Введение к работе
Актуальность проблемы. Специфичность ферментативного катализа можно рассматривать как результат ряда одновременных взаимодействий между молекулой субстрата и активным центром фермента. При этом, однако, существует возможность, что эти взаимодействия являются взаимосвязанными, т.е. проявление одного фактора специфичности контролируется'присутствием другого. Это может выражаться в функциональной взаимосвязи нескольких участков активного центра. Примером может служить ацетилхолинэстераза, активная поверхность которой содержит, по меньшей мере, два участка: анионный и эстеразный центры. Проявление в катализе и того и другого центра в отдельности изучено весьма подробно, механизмы же их взаимодействия и роль этого фактора в определений эффективности катализа, тем не менее, далеко неясны.
Целью настоящей работы явилось изучение роли анионного центра в функционировании эстеразного центра ацетилхолинэсте-разы путём количественного анализа специфичности и каталитических свойств фермента, модифицированного ионом N,N-flHMe-тил-2-фенилазиридиния. Данное соединение является аффинным модификатором анионного центра ацетилхолинэстеразы, которое при ковалентном связывании с белком имитирует влияние катион-ной группы молекул, взаимодействующих с этим центром.
Научная новизна. Установлено, что ковалентное связывание иона М,Ы-диметил-2-фенилазиридиния в анионном центре ацетилхолинэстеразы оказывает на каталитические свойства фермента такое же влияние, как обратимое связывание ионов тетраалкил-аммония. Обнаружено, что алкильная группа н-алкансульфонил-хлоридов взаимодействует в эстеразном центре ацетилхолинэстеразы с участком, где локализована ацильная часть сложноэфир-ных субстратов в их реакции с ферментом. В результате связывания ионов М,Гї-диметил-2-фенилазиридиния в анионном центре ацетилхолинэстеразы увеличивается, во-первых, специфичность фермента относительно строения алкильных групп алкансульфонилхлоридов, и во-вторых, скорость стадии ацилиро-вания фермента в реакции со сложноэфирными субстратами.
Практическая ценность работы. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что при анализе корреляционных зависимостей структура-активность надо иметь в виду возможность появления отклонений от аддитивности в результате
взаимозависимых эффектов разных участков активной поверхности фермента. Из полученных данных также вытекает принципиальная возможность получения ферментов с заданными каталитическими свойствами путём ковалентного модифицирования регуляторного центра аналогами обратимых эффекторов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 6 докладов. Результаты работы доложены автором на международной конференции по химической физике ферментативного катализа, Таллинн, 1987, на 5-ой конференции молодых ученых социалистических стран, Пущино-на-Оке, 1988, на 14-ом сьезде IUB, Прага, 1988, на 11-ой международной конференций по химии фосфора, Таллинн, 1989, на 3-ей конференции по холинэстеразам, Ла Гранд Мот, 1990.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, 3 глав, в которых излагаются результаты, части обсуждения результатов, выводов и списка литературы (175 наименования). Работа изложена на 152 страницах, включает 26 таблиц и 41 рисунок.
1 Материалы и методы исследования
Ацетилхолинэстеразу (К.Ф. 3.1.1.7) яда среднеазиатской кобры (Nala naja oxlana), очищенную до гомогенности методом аффинной хроматографии, получили из Института химической и биологической физики АН Эстонии. Концентрация нативного фермента определялась титрованием активных центров 0,0-диэтил-паранитрофенилфосфатом по методу Берри. Химически модифицированная ацетилхолинэстераза была синтезирована при обработке нативного фермента ІІ,їІ-диметил-2-фенилазиридинием, который получили из гидрохлорида М,11-диметил-2-хлоро-2-фенилэтил-амина, синтезированного ранее на кафедре органической химии Тартуского университета.
Сложные эфиры получали при реакции соответствующих спиртов с уксусным ангидридом. Все использованные сложные эфиры, в том числе и коммерческие, были подвергнуты ректификации . Чистоту веществ проверяли методом газовой хроматографии ("Chrom 5", ЧССР, носитель 10 Carbowax 2ОМ).
0,0-диэтилтиофосфаты (СН СН 0)P(0)SR при R=(CH„) -СН (п=4,5 и 7) nor.;, чали реакцией диэтилхлорофосфата с соответствующими меркатидами натрия. Полученные продукты подвергали
очистке на колонке силикагеля ICN Pharmacenticals (ФРГ). Элюентом была смесь ацетона с гексаном (1:4) . Остальные фосфорорганические ингибиторы при R=C-H5, н-С3Н_, н-С н 3, н-С„Н,_ были синтезированы ранее на кафедре органической химии
о 1 і
Тартуского университета.
