало в 23 случаях морфологически диагностированного долькового рака (82%). Таким образом, Е-кадхерин доказал высокую специфичность, как маркер, характерный для внутрипротоковой карциномы, его экспрессия определялась при этом виде опухолей достоверно чаще (р= 0.0005).

Полученные результаты представлены на Рис. 22.

Такая же тенденция была отмечена и при определении экспрессии (3-катенина при различных типах предраковых поражений молочной железы.

Достоверно чаще Р-катенин определялся при дисплазиях и внутрипротоковом раке (в 98% и 95,7%) случаев), а также при микроинвазивном раке - в 89% случаев. При дольковом раке in situ экспрессия обнаруживалась лишь в двух случаях, которые будут обсуждены ниже. Полученные результаты представлены на Рис 23.

В семи случаях аберрантной экспрессии Е-кадхерина окрашивание на Р-катенин было использовано как дополнительный маркер протоковых неоплазий. Позитивное окрашивание было получено в 2 из 3 внутрипротоковых карцином, негативных по экспрессии Е-кадхерина, что подтвердило протоковую природу этих поражений. В одном случае экспрессия Р-катенина также не определялось, этот случай был, таким образом, квалифицирован как внутридольковая карцинома. В двух из 4 случаев дольковой карциномы in situ с аберрантной экспрессией Е-кадхерина была обнаружена экспрессия р-катенина, что позволило отнести эти опухоли к внутрипротоковым, несмотря на первичный морфологический диагноз. В 2 случаях окрашивание на Р-катенин было негативным.

В дополнении нами выполнялось окрашивание образцов для выявления экспрессии высокомолекулярного цитокератина, который считается рядом авторов специфическим маркером долькового эпителия.

Цитокератины высокого молекулярного веса (СК-Н клон 34ЬЕ12) -белки промежуточных филаментов, имеющие молекулярный вес 65; 58; 56,5 и 50 Ш. При различных видах неоплазий молочной железы определение их экспрессии используется для дифференциальной диагностики между внутрипротоковыми и внутридольковыми поражениями. При этом, по данным литературы, при дольковой карциноме in situ отмечается его четкая мембранная экспрессия. При дисплазиях и, в редких случаях, при протоковой карциноме in situ отмечается его рассеянная экспрессия во внутрипротоковых пролифератах, а также наряду с мембранным окрашиванием встречается и цитоплазматическая реакция (Рис.24).

При оценке полученных результатов было отмечено, что позитивное окрашивание выявлялось в большинстве случаев классической дольковой карциномы in situ (16 случаев из 19, 84%), а его интенсивность варьировала от 2+ до 3+. Экспрессия протеина определялась, как правило, в цитоплазме перинуклеарной области. Кроме того, позитивное окрашивание опухолевых клеток на высокомолекулярный цитокератин отмечалось в 14% случаев внутрипротовой карциномы (10 случаев из 71), причем в четырех случаях окрашивание было интенсивным. Из этих четырех случаев в одном отсутствовала экспрессия Е-кадхерина и (3-катенина, что позволило дополнительно подтвердить дольковую природу опухоли. В целом, экспрессия высокомолекулярного цитокератина выявлялась при дольковой карциноме in situ достоверно чаще (р= 0.0006). При микроинвазивном раке экспрессия высокомолекулярного цитокератина была найдена лишь в 1 случае (4,7%) с гистологической структурой долькового рака, однако окрашивание было неравномерным и оценивалось на +1 или +2 балла в разных зонах. Полученные результаты представлены на Рис.25.

Кроме того, было оценена иммуногистохимическая реакция с антителами к цитокератинам 5/6 и 14 типов, которая выполнялась не только для проведения дифференциальной диагностики между протоковои гиперплазией и раком in situ, но и для выявления базальноклеточнои дифференцировки.

Было выявлено, что экспрессия цитокератинов 5/6 и 14 типов достоверно чаще выявляется при дисплазиях (38 случая, или 56% случаев), причем характерной является рассеянная экспрессия протеина разной степени выраженности. При исследовании карцином in situ были получены следующие данные: положительная экспрессия цитокератина 5/6 типов определялась в 3 случаях внутрипротокового и 1 случае внутридолькового рака. Экспрессия цитокератина 14 типа - дополнительно в 1 случае протоковой карциномы in situ (кроме 3 случаев, в которых экспрессия СК 5/6 и СК14 выявлялась одновременно) и в 1 случае внутридольковой карциномы (кроме одного случая, где экспрессия СК 5/6 и СК14 была одновременной). Таким образом, экспрессия цитокератинов 5/6 и 14 была обнаружена в 4 случаях протоковой и 2 случаях дольковой карциномы in situ, что составило 5,6% и 7,1% соответственно. В остальных случаях эти протеины экспрессировались только миоэпителиальными клетками (Рис 26).

