Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор "Нативные и полусинтетические тритерпеноиды в качестве перспективных противоопухолевых и противовирусных агентов"
1.1. Введение 8
1.2. Антимеланомный агент бетулиновая кислота 10
1.3. Анти-ВИЧ агент 3-(7-(3',3'-диметилсукцинил)бетулиновая кислота 15
1.4. Противовоспалительный и противоопухолевый агент 2-циано-3,12-диоксоолеан-1,9(11)-диен-28-овая кислота
1.5. Противовирусная и противоопухолевая активность нативных тритерпеноидов и их полусинтетических производных
1.6. Фармакологическая активность ряда природных и синтетических тритерпеноидов с изменённым скелетом
ГЛАВА 2. Обсуждение результатов 47
2.1. Синтез новых тритерпеновых производных лупанового и 19(3,28-эпокси-олеананового типов с сохранением нативной структуры
2.1.1. Синтез ацилатов 3(3-гидрокси-и 3-оксиминотритерпеноидов 47
2.1.2. Синтез 2-дезокси-а-гликозидов 28-оксоаллобетулина и метилового эфира бетулиновой кислоты
2.1.3. Синтез гетероциклических производных метилбетулоната 61
2.2. Синтез и превращения нор- и секотритерпеноидов 63
2.2.1. Синтез стероидоподобного производного 19{3,28-эпоксиолеанана 63
2.2.2. Синтез и превращения А-тринортритерпеноидов 70
2.2.3. Синтез 4,5-секотритерпеноидов и устойчивых озонидов аллобетулина 75
2.2.4. Новая модификация цикла Е тритерпеноидов типа лупана 80
2.3 Фармакологическая активность и антифидантное действие тритерпеновых производных лупановой и олеанановой групп
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 96
Выводы 136
Список литературы
- Анти-ВИЧ агент 3-(7-(3',3'-диметилсукцинил)бетулиновая кислота
- Противовирусная и противоопухолевая активность нативных тритерпеноидов и их полусинтетических производных
- Синтез ацилатов 3(3-гидрокси-и 3-оксиминотритерпеноидов
- Синтез и превращения нор- и секотритерпеноидов
Введение к работе
Химия растительных метаболитов терпеноидного класса сыграла выдающуюся роль в становлении и развитии важнейших разделов современной органической химии. Фитохимические исследования, посвященные изучению компонентного состава растений и строения их метаболитов, ведутся в мире в постоянно увеличивающемся масштабе. Много внимания уделяется средствам народной медицины, история многих из которых насчитывает не одно тысячелетие.
Параллельное развитие фитофармакологии, поставленной на современный экспериментальный уровень, позволило получить превосходные результаты. Не' случайно, что многие крупные фармацевтические компании взяли под контроль фитохимические исследования.
Важным направлением медицинской химии стало изучение синтетических трансформаций растительных метаболитов, выбор которых в качестве объектов для исследований зависит от ряда факторов. Наиболее приемлемым считается исследование растительных метаболитов, о биологической активности которых имеются надежные сведения, и которые являются доступными в настоящее время или в ближайшем будущем по мере формирования сырьевой базы. Трансформации подобных метаболитов, часто уже применяемых в практической медицине, имеют такие цели, как повышение базовой активности, снижение токсичности и побочных эффектов, улучшение транспорта в организме. К примеру, на основе метаболита тиссатаксола, положенного в основу эффективного канцеростатика паклитакселя, получено несколько десятков производных, проходящих в настоящее время доклинические исследования. Выделяемый из полыни сесквитерпен артемизинин обладает уникальной противоплазмодийной активностью и используется для получения более активных водорастворимых производных.
Многие метаболиты сами по себе ценности для медицины не представляют, но обладают привлекающей доступностью. Трансформации таких веществ могут иметь две цели: синтез известных практически важных соединений и синтез веществ с потенциальной ценностью, включаемых в систему биотестирования и фармакологические исследования.
Примерами реализации первой цели могут служить отработанные в промышленном масштабе технологии получения стероидных гормонов, в том числе кортикостероидов на основе растительных стероидов диосгенинал ситостерина.