А.лкансульфонилхлориды RS0„C1 (R=-CH(CH3)2,-CH2CH(CH,)2 И -(СН„)?СН(СН„)) были получены при реакции натриевых солей соответствующих алкансульфокислот с фосфорпентахлоридом. Натриевые соли алкансульфокислот были получены реакцией соответствующих алкилбромидов с сульфитом натрия. Все алкан-сульфонилхлориды, в том числе коммерческие (R=-C Н при n=l-4, Aldrich), были использованы после ректификации.
Для измерения активности нативного фермента применялся спектрофотометрический метод Эллмана при Л=412 нм. Условия реакции: 0.15 М фосфатный буфер, рн=7.5, 25 С. Концентраций 5,5-дитиобис-(2-нитробензояной кислоты) и ацетилтиохолина были 1 мМ. Активность модифицированного фермента определяли по скорости гидролиза п-нитрофенилацетата при Д =402 нм (0.15М фосфатный буфер, рН=7.5, 1.7* ацетонитрила, 0.7 иИ субстрата). Значение молекулярной активности модифицированного фермента относительно п-нитрофенилацетата а =з300сек . Спектрофотометрические измерения проводились на приборе "DU8" (Beckman).
Кинетику ацетилхолинэстеразного гидролиза сложноэфирных субстратов измеряли на рН-стате RTS-822 фирмы "Radiometer" (Дания) в 0.15М растворе КС1. Реакции провели при 25 С под атмосферой, освобождённой от CO..
Кинетику необратимого ингибирования ацетилхолинэстераэы фосфорорганическими ингибиторами и алкансульфонилхлоридами измеряли по уменьшению активности фермента в псевдомономоле-кулярных условиях при 1000 кратном избытке ингибиторов В 0.15 М фосфатном буфере при рН=7.5, 25С. За ходом реакций наблюдали, отбирая из реакционной смеси аликвоты и измеряя активность фермента спектрофотометрическим методом. Время реакции в случае алкансульфонияхлоридов не превышало 25% от значения времени полураспада ингибиторов в реакции гидролиза.
Кинетику щелочного гидролиза алкансульфонилхлоридов измеряли на рН-стате RTS-822 фирмы "Radiometer" (Дания) (0.15М КС1, 1.75% ацетонитрил). Реакции провели под атмосферой, освобождённой от СО .
Для статистической обрлботки экспериментальных данных
применяли пакет программ "Statgraf" (Statistical Graphics Company, США) для ПЭВМ IBM PC/XT.
2. Гидролиз алкансульфонилхлоридов
Константы скорости мелочного гидролиза алкансульфонилхлоридов при 25 С приведены в Табл. 1. Как видно, наибольшей скоростью гидролизуется метансульфонилхлорид и наименьшей изопропансульфонилхлорид. Варьирование более удаленных частей алкильных групп не оказывает существенного влияния на реакционную способность сульфонилхлоридов. Наблюдаемые различия в реакционной способности обусловлены изменениями в энтропии активаций (Рис. 1).
Таблица 1. Константы скорости щелочного гидролиза алкансульфонилхлоридов RS02C1 при 25С
Nr R к И с .' Nr R
кон-м~1с"*
-
СН 3000+400 5 СН(СН3)2 83+3
-
С2Н5 405+8 6 СН2СН(СН3)2 255+14
-
С3Н? 330+4 7 (СН2)2СН(СН3)2 274+20
-
СЛН„ 330 + 3
4 9 —
2. Реакция сульфонилирования аиетилхолинзстеразы
Увеличение длины неразветвленной углеводородной .группы алкансульфонилхлоридов уменьшает константы скорости ингибиро-вания нативного фермента. Это указывает на взаимодействие алкильных групп алкансульфонилхлоридов с этим участком поаерхности фермента, где располагается ацильная часть ацетатов при субстратной реакции. Дополнительный дестабилизирующий вклад изоалкильных групп уменьшается при удалений участка разветвления от сульфонилхлоридной группы (Табл. 2). Суаествование дестабилизирующих взаимодействий между алкиль-ными группами алкансульфонилхлоридов и активной поверхностью фермента выражается также в увеличений энтальпии активации в случае менее реакционноспособных соединений (Рис. 2).