Обсуждение полученных результатов

Примерно 20 лет назад рак in situ диагностировали только в 3-5 % случаев от всех вновь выявляемых раков молочной железы. Карциному in situ, как правило, выявляли при патоморфологическом исследовании послеоперационного материала на фоне фиброаденоматоза или вблизи от очага инвазивной карциномы. Ее клинические проявления в большинстве случаев ограничивались пальпируемым образованием, выделениями из сосков или болезнью Педжета.

Благодаря развитию рентгеномаммографии и внедрению маммографического скрининга значительно возросла частота выявления клинически скрыто протекающих как минимальных форм РМЖ, так и CIS. По данным мировой литературы, в настоящее время CIS составляет 2СМ10 % случаев от всех вновь выявляемых РМЖ.

В связи с этим, перед специалистами стоит важнейшая задача определения оптимальной тактики лечения и наблюдения больных с предопухолевыми неоплазиями МЖ. Для ее решения необходимо выявить категории больных, как с благоприятным, так и неблагоприятным течением заболевания, что определяется, прежде всего, биологическими особенностями карцином in situ. Эти особенности находятся в прямой зависимости как от морфологической структуры опухоли, степени гистологической злокачественности, так и от ряда других биологических факторов, определяющих прогноз заболевания. В связи с этим перспективным представляется дальнейший углубленный поиск факторов прогноза, определяющих риск развития местных рецидивов уже инвазивного рака с последующим развитием метастазов опухоли.

В настоящее время для определения злокачественного потенциала преинвазивных поражений молочной железы широко используется обычная для онкологической патоморфологии трехуровневая характеристика степени дифференцировки опухоли. Проведение больших проспективных исследований показало, в целом, коррреляцию степени дифференцировки преинвазивных неоплазий молочной железы, установленной по морфологическим критериям, и риска развития инвазивной опухоли после органосохраняющих операций [Bijrker et al]. Однако морфологическая характеристика опухоли является во многом субъективной, и различия между заключениями разных специалистов зачастую приводят к неправильной оценке потенциальной агрессивности процесса. Кроме того, гетерогенность строения преинвазивных поражений молочной железы также может приводить к существенным вариациям в определении степени дифференцировки [Sloane et al]. Особый интерес вызывает также характеристика протоковых карцином, сопровождающихся микроинвазией, прогноз которых зачастую остается неясным. В связи с этим, в течение последних лет проводятся исследования, направленные на подбор оптимальной панели различных признаков, прежде всего биомаркеров, позволяющей с высокой степенью достоверности определять злокачественный потенциал преинвазивных поражений молочной железы, а также карцином с фокусами микроинвазии. В большинстве случаев эти исследования базируются на изучении профилей генной экспрессии и пока не могут широко использоваться в практической онкологии из-за сложности метода и высокой стоимости оборудования и реагентов [Ma et al; Hanneman et al]. Использование методик, основанных на иммуногистохимической детекции экспрессии протеинов, кажется более приемлемым для ежедневной работы патолога.

В нашей работе мы выделили только четыре наиболее значимых и наиболее часто встречающихся вида интраэпителиальной неоплазий, с которыми связано и наибольшее число расхождений мнений специалистов при установлении диагноза и определении прогноза, и попытались объединить морфологические и иммуногистохимические параметры с целью проведения адекватной диагностики и выявления факторов, характеризующих их злокачественный потенциал.

На первом этапе исследования проводилась морфологическая оценка преинвазивных поражений с целью характеристики основных признаков каждого вида неоплазий и показателей, определяющих степень дифференцировки клеток и злокачественный потенциал опухоли. Было выявлено, что наиболее часто высокая степень ядерного полиморфизма встречаются в группе внутрипротокового рака и микроинвазивного рака, также как и другие морфологические феномены, ассоциирующиеся со злокачественным потенциалом опухоли, а именно наличие некроза, нарушения клеточной поляризации. По морфологическим признакам примерно половина протоковых карцином in situ была отнесена в группу низкодифференцированных опухолей (37 случаев из 71, или 52%), а в случаях с фокусами микроинвазии признаки низкой дифференцировки отмечались более чем в 90% случаев.

Кроме того, была проведена сравнительная характеристика морфологической картины при различных неоплазиях и выявлена различная частота встресаемости фоновых процессов. Установлено, что тяжелая дисплазия в большинстве случаев протекает на фоне выраженной пролиферации эпителия протоков и долек, миоэпителия, очагов аденоза, характеризующихся увеличением числа мелких протоков и ацинусов. Чаще, чем при других видах неоплазий, выявлялась апокриновая метаплазия. Очаги некроза отсутствовали. Значительно реже встречались фиброаденомы.