Направление, связанное с поиском ценных для медицины агентов на основе неактивных метаболитов, к настоящему времени накопило немало убедительных примеров. Так, побочный алкалоид опия используется для получения таких необходимых агентов, как налаксон и бупренорфин.
Есть и другие примеры реализации второй цели. Они не оставляют сомнения в перспективности исследований по целенаправленным трансформациям растительных метаболитов в качестве важного научного направления. Необходимо подчеркнуть особую актуальность этих исследований для нашей страны, располагающей уникально богатой сырьевой базой, которая сегодня используется крайне неэффективно.
Соединениями, сочетающими доступность с ценной биологической
активностью, богат класс тритерпеноидов. На основе производных
глицирризиновой и глицирретовой кислоты разработаны
высокоэффективные, противовирусные (анти-ВИЧ), противовоспалительные и противоязвенные препараты. Для клинических испытаний в качестве средства лечения злокачественных опухолей рекомендована 2-циано-3,12-диоксоолеа-1,9-диен-28-овая кислота.
Последние два десятилетия дали основания возлагать надежды на введение в терапию ряда болезней препаратов на основе тритерпеноидов лупанового ряда. Эти надежды безусловно связаны с бетулином -тритерпеноидом, поразительно широко распространенным в природе и легко
получаемым практически в любом количестве. Бетулиновая кислота проходит предклиническую апробацию как препарат для лечения метастатических меланом и является перспективным ингибитором энтеровирусов. Некоторые производные бетулиновой кислоты образовали группу анти-ВИЧ агентов с новым механизмом действия. В России, не только располагающей уникальными растительными ресурсами, но и имеющей богатые научные традиции, дальнейшее развитие исследований несомненно актуально.
Целью данной работы являлся синтез новых биологически активных производных бетулина для выполнения которой были поставлены следующие задачи:
- разработка новых схем скелетных трансформаций бетулина и его
производных по кольцам А и Е;
- синтез новых фармакологически активных производных тритерпеноидов
путем модификации функциональных групп с сохранением нативной
структуры.
Анти-ВИЧ агент 3-(7-(3',3'-диметилсукцинил)бетулиновая кислота
Было найдено также, что бетулиновая кислота селективно индуцирует апоптоз в клетках человеческой глиомы U 373 [27]. Бетулиновая кислота оказалась активной в отношении скваматознои карциномы головы и шеи [36].
Ряд недавних работ посвящен изучению механизма цитостатического действия бетулиновой кислоты. На примерах девяти линий клеток нейробластомы и клеток меланомы, авторы [20] пришли к выводу о том, что в этих клетках был задействован механизм апоптоза, который характеризуется серией выраженных морфологических и биохимических изменений, приводящих к физиологически естественному удалению опухолевых клеток фагоцитирующим окружением.
Одним из главных выводов, который был сделан после проведения скрининга бетулиновой кислоты в отношении 60 линий опухолей человека, является констатация отсутствия избирательности действия бетулиновой кислоты [2]. Важным выводом служит также подтвержденный всеми группами исследователей факт о неактивности бетулиновой кислоты в отношении неопухолевых трансформированных клеток [21, 23, 28]. По данным авторов [37, 38] апоптоз и цитотоксичность максимальны при при рН = 6 Л (оптимальная среда развития опухолевых клеток) и минимальны при рН = 7.3 (оптимальная среда метаболизма нормальных клеток). Кроме того, показано, что бетулиновая кислота проявляет высокую эффективность, направленную против роста клеток меланомы при уменьшении рН ( 6.8) [37, 38]. Эти результаты представляют несомненный интерес, так как многие опухоли выделяют окисленные экстрацеллюлярные продукты, которые могут способствовать абсорбции бетулиновой кислоты опухолью. Продемонстрировано также, что тепловая чувствительность является результатом увеличения восприимчивости опухолевых клеток к бетулиновой кислоте, вероятно, из-за снижения внутриклеточного рН [37].