Эффекты ионов тетраалкиламмония на скорость реакции ингибирования ацетилхолинэстеразы алкансульфонилхлоридами достигают насыщения при повышении их концентрации. Рассчитанные по этим зависимостям константы диссоциации комплексов
Рис. 1 Зависимость констант скорости щелочного гидролиза алкансульфонилхлоридов RS0.C1 от температуры. R=CH, (О),
). И-С3Н? (Д), И-С Нд (А), И-С5Н11 (+) При 25 С.
.4-.103
с4н9 (О),
Рис. 2 Зависимость бимолекулярной константы скорости ингибирования ацетилхолинэстеразы с алкансульфонилхяоридами RSO С1 от температуры. R=CH3 (О), С2Н5 (О), С3Н7
(Q)
и-с3н7 а,
и-с4нд (А). и-с5н1і (+),
L.io"
Таблица 2.
Константы скорости реакции алкансульфонилхлоридов RSO С1 с нативной ацетилхолинэстеразой при 25С
Nr R
kIIM_lc*1
Nr
к^м-Vi-
фермента с ионами тетраалкиламмония совпадают с константами ингибированин гидролиза ацетилхолина этими же лигандами. Это свидетельствует о том, что влияние ионов тетраалкиламмония на скорость алкансульфонилирования фермента связано их взаимодействием с анионном центром фермента.
Наибольший эффект ускорения реакции сулфонилирования обнаружили в случае ионов тетраэтиламмония (Рис. 3). С другой стороны, реакций метан- и этансульфонилхлоридов ускоряются больре, чем реакций пропан- и бутансульфонилхлоридов (Рис. 4).
Рис.
Влияние ионов
тетраалкиламмония (cnH2n+1)4N+ на скорость реакции ацетилхолинэс-теразы с алкансульфонил-хлоридами RSO CI R=CH (О), с2н5 (), с3н7 (),
С4Нд (В) при 25С.
Рис. 4 Зависимость константы скорости ингибированин ацетил-холинэстеразы при 25 С от длины алкильной группы алкансульфонилхлорилов
CnH2n+lS02C1
присутствии ионов тетраалкиламмония
R=CH3 (О), С2К5 (),
с3н7 (О), с4нд (в
Модификация анионнонго центра ацетилхолинэстеразы ионом Г1,Л-диметил-2-фенилазиридиния ускоряет больше всего реакцию фермента с этансульфонилхлоридом {Рис. 5). При этом проявляется аналогия с влиянием тетрапропил- и тетрабутиламмоние-вых ионов на скорость сульфонилирования ацетилхолинэстеразы (см. Рис.3). Следовательно, влияние катионных соединений на скорость этой реакции зависит от их объема.
Рис. 5. Изменение скорости реакции ингибиро-вания ацетилхолинэстеразы с н-алкансульфонилхлори-
дами cnH2n+is02C1 при 25с в результате модифицирования анионного центра с ионом N,N-диметил-2-фенил-азиридиния.
3. Фосфорилирование модифицированного фермента
Бимолекулярная константа скорости реакции химически модифицированной ацетилхолинэстеразы с 0,0-яиэтил-тиоалкил-фосфатами не зависит от гидрофобности уходящей группы SR и имеет среднее значение 0.12+0.02 М- с (Табл. 3). Это указывает на существенные изменения в активном центре фермента и на отсутствие взаимодействий уходящей группы фосфорорганических ингибиторов с гидрофобной поверхностью модифицированного фермента. По литературным данным можно сказать, что наличие таких взаимодействий является характерной для нативного фермента, где зависимость бимолекулярной константы скорости ингибирования описывается уравнением:
log (k.. )=-1.2 + 0.6-п . (1)
Так как логарифм среднего значения бимолекулярной константы скорости ингибирования модифицированной ацетилхолинэстеразы совпадает с константном членом уравнения (1), можно сделать вывод, что взаимодействия фермента с кислотной частью 0,0-диэтилтиоалкилфосфатов не изменились значительно в результате. реакции модифицирования и,и-диметил-2-фенилазиридинием.
2*
Таблица 3. Бимолекулярные константы скорости ингибйрования химически модифицированной ацетилхолинэстеразы фосфорорганическими соединениями ;СН,СН 0)_P(0)SR при 25С.
