Введение к работе
Актуальность проблемы. Новейшие данные теоретической и эк-онкологии свидетельствуют о том. что рак у че-1ЫХ является молекулярно-генетическим заболева-. al.,1981.1983; Князев П.Г. и др. ,1986;). Глубинные патогенетические процессы при онкогенезе прежде всего развертывается на уровне геномной ДНК и сводятся в основном к точковим мутациям. (Сгосе Ctt et al.. 1985,1987;, Сеяц И.Ф., Князев Е Г. ,1986). Это генетическое событие (при недостаточности систем естественной репарации, регуляции экспрессии генов и межклеточных взаимодействий) необратимо, что и обуславливает необратимый характер явления малигниэации на уровне генома клетки.
Наиболее убедительные экспериментальные данные о роли специфичных точкових мутаций в активации лротоонкогенов были получены при сравнительном анализе генов семейства RAS, выявленных при трансфекции опухолевой ДНК нормальных клеток. У представителей этой группы генов во всех типах опухолей с разной частотой мутации затрагивают 12 или 61 кодоны (Santos E.et al. . ,1983; Yuasa Y. et al. ,1984). Цутация в 13, соседнем с 12. колоне протоонкогена HRAS1 (замена глицина аспарагином или сери-ном) токае приводит к трансформирующей активности этого гена (Fasano aet al. ,1984). . .
Исходя из вышеизложенного, в дис( ртационной работе планировалось изучить частоту присутствия точковых мутаций в "горячих" кодонах онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и легких, как в наиболее распространенных неоплазмах у человека Необходимость проведения такого исследования подкрепляется и тем обстоятельством, что по данным литературы этот вопрос оставался малоизученным, поскольку методы выявления точковых мутаций в генах чрезвычайно сложны технически и дороги.
Анализ работ показывает, что между генетическими повреждениями, в нашем случае.между деяециями аллелей и точковыми мутациями в оставшемся адлеле онкогена HRAS1, возможна взаимосвязь (Князев II Г. и др. ,1990,1991). С учетом этого, в данной работе также планировалось проверить ранее сформулированную гипотезу 6.неслучайной (направленной) элиминации дикого аллеля онкогена HRAS1 в процессе прогрессии опухолевых признаков у человека. Подобные генетические события в клетке могут быть "разнесены". во времени: точковая мутация в одном из аллелей -раннее событие, возможно связанное с инициацией канцерогенеза, а делеция дикого аллеля - позднее, ассоциированное с злокачес-
- 4 -твенной трансформацией, что блестяще подтверждено в экспериментах на животных, а именно раках кожи у мышей, индуцированных метилхолантреном (Balmain A. et al.,1989).
Кроме того, обнаруженные мутации в онкогене HRAS1 с помощью рестрикционного картирования с последующим секьенирова-нием могли определить варианты замен нуклеотидов в горячих колонах и расширить наши представления о механизмах активации этого протоонкогена.
Дель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярной природы повреждений онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и легких человека
В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:
осуществить широкий скрининг присутствия точковых мутаций в горячих кодонах онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и легких человека, а также для сравнения с другими опухолями - в раках, толстой кишки, щитовидной железы и яичника;
провести анализ наличия мутаций в 12 и 61 кодонах онкогена HRAS1 для проверки гипотезы направленной утраты дикого аллеля в некоторых образцах ДНК карцином легкого и молочной железы, содержащих один аллель этого гена, и установить взаимосвязь между указанными генетическими событиями; . .
определить первичную структуру фрагментов онкогена HRA31, имеющих точковые мутации, для выяснения характерных вариантов замены нуклеотидов в кодонах, ассоциированных с превращением протоонкогена в онкоген;
.- оценить прогностическую значимость делеций и точковых мутаций в аллелях онкогена liRASl при развитии карцином молочной железы и легких у человека.
Научная новизна и практическая значимость полученных результатов. В результате, вьтолнения диссертационной работы впервые решены следующие важные в теоретическом и практическом плане вопросы:
получены новые плазмиды рВБ-1 и рВБ-2, несущие 1" и 61 -ый кодоны онкогена HRAS1, позволяющие проанализировать ука-занные последовательности;
определена частота точковых мутаций в горячих кодонах онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы (3 гетерозигсты по мутации в 12 кодоне из 57 образцов ДНК) и яичника (1 гетерозигота по мутации в 12 кодоне из 3 образцов ДНК) (табл.);
отмечено, что делеция одного из аллелей онкогена HRAS1 в
исследуемых карциномах не сопровождается демаскированием мутаций в 12, 13 и 61 кодонах протоонкогена HRAS1, следовательно утрата короткого плеча 11 хромосомы в отношении этого онкогена не является случайным событием;
- установлен вариант замены нуклеотидов в 12 кодоне, ответственных за активацию онкогена HRAS1, сопровождающейся трансверсией Г - Т (ГГЦ -ГТЦ) в ДНК опухолевых клеток карцином молочной железы и яичника, что, в свою очередь, приводит к замене в белке p21-HRASl в 12 положении амитнокислоты глицина на валин.
Диссертационная работа в целом представляет собой теоретическое исследование. Полученные результаты имеют важное значение для понимания роли точковых мутаций в канцерогенезе у человека, с одной стороны, другой - способствуют разработке мо-лекулярно-биологических методов определения прогноза развития неоплазм. Несомненно в будущем такие подходы будут также использоваться в диагностике злокачественных новообразований у людей.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав: материалы и методы, результаты и обсуждение, заключения и выводов. Работа' иллюстрирована 8 таблицами и 26 рисунками. Библиографический укі іатель включает публикации на русском и английском языках.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на симпозиумах: советско-американском - ''Ретровирусы, онкогены, регуляция экспрессии белков", США, г. Сиэттл, 1989, сентябрь; советско-французском "Ретровирусы и молекулярная онкология", г. Рига, 1991, октябрь и всесоюзном - по биохимии опухолевой клетки, г. Минск, 1990, ноябрь, а также на заседании совместной научной конференции лабораторий: молекулярной генетики, биохимии, экспериментальных опухолей, эндокринологии, онкоишунологии, химических канцерогенных агентов, предклини-ческих испытаний, органического синтеза и фармакологии, пато-логоанатомии с прозектурой, научно-технического отдела НИИ онкологии им,, проф. H.R Петрова МЗ РФ.