Наконец, показано, что обработка бетулиновой кислотой приводит к существенному подавлению активации ингибитора фактора некроза опухоли (NFkB), вызываемого многими канцерогенами и стимуляторами воспаления [39]. Этот ингибирующий эффект осуществляется через подавление IkBa-киназы, ответственной за фосфорилирование и последующую деградацию IkBa ингибитора фактора некроза опухоли (NFkB). Ингибирование IFkB может служить в качестве другой вероятной молекулярной основы для апоптозвызывающих свойств бетулиновой кислоты.
Последние публикации добавили ряд ценных данных о противораковой активности бетулиновой кислоты. В экспериментах с клетками рака грудной железы Golo-205 и прямой кишки SKBR3 бетулиновая кислота в процессе апоптоза воздействует на пусковые механизмы, связанные с митохондриальными сигнальными путями (MSP). Активирование каспаз 3 происходит одновременно с появлением полипептида р17. Бетулиновая кислота активно подавляет оба вида клеток дозозависимым образом [40]. Описано исследование противоопухолевого эффекта бетулиновой кислоты в комбинации с винкристином на клетках перевитой меланомы B16F10 in vitro и in vivo [41]. Добавление бетулиновой кислоты к винкристину повысило супрессию экспериментальных легочных метастаз в меланомных клетках. Сделан важный вывод о том, что бетулиновая кислота является эффективным дополнительным средством повышения действенности химиотерапии меланом. Комбинация бетулиновой кислоты с фактором некроза опухолей индуцирует апоптоз клеток различных видов рака [42, 43]. Комбинация, включающая бетулиновую кислоту, церамид и фактор некроза опухолей TRAIL, предложена в качестве перспективного вспомогательного агента для воздействия на глиобластому мозга WHOIVGBM вместе с цитостатиками и радиотерапией [42].
Таким образом, бетулиновая кислота представляет интерес для предклинических и клинических исследований в отношении широкого спектра злокачественных новообразований. В настоящее время бетулиновая кислота проходит предклинические исследования в США в качестве средства для лечения и профилактики злокачественной меланомы, смертность от которой составляет 50% от числа выявленных больных [16].
Противовирусная и противоопухолевая активность нативных тритерпеноидов и их полусинтетических производных
Выявление перспективных агентов 1, 2, 3 оказалось возможным в результате кропотливого скрининга нескольких тысяч нативных тритерпеноидов и их синтетических производных. Так, уникальные свойства бетулиновой кислоты как антимеланомного агента были выявлены в результате изучения активности более двух с половиной тысяч природных экстрактов [16]. Противовирусные (анти-ВИЧ) свойства тритерпеноидов активно изучаются группой профессора К.-Н. Lee из университета Северной Каролины. Ниже представлены данные анти-ВИЧ активности ряда нативных тритерпеновых кислот.
Среди кислот лупанового типа наиболее привлекательным профилем обладает дигидробетулиновая кислота. Наличие изопропильного фрагмента положительно сказывается и на активности ряда производных дигидробетулина (будет рассмотрено ниже). Среди кислот олеананового типа выделяется мороновая кислота, также обладающая активностью в отношении вируса простого герпеса (ЕС5о 3.9 іМ, ТІ = 16.3) [92]. Данный объект достаточно перспективен для проведения различных трансформаций с целью усиления активности.
Недавно было обнаружено, что бетулиновую кислоту и ее производные следует рассматривать как перспективные ингибиторы безоболочного РНК-содержащего вируса ЕСН06, относящегося к семейству возбудителей полиомиелита, риновирусной инфекции, лихорадочных и респираторных заболеваний, вызываемых энтеровирусами. Эффективность бетулиновой кислоты (ЕС5о=0.007 mkM, МПК/ЕС5о 4000) показывает ряд преимуществ перед новым препаратом плеканорил (ЕС5о=0.05 mkM, ЕС9о=0.04 mkM,
Механизм противовирусного действия производных бетулиновой кислоты пока неизвестен, возможно, как и в отношении ВИЧ, блокируются стадии начальных этапов взаимодействия вируса с клеткой, однако показатели степени противовирусной активности впечатляют и свидетельствуют о высокой специфичности действия [93, 94].