Nr R kj М_1с_а Nr R kj M-1c-1
вещества недостаточно растворимые
4. Реакция модифицированной ацетилхолинэстеразы со сложно-эфирными субстратами
Скорость реакции гидролиза неионных сложноэфирных субстратов с химически модифицированной ацетилхолинэстеразой описывается уравнением Михаэлиса-Ментен: k t.[E].[S]
Km + [S]
где к . - каталитическая константа, К - константа Михаели-
cat m
са, [Е] и [S] - концентрации фермента и субстрата. Это позволяет анализировать полученные константы к и К (Табл. 4) в соответствии с общепринятой схемой действия ацетилхолинэстеразы (3) ,
KS к2 кз
E+S =3= ES ^-— ЕА —=- Е+Р . (3)
Р1 В отличии от нативнои ацетилхолинэстеразы, где максимальная
скорость гидролиза неионных сложноэфирных субстратов лимитирована стадией ацилирования и значение log(к .) описывается уравнением:
log(kcat) = log(kcat) + f>*- о* +f п . (4) В случае модифицированного фермента, однако, log(k t) не зависит от гидрофобности (Рис. б) и от электроотрицательности (Рис. 7) уходящей группы""субстрата, как можно подемонстрировать с помощью уравнения:
dlog(kcat)=log(kcat) -f.n = log(kcat) + о*, о* . (5) В соответствии со схемой (3) это значит, что в случае модифицированного фермента максимальная скорость гидролиза неионных сложных эфиров лимитирована стадией деацилирования (k >>к„).
Рис. 6 Зависимость log(k .) гидролиза соединений 1-9 из Табл. нативной (о) (Ярв и пр,, 1976) и химически модифицированной (в) ацетилхо-линэстеразами от гидрофобности уходящей группы субстратов.
&2
1«
Рис.
Зависимость
dlog(k . ) гидролиза соединений 1-3 и ю-13 из Табл. \А нативной (в) (Ярв и др., 1976) и химически модифицированной (О) ацетилхолинэстеразами от электронегативности уходящей группы субстратов.
В условиях к >>1с и при постоянстве к- в рамках реакционной серии константа Михаэлиса является функцией К и k .
(б)
lim К = lim К
к2>>к3 к2>>к3 % + к3
В связи с этим можно ожидать, что рК модифицированного фермента кроме гидрофобности (п) зависит также от электро-отрицательности (о ) уходящих групп субстратов в соответствии с уравнением:
Р. п
(7)
РК„
Рк„
+ ?
где б и -f- коэффициенты интенсивности гидрофобного и индукционного взаимодействий, соответственно.
Таблица 4. Кинетические константы гидролиза сложноэфирных субстратов СН C(0)OR с химически модифицированной ацетилхолинэстеразой
Зависимость pK от п для соединений 1-9, для которых
* m
о =0, представлена на Рис. 8 вместе с данными для нативного
фермента по данным литературы.
S 2
Рис. 8 Зависимость рК от гидрофобности уходящей группы для соединений 1-9 из Табл. 4 для нативного (О) и химически модифицированного (О) ферментов.
Как видно, химическое модифицирование анионного центра приводит к уменьшению К . Изменяется также взаимодействие фермента с более удаленными частями уходящих групп субстратов и значение п=2 является в обеих случаях "критическим", так как
при п>2 значение ч> уменьшается. Кроме того, модифицированный фермент не способен различить линейные и разветвленные группы в случае соединений с п >2. В связи с этим можно сказать, что включение иона ІІ,ІІ-диметил-2-фенилазиридиния в анионный центр ацетилхолинэстеразы затрагивает взаимодействие более удаленных частей уходящих групп субстратов с поверхностью фермента. Корреляционный анализ по уравнению (4) для субстратов 1-4 и 10-12, у которых п<2, привел к следующим результатам: рК =-0.5+0.4, р =3.0+0.5 и f=l-5+0.3 R=0.81 SQ=0.3.
Зависимость рК от электронегативности уходящей группы m
является особенностью модифицированного фермента, так как в случае нативной ацетилхолинэстеразы о =0.
(6)
Бимолекулярная константа скорости к1Т является единственным параметром который не зависит от скорость-лимитируюыей стадии реакции (3), к„
Это позволяет прямо сравнить каталитические свойства нативной и химически модифицированной ацетилхолинэстераз с помощью корреляционного уравнения:
log(kII) = log(kI:r)0 + р*. 6* +f-n (7)
Зависимость log(k_ ) от гидрофобности дли соединении 1-9 из таблицы 4 приведена на Рис. 9. Общий вид этой зависимости совпадает с результатами для рК на Рис. 7. Корреляционный анализ в соответствии с уравнением (7) для соединении 1-3 и 10-12, у которых п<2,
Рис. 9 Зависимость log(krT) от гидрофобности уходящей группы для соединений 1-9 из Табл. 4 для нативного' (данные из Ярв и др. 1976)(О) И ' химически модифицированного (О) ферментов.