При протоковой карциноме in situ в структуре фоновых поражений преобладали пролиферативные процессы в эпителии протоково-дольковой единицы и дисплазия 1-2 степени. Редко отмечались фиброаденомы и апокриновая метаплазия эпителия протоков и долек.

При дольковой карциноме in situ в структуре фоновых поражений также преобладали пролиферативные процессы эпителия, в большинстве случаев выявлялись дисплазия и аденоз. При микроинвазивной карциноме in situ в структуре фоновых поражений преобладали пролиферативные процессы эпителия протоково-дольковой единицы, реже встречались дисплазия 1-2 степени, очаги аденоза.

Статистически достоверных различий изученных фоновых изменений при различных видах интраэпителиальных неоплазий получено не было.

Проведенные исследования показали, что данные, получаемые при микроскопическом изучении различных форм неоплазий молочной железы достаточно сложны для проведения дифференциальной диагностики, поэтому следующим этапом нашей работы была сравнительная оценка частоты и выраженности экспрессии иммуногистохимических маркеров.

Особое внимание было уделено дифференциальной диагностике между дисплазиями и высокодифференцированной карциномой in situ, между внутридольковым и внутрипротоковым раками, а также характеристике признаков микроинвазии.

На практике, наиболее часто возникают сложности при дифференциальной диагностике между тяжелой дисплазией молочной железы и высокодифференцированной протоковой карциномой in situ. Необходимость проведения такой диагностики диктуется, прежде всего, тем, что каждый из этих патологических процессов предусматривает различные подходы к лечению и определяет прогноз течения заболевания. Ведущую роль в этом играет, безусловно, микроскопическое исследование.

По результатам нашего исследования, для тяжелой дисплазии характерна пролиферация мономорфных клеток с незначительным укрупнением и полиморфизмом ядер при отсутствии патологических митозов, некроз также отсутствует. Важным дифференциально-диагностическим признаком является сохранение поляризации ядер по отношению к базальной мембране. Также большое значение имеет и количество структур, вовлеченных в патологический процесс, так как для диспластических изменений характерно поражение не более одной или двух структур ТПДЕ до 2мм в диаметре каждая. Было определено, что наряду с обычным гистологическим исследованием при проведении дифференциальной диагностики очень эффективно использование иммуногистохимического исследования, а именно выявление при дисплазиях рассеянной экспрессии цитокератинов 5/6 типа, достоверно чаще встречающейся при этом виде неоплазии (р=0,0005). Некоторую помощь может оказать и исследование экспрессии ER/PR и циклина D1, однако, различия в частоте экспрессии в данном случае показывают менее выраженную статистическую разницу (р=0,05). Реакция с цитокератинами особенно важна при наличии папиллярных структур, когда бывает действительно сложно диагностировать высокодифференцированную карциному in situ из-за выраженного полиморфизма клеток.

Дифференциально-диагностические критерии для дисплазии и высокодифференцированной протоковой карциномы in situ представлены табл.15.

Похожие диссертации на Интраэпителиальная неоплазия молочной железы

Состояние щитовидной железы у больных с патологией молочных желез : Клинико-ультразвуковое исследованиеТкачева, Ирина Анатольевна

Ретроградная эндолимфатическая химиотерапия запущенных стадий рака легкого, молочной железы, желудка и поджелудочной железыРасулов, Самеъ Рахмонбердиевич

Оценка инфицированности ткани предстательной железы вирусами семейства Herpesviridae и папилломы человека при раке предстательной железыСамсонов, Роман Борисович

Антигены, иммунологически родственные структурным белкам вируса рака молочной железы мышей (MMTV) их ассоциация с опухолями молочных желез человекаМаливанова, Татьяна Федоровна

Эффективность нейтронной и нейтронно-фотонной терапии в комплексном лечении местных рецидивов рака молочной железы [Электронный ресурс]Великая Виктория Валерьевна

Экспрессия HER-2/neu и применение герцептина при раке молочной железы [Электронный ресурс]Ганьшина Инна Петровна

Сравнение двух режимов химиотерапии в лечении гормонорезистентного рака предстательной железы [Электронный ресурс]Бирюков Виталий Александрович

Клиническое течение и отдаленные результаты хирургического лечения рака щитовидной железы у детей и подростков [Электронный ресурс]Осипов Сергей Викторович

Особенности клинического течения рака молочной железы в сочетании со злокачественными новообразованиями других локализаций [Электронный ресурс]Соколов Николай Юрьевич

Функциональная активность и прогностическая значимость АВС-транспортеров у больных раком молочной железы [Электронный ресурс]Тимофеева Надежда Владимировна