Некоторые нативные и полусинтетические тритерпеноиды обладают активностью в отношении вируса гриппа. Так, по данным работы [95] в отношении гриппа типа А умеренно выраженную активность проявили метиловый эфир урсоловой кислоты, меристотроповая кислота, метиловый эфир 3-ацетата олеаноловой кислоты, 16-гидроксиолеаноловая и эхиноцистовая кислоты. В отношении гриппа В были активны урсоловая и урсоновая кислоты, метиловый эфир мацедониковой кислоты, аллобетулин, 16-гидроксиолеаноловая и эхиноцистовая кислоты. Метиловый эфир глицирретовой кислоты, аллобетулон и бетулин противогриппозной активности не проявили.
Среди ацилатов с анти-ВИЧ активностью выделяется группа диметилсукцинильных производных бетулина, дигидробетулина, дигидробетулиновой кислоты, формулы которых представлены ниже. Их ЕС50 лежит в области наномолярных концентраций, а ТІ достигает 42400. Аналогичной активностью обладает 3-0(3\3 -диметилсукцинил)олеаноло-вая кислота, подобный ацилат урсоловой кислоты представляет меньший интерес. По значениям ЕС5о и ТІ различные гликорил- и дигликорилпроизводные бетулина, бетулиновой, Зос-аминобетулиновой и урсоловой кислот уступают диметилсукцинильным производным. имеют отличный от ацилатов (в том числе и РА 457) механизм анти-ВИЧ действия, заключающийся в ингибировании стадии слияния оболочки вирусной частицы с клеточной мембраной. Впервые они были получены французскими исследователями [104]. Возможный механизм действия этих соединений обсуждается в работе [109], согласно которой, дипептид RPR 103611 блокирует инфекцию посредством взаимодействия с гликопротеином gp 41 вируса. Действие происходит путем вмешательства агента после связывания клеточной мембраны с вирусом. Эта стадия зависит от свойств оболочки. Устойчивость к агенту RPR 103611 вызвана появлением двух аминокислотных заместителей около gp 41 (R— А в позиции 22, I— S в позиции 84). В приложении к ВИЧ-1 линии ЬАГ(субтип В) 184S мутация достаточна для устойчивости к агенту. Резистентность к дипептиду RPR 103611 также может обеспечиваться L19H мутацией. Как 184S, так и L91H локализованы «в районе петли» гликопротеида gp 41, отделяющем проксимальный и дистальный спиральные домены. Противовирусная активность агента RPR 103611 зависит от аминокислотной последовательности и доступности этого района спирали гликопротеина gp 41.
Стереоизомер IC9564 подавляет репликацию ВИЧ, взаимодействуя с его гликопротеином gp 120. Чувствительность к лекарству определяется мутациями G237R и R252K [47, 104, 110].
Весьма перспективные соединения, молекулы которых сочетают 28-амидную и 3-ацилатную группировки, описаны в работе [111]. Мощная анти-ВИЧ активность агентов LH-15 и LH-55, превосходящая активность описанных выше дипептида IC9564 и ацилата РА-457, связана с их способностью действовать по двум вышеуказанным механизмам. В частности, речь идёт о комбинировании ингибирующих свойств в отношении стадии созревания и стадии слияния вируса (блокирование устойчивости к ингибиторам протеазы и обратной транскриптазы).
Дипептид бетулоновой кислоты, имеющий фрагмент фенилаланина, также является перспективным анти-ВИЧ агентом [107]. Предполагается, что он оказывает влияние на ранние этапы цикла репродукции вируса, идущие за связыванием вируса с клеткой. Вполне вероятно, что дипептид воздействует непосредственно на вирусные белки. Именно за счет этого значительно повышается эффективность агента при его добавлении одновременно с вирусом. Низкая ингибирующая концентрация дипептида открывает перспективу для разработки на его основе пероральных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции. Заслуживает внимания и высокая активность дипептида бетулоновой кислоты в отношении вируса простого герпеса, а также его иммуностимулирующее действие, превышающее эффект неполного адъюванта Фрейда [112]..