'>
/W
,
привел к следующим результатам: log(kII)o=g „ Q ,
* Л
р =3.4+0.6 И 4^=1.4+0.2, R=0.93, S =0.27. Как ВИДНО, ЭТИ
результаты совпадают с соответствующими параметрами для рК .
Это является следствием того, что оба эти параметра зависят
от тех же элементарных констант К и к„.
4. Влияние химической модификаций анионного центра ацетил-холинэстеразы на элементарные стадий катализа
Как было отмечено выше, бимолекулярная константа скорости ктт не зависит от скорость-лимитирующей стадии катализа. При сравнивании значении р и-^в уравнении (6) со соответствующими значениями р =3 и ^=1.5 (Ярв и др. 1976) для нативного фермента видно, что они совпадают в пределах точности их определения. Единственное различие обнаруживается в значении logtkjj.)0, которое увеличивается при модифицировании фермента от 1.6 до 3.5. Следовательно, специфичность фермента относительно неионных уходящих групп субстрата не меняется в результате модифицирования анионного центра.
Коэффициент гидрофобного взаимодействия -Р в случае нативного фермента является суммой коэффициентов -Р и -Р. для стадий связывания и ацилирования,
?=fa+fb- »>
так как для этих стадий соблюдаются следующие уравнения:
PKs = pKs + fa' п , (8)
log(k2) = log(k2) +ffa- n + o*-rf*. (9)
Поскольку параметр К является комбинацией К , к- и к ,
получим из (8) и (9):
РКга = РКш + Г^ + (fa+fb)>n (10) Последнее уравнение предоставляет возможность понимания
зависимости рК от структуры субстратов в случае модифицированного фермента, где чувствительность к гидрофобному эффекту дважды превышает "fa=<s яля нативного фермента. Предполагая, что в случае модифицированного фермента также соблюдяются соотношения (8) и (9), чувствительность рК относительно гидрофобного взаимодействия является суммой соответствующих вкладов на стадиях связывания и ацилирования. На основе вышеприведенных результатов естественно предположить, что значения -Р и -Р. не изменились в результате модифицирования фермента, так как их сумма осталась постоянной. К сожалению, в случае модифицированного фермента невозможно определить значения констант к? и К , что не допускает прямой проверки
этого предположения.
Если химическая модификация анионного центра ацетил-холинэстеразы не изменила чувствительности этого фермента относительно структуре уходящих групп сложноэфирных субстратов на стадиях связывания и ацилирования, ускорение их ацетилхолинэстеразного гидролиза в бимолекулярных условиях реакции связано взаимодействиями только ацильной части субстратов с активной поверхностью фермента.
На основе полученных результатов можно сделать ряд выводов о влиянии химической модификации фермента на элементарные стадии гидролиза перечисленных в таблице 4 ацетатов.
Скорость стадии деацетилирования ацетилхолинэстеразы не
изменилась при афинном модифицировании акионного центра, так
4 -1 как конста.чта к =10 с для модифицированного фермента имеет
такое же значение как к. для нативного фермента.
Скорость стадии ацетилирования ацетилхолинэстеразы
увеличивается в результате химического модифицирования
анионного центра фермента не менее чем в 100 раз, поскольку
для всех субстратов должно соблюдаться условие к„>10000с и
в случае наименее активных субстратов значения к для
-і г нативного фермента не превышают 100 - 200 с
В условиях к >>к_ для стадии связывания субстрата
получим:
к2
К = К —-— и К >>К . (11)
s m , s m
К3 Из Рис.6, однако, видно, что значения К для модифицированного фермента и К для нативного фермента имеют весьма близкие значения. Следовательно, эффективность связывания неионного субстрата при модификации анионного центра ацетилхолинэстеразы не увеличивается, или даже несколько уменьшается .
На основе следующей трехцентровой модели, приведенной представленной в литературе для описания специфичности нативной ацетилхолинэстеразы в реакциях со сложноэфирными субстратами и необратимыми ингибиторами,
*^л; **&' '**{&
Ч Ч Ч
можно резюмировать эффекты химического модифицирования на строение эстеразного центра. Во-первых, связывающие свойства подцентра о,, где распологается уходящая группа ацетатов, остались практически неизменными в пределах участка, способного взаимодействовать с н-бутильной группой. Во-втоых, в подцентре о,, который взаимодействует с ацильной частью ацетатов и алкильнои группой алкансульфонилхлоридов, произошло конформационное изменение, в результате чего повышается эффектиЕ юсть связывания групп с тетраэдрической конфигурацией. Вс 'ретих, подцентра о , который в нативном ферменте взаимодей ггвует с уходящей группой фосфорорганических ингибиторов, в модифицированном ферменте не проявляется.