Синтез ацилатов 3(3-гидрокси-и 3-оксиминотритерпеноидов
Ацилаты тритерпеноидов являются группой веществ, в которой обнаружены перспективные для медицинской практики соединения. Динатриевая соль гемисукцината глицирретовой кислоты (карбеноксолон) используется для лечения язвы желудка с 60-х годов прошлого века [5]. В недавних работах сообщается, что карбеноксолон обладает антиконвульсивным эффектом [9], благоприятно влияет на баланс лёгочной жидкости при воспалении лёгких [10]. Наиболее перспективными соединениями по ингибированию репликации ВИЧ в клетках Н9 лимфоцитов оказались диметилсукцинилпроизводные бетулиновой, олеаноловой кислот и бетулина, причем 3,28-дипроизводные более активны, чем моно- СЗ или С28-эфиры [97]. Установлено, что Зр-(7-(3 ,3 -диметилсукцинил)бетулиновая кислота, ЗР-0-(3 ,3-диметилсукцинил)-28-0-(2 ,2,-диметилсукцинил)бетулин и 3-0-(3 \3 -диметилсукцинил)олеаноловая кислота активны в наномолярных концентрациях [97, 98, 102]. В настоящее время 3$-0-(3\У-диметилсукцинил)бетулиновая кислота, запатентованная фирмой Panacos Pharmaceuticals (США), находится на стадии предклинических испытаний для лечения ВИЧ-1. Совсем недавно опубликован синтез и данные анти-ВИЧ активности ЗР-О-глутарилдигидробетулина (1С5о = 23.59 цМ, ЕС5о = 2х10 5 цМ, ТІ = 1.12х10б), который является наиболее активным соединением в отношении ВИЧ-1 среди тритерпеноидов [108].
Описаны ацилаты бетулиновой [15], олеаноловой [89], урсоловой и эхиноцистовой [103] кислот, содержащие ацетатные, диметилсукцинатные, диметилглутаратные, тетраметиленглутаратные и др. фрагменты. Биологическая активность данных соединений достаточно полно представлена в обзорах [1,2,48,103,151].
Перспективным соединением является 3,28-ди 7-никотинат бетулина, проявивший гепатопротекторную, противоязвенную, противовоспалительную, ранозаживляющую, анти-ВИЧ и иммуномодулирующую активности [152], он может быть использован для лечения различных заболеваний гепатобилиарной системы, включая токсические, лекарственные и аллергические поражения печени [153]. 3(3,28-Ди-(9-гемисукцинат бетулина и Зр,28-ди-0-гемифталат бетулина обладают выраженной гепатопротекторной активностью [152, 153].
Таким образом, актуальным является синтез ацильных производных тритерпеноидов с целью выявления среди них новых физиологически активных веществ.
Мы получили ряд новых ацилатов, используя тритерпеновые спирты олеананового и лупанового типов: аллобетулин 1, 28-оксо-аллобетулин 3, бетулин 4 и бетулиновую кислоту 5. Необходимо отметить, что ацилирование 28-оксо-аллобетулина проведено нами впервые. 28-Оксо-аллобетулин 3 получали восстановлением 28-оксо-аллобетулона 2 [154] NaBH4 в изопропиловом спирте с выходом 92%, соотношение эпимеров ЗрОН/ЗаОН составило 95:5 (спектр ЯМР Н). После перекристаллизации из СНСЬ-МеОН получили чистый 3ЗОН-эпимер с выходом 83%. Отметим, что исходный 28-оксо-аллобетулон 2 проявил выраженную противовирусную активность в отношении гриппа А [154].
Синтез эфиров вели ангидридным и хлорангидридным методами. В качестве ацилирующих агентов были использованы ангидриды янтарной 1а и фталевой lb кислот, а также хлорангидриды коричной Па, метоксикоричной lib, никотиновой Ис, 2-(4-хлорфенил)-3-метшшасляной ІИ, тетраметилциклопропанкарбоновой Не, и 2 -(Р ,(У-дихлорвинил)-3/,3 диметилциклопропанкарбоновой Ilf кислот. Ацилированием аллобетулина 1 или 28-оксоаллобетулина 3 ангидридами янтарной 1а или фталевой lb кислот в безводном пиридине получены 3(3-0 гемисукцинаты 6, 7 и 33-0-гемифталаты 8, 9 с выходом 82-95% (схема 1). Об образовании сложноэфирной связи судили по слабопольному сдвигу сигналов атомов СЗ на 3.5-4.9 м.д. и наличию сигналов -0-С=0-группы при 5 167.5 177.3 м.д. в спектрах ЯМР 13С.