На основе представленной модели можно также объяснить отсутствие заметных изменений во взаимодействиях кислотной части изученных фосфорорганических ингибиторов в реакциях ингибирования модифицированной ацетилхолинэстеразы. Одна из этоксигрупп взаимодействует с этой частью подцентра о , связывающие свойства которой не изменились и другая с подцентром о. где эффекты на связывание более длинных групп были минимальные.
В итоге, в результате модификации анионного центра ацетилхолинэстеразы стабилизируется активированное состояние стадии ацилирования фермента, когда на стадии нековалентного связывания имеет место дяже некоторая дестабилизация фермент-субстратного комплекса. Это возможно, если ковалентная модификация анионного центра ацетилхолинэстеразы ионом N,N-диметил-2-фенилазиридиния приводит эстеразный центр фермента к конформации, которая является оптимальной для помещения групп с тетраэдрической конфигурацией у атома, взаимодействующего с гидроксильной группой каталитического остатка серина.
Последний вывод поддерживается данными ускорения реакции ацетилхолинэстеразы с алкансульфонилхлоридами, так как тетра-эдрическая конфигурация этих соединений очевидно в некоторой степени имитирует активированное состояние сложноэфирных субстратов на стадии ацилирования.
Вышеизложенный механизм очевидно используется в случае гидролиза ацетилхолина для увеличения скорости этой реакции в результате конформационного изменения, индуцированного в результате взаимодействия триметиламмониевой группы этого соединения с анионным центром фермента.
выводы
1. Реакционная способность алкансульфонилхлоридов RS02C1 в
реакции мелочного гидролиза определяется стерическими
свойствами заместителя R (R=CH„, С„Н_, н-С,Н_, н-СдН„, изо-
3 Z о 3 7 4 9
С3Н?, ИЗО-С4Нд, ИЗО-CgHjj).
-
Реакционная способность алкансульфонилхлоридов RSO СІ в реакций ингибирования ацетилхолинэстеразы определяется взаимодействием с тем же участком эстеразного центра фермента, который является и участком локализации ацильной части сложных эфиров в субстратной реакции.
-
Ионы н-тетраалкиламмония (С Н_ ,,).N (п=1-4) в резуль-
П *:П+1 4
тате ускорения реакций соединений с короткой алкильной частью, увеличивают специфичность ацетилхолинэстеразы относительно н-алкансульфонилхлоридов.
-
Ковалентное связывание иона Н,1Г-диметил-2-фенилазириди-ния в анионный центр ацетилхолинэстеразы оказывает качественно такое же влияние, как и обратимое связывание тетраалкилам-мониевых ионов.
-
Химическая модификация анионного центра ацетилхолинэстеразы ионом Г1,и-диметил-2-фенилазиридиния приводит к увеличению константы скорости стадии ацилирования не менее, чем в сто раз. Константа связывания субстрата не изменилась или даже увеличилась, константа скорости стадии' деацилирова-ния осталась неизменной.
-
Предложен механизм действия активного центра ацетилхолинэстеразы, предполагающий, что связывание катионной триметиламмониевой части уходящей группы ацетилхолина в анионном центре фермента индуцирует в эстеразном центре конформационное изменение, приводящее к стабилизированию активированного комплекса стадии ацилирования в результате уменьрения стерических препятствий к ацильной части субстрата
-
При анализе корреляционных зависимостей структура-активность необходимо иметь в виду возможности появления отклонений от аддитивности в результате синергизма факторов взаимодействия лиганда с центром связывания.
8 Полученные результаты указывают на принципиальную возможность изменения специфичности ферментов путём ковалентного связывания аналогов обратимых лигандов с центрами регуляции.
![2-(N-фталоил)-N, N, N', N'-тетраметилвинамидиния перхлорат и бис-[1-гидрокси-(4,6-ди-трет-бутил-фенил)]амин как синтоны для получения гетероциклических соединений](/i/i/4486/48519.png "2-(N-фталоил)-N, N, N', N'-тетраметилвинамидиния перхлорат и бис-[1-гидрокси-(4,6-ди-трет-бутил-фенил)]амин как синтоны для получения гетероциклических соединений Валиуллин Василь Акрамович")