Синтез и превращения нор- и секотритерпеноидов
Тритерпеновые 0-гликозиды относятся к числу природных соединений, представляющих большой интерес для медицины. Особое внимание в качестве потенциальных лекарственных препаратов антивирусного, иммунотропного, противоопухолевого и адаптогенного действия привлекают гликозиды лекарственных растений (женьшеня, солодки, аралии, календулы и др.).
В последние годы интенсивно развиваются исследования в области синтеза аналогов природных биологически активных гликозидов и их модифицированных производных. Описан целый ряд природных и синтетических гликозидов бетулина (в основном Р-гликозиды), которые обладают противовоспалительной, противоопухолевой, росторегулирующей активностью. Так, фрутиссапонин В (Fruticesaponin В) (3(3-0-(0-a-L рамнопиранозил-(1- 4)-О-р -глюкопиранозил)луп-20(29)-ен-23,28-диовой кислоты 28- 9-Р-0-глюкопиранозиловый эфир), выделенный из экстракта володушки кустарниковой Bupleurum fruticescens, проявил высокую активность в отношении воспалений, вызванных каррагенином, тетрадеканоилфорбол ацетатом, арахидоновой кислотой и этилфенилпропиолатом [156]. Гликозиды бетулина, введённые в состав лецитиновых липосом, могут повышать эффект липосомных препаратов по снижению уровня холестерина в крови при экспериментальной гиперхолестеринемии [157]. О-, S- и ЛЧГликозиды бетулиновой кислоты запатентованы для лечения воспаления, метастаз или ингибирования липоксигеназы и межклеточной адгезии [158]. 3-0-Глюкопиранозид бетулиновой кислоты обладает высокой росторегулирующей активностью в отношении главного корня проростков огурца посевного Cucumis sativus L. сорта КИТ [159]. Было показано, что 2,6-дидезокси-а- арабмно-гексапиранозид глицирретовой кислоты обладает противоязвенной активностью и высокой ранозаживляющей способностью [160, 161]. Синтез тритерпеновых гликозидов представляет интерес также в плане изучения реакции гликозилирования сложных поли функциональных биологически активных спиртов. Известный общий метод гликозилирования сложных спиртов - метод Кенигса-Кнорра и его модификации приводят обычно к смесям ос- и (3-гликозидов и не гарантируют количественных выходов целевых соединений. Ранее был в основном описан синтез р-гликозидов бетулина, его моноацетатов, 18,19-изобетулина, 3,4-секолупана [162] в условиях реакций Кенигса-Кнорра и Гельфериха, который характеризовался невысокой стереоселективностью и выходами [163-165].
Перспективным в плане стереоспецифичного синтеза комплексных гликозидов является метод электрофильного гликозилирования с использованием в качестве гликозильных доноров 1,2-ненасыщенных производных углеводов - гликалей, который приводит к образованию 2-дезокси-гликозидов, входящих в состав многих биологически активных веществ. Ранее в нашей лаборатории были показаны преимущества прямого синтеза тритерпеновых и стероидных 2-дезокси-а-гликозидов гликальным методом с использованием сульфокислых катионитов и LiBr [166,167].
В связи с этим представлял интерес синтез тритерпеновых а-гликозидов лупановой и олеанановой групп гликальным методом. Гликозилирование 28-оксоаллобетулина 3 и метилового эфира бетулиновой кислоты 41 3,4,6-три-0-ацетил-,-глюкалем III и 3,4-ди-С?-ацетил- рамналем IV проводили в безводных условиях в смеси хлористого метилена -ацетонитрила в присутствии сульфокислого катионита КУ-2-8 (Н+ - форма), LiBr, молекулярных сит 4 А при комнатной температуре в течение 2-3 ч по общей схеме 5.